BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO
TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI
NGUYỄN THỊ VÂN ANH
NGHIÊN CỨU SỰ BIỂU HIỆN PROTEIN NUCLEOCAPSID
CỦA VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ
HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E. COLI
LUẬN VĂN THẠC SĨ
HÔ HẤP Ở LỢN TRÊN VI KHUẨN E. COLI CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
MÃ SỐ : 60.42.02.01
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
1. TS. NGUYỄN THỊ MINH HUYỀN
2. TS. NGUYỄN HỮU ðỨC
Hµ Néi - 2013
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
ii
LỜI CAM ðOAN
Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của tôi. Các số liệu và kết quả
nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược công bố trong bất kì công trình
nghiên cứu nào khác.
Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ
rõ nguồn gốc.
lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam cùng toàn thể cán bộ nghiên cứu trong phòng
ñã ñã tận tình giúp ñỡ tôi trong suốt thời gian nghiên cứu hoàn thành luận văn.
Tôi xin cảm ơn các Thầy Cô trong khoa Công nghệ sinh học, Trường ðại
học Nông nghiệp Hà Nội ñã truyền ñạt cho tôi kiến thức trong quá trình học tập.
ðể thực hiện ñược nghiên cứu này, tôi xin chân thành cảm ơn sự tài trợ từ ñề
tài cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam hướng Công nghệ sinh học
với mã số ñề tài VAST02.02/12-13.
Cuối cùng, cho phép tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới gia ñình, bạn bè ñã
luôn quan tâm, cổ vũ cho tôi vững bước trên con ñường học tập và nghiên cứu.
Hà Nội, tháng 9 năm 2013
Tác giả luận văn
Nguyễn Thị Vân Anh
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
iv
MỤC LỤC
Lời cam ñoan ii
Lời cảm ơn iii
Mục lục iv
Danh mục bảng vii
Danh mục hình viii
3.1.2 Mồi 29
3.1.3 Hóa chất 29
3.1.4 Kháng sinh và các môi trường sử dụng 29
3.1.5 ðệm và dung dịch 30
3.2 Phương pháp nghiên cứu 30
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
v
3.2.1 Tạo vector biểu hiện 30
3.2.2 Khảo sát ñiều kiện biểu hiện gen ORF7 mã hóa protein N của vi
rút PRRS 36
3.2.3 Phương pháp kiểm tra ñộ hòa tan của protein N và tối ưu hóa
ñiều kiện biểu hiện của protein N 38
3.2.4 Phương pháp tinh sạch protein N tái tổ hợp (Hochuli và cs, 1988) 39
3.2.5 Phương pháp ELISA (Rosalyn Yalow, 1971) 40
PHẦN 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 41
4.1 Kết quả tạo và chọn lọc vector tái tổ hợp mang ñoạn gen ORF7 41
vi
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ARN Acid ribonucleic
ATP Acid adenosin triphosphat
bp Base pair (cặp base nitơ)
CBB Coomasie Brilliant Blue
dNTP Deoxyribonucleotide
DBB Denaturing binding buffer
DNA Acid Deoxyribo Nucleic
DWB Denaturing wash buffer
E. coli Escherichia coli
ELISA Enzyme Linker Immuno Sorbent Assay
EDTA Ethylendiamin Tetraacetic Acid
EtBr Ethidium Bromide
GB1 G protein Domain B1
GST Glutathione-S -Transferase
IPMA
Immunoperoxidase Monolayer Assay
IPTG Isopropyl β- D- 1- Thiogalactopyranoside
kDa Kilo Dalton
LB Luria Broth
MVL Modified live virus
MBP Maltose Binding Protein
OD Optical Dentisy
ORF Open Reading Frame
PCR Polymerase Chain Reaction
PRRS Porcine Reproductive And Respiratoy Syndrome
TBS Tris-buffered saline
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
viii
DANH MỤC HÌNH
STT Tên hình Trang
2.1 Hình ảnh ñại thực bào khi bị PRRS xâm nhập 3
2.2 Hình ảnh ñại thực bào chưa bị PRRS xâm nhập 3
2.3 Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS 6
2.4 Sơ ñồ Sự hình thành cầu nối disuldide trong chu chất ở E. coli
.
22
2.5 Sơ ñồ quá trình cắt protein fusion ra khỏi protein mục tiêu 27
2.6 Sơ ñồ cơ chế ñiều hòa của T7 promotor 28
4.1 Sơ ñồ tạo vector tái tổ hợp 41
4.2 ðiện di ñồ sản phẩm PCR với cặp mồi MHF/R 42
4.3 ðiện di ñồ kết quả cắt mở vòng 5 vector biểu hiện 43
4.4 ðĩa khuẩn lạc biến nạp sản phẩm lai giữa ñoạn gen ORF7 và các
vector biểu hiện vào tế bào khả biến E. coli DH
5α.
ñàn lợn nhập từ Mỹ. Gần ñây các ổ dịch xảy ra tại Thụy ðiển, Nam Phi, Nga, Trung
Quốc và Việt Nam với chủng ñộc lực cao, diễn biến ngày càng phức tạp. Năm 2007,
dịch PRRS chính thức ñược công bố tại tỉnh Hải Dương của nước ta và từ ñó ñến
nay dịch vẫn liên tục xảy ra ở nhiều ñịa phương trên cả nước. Chính vì vậy việc
chẩn ñoán sớm các ổ dịch là vấn ñề quan trọng giúp ngăn cản sự biến chủng và sự
lan truyền của vi rút PRRS.
Vi rút PRRS ñược phân lập và ñịnh danh vào năm 1991, chuỗi hệ gen ñầy ñủ
ñược xác lập vào năm 1993. Bộ gen của vi rút PRRS dài khoảng 15kbp bao gồm 9
ORF (Open Reading Frame), trong ñó ORF1a và ORF1b mã hóa protein
polymerase (GP1a và GP1b), ORF2a, ORF2b, ORF3 và ORF4 mã hóa các protein
chức năng. ORF5 mã hóa protein GP5 (25kDa) là glycoprotein vỏ ngoài, ORF6 mã
hóa protein M (18kDa) là protein vỏ ngoài, ORF7 mã hóa protein N (15kDa) là
protein cấu trúc (Dea và cs, 2000; Mengeling W.L và cs, 1996; Yoon K.J và cs,
1995). Trong 3 protein cấu trúc thì protein N (15kDa) là protein cơ bản nhất ñược
phát hiện với lượng lớn trong các tế bào bị nhiễm, chiếm khoảng 20 – 40% lượng
protein có trong hạt vi rút (Mengeling W.L và cs, 1996) và protein N là protein gây
ñáp ứng kháng thể sớm nhất (Plana-Duran J và cs, 1997), hầu hết những xét nghiệm
chẩn ñoán bệnh PRRS chủ yếu là phát hiện kháng thể kháng lại protein này (Meteu
E và cs, 2008).
Hiện nay, việc chẩn ñoán sớm hội chứng PRRS thường sử dụng Kit ELISA
HerdCheck 2XR (IDEXX) của Mỹ, ñây ñược coi là tiêu chuẩn vàng ñể phát hiện
kháng thể kháng vi rút PRRS có ñộ nhạy cao, ñặc hiệu và nhanh chóng. Phương
pháp này có thể phát hiện ñược kháng thể kháng vi rút PRRS trên lợn sau 9 ngày
nhiễm , tuy nhiên Kit ELISA này có giá thành khá ñắt. Ở nước ta việc chẩn ñoán
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
2
sớm hội chứng PRRS cũng ñang sử dụng Kit này. Với mong muốn tạo ra sản phẩm
xác ñịnh nhanh PRRS với giá thành phù hợp ở Việt Nam, chúng tôi tiến hành ñề tài:
“Nghiên cứu sự biểu hiện protein Nucleocapsid của vi rút gây hội chứng rối
cao, nhiệt ñộ thấp và tốc ñộ gió mạnh. Ngoài ra, các loài côn trùng như muỗi, ruồi
và vịt trời… cũng có thể là trung gian truyền bệnh. Một ñặc trưng của Arteriviruses
là chúng sao bản sơ cấp, chúng sinh sản trong tế bào chất quanh nhân của các tế bào
chủ. Những virion mới ñược giải phóng bởi exocytosis từ bề mặt của tế bào. Tế bào
ñích sơ cấp của vi rút là ñại thực bào túi phôi của lợn, vi rút rất thích hoạt ñộng ở
vùng phổi.
Hình 2.1. Hình ảnh ñại thực bào khi
bị PRRS xâm nhập
Hình 2.2. Hình ảnh ñại thực bào chưa
bị PRRS xâm nhập
(Nguồn: />infectedMacrophage.jpg)
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
4
Bình thường, ñại thực bào sẽ tiêu diệt tất cả vi khuẩn, vi rút xâm nhập vào cơ
thể nhưng riêng ñối với vi rút PRRS nó không những không bị tiêu diệt mà còn có
thể nhân lên trong ñại thực bào, sau ñó phá huỷ và giết chết ñại thực bào.
Vi rút PRRS có một ái lực ñặc biệt với ñại thực bào, ñặc biệt là ñại thực bào ở
phổi, ñại thực bào này còn gọi là ñại thực bào phế nang. Chúng có tác dụng tiêu hoá
và loại bỏ các vi khuẩn và vi rút xâm nhập vào phổi, ngoại trừ trường hợp vi rút
PRRS. Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ
thống bảo vệ cơ thể và khiến cho các vi khuẩn và vi rút khác có cơ hội phát triển và
gây bệnh. Sau khi xâm nhập vào tế bào ñại thực bào, chúng nhân lên và phá huỷ rất
nhanh tế bào. Lúc ñầu vi rút PRRS kích thích các tế bào này, nhưng sau 2 hoặc 3
ngày vi rút sẽ giết chết chúng, các virion ñược giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang
các tế bào khác. Ở giai ñoạn ñầu quá trình xâm nhiễm do vi rút PRRS dường như
hiệu giá kháng thể kháng lại các loại vi rút và vi khuẩn khác không liên quan trong cơ
thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của ñại thực bào trong hệ thống miễn dịch. ðiều
Meng X. J và cs, 1995a; Meng X. J và cs, 1995b; Murtaugh M. P và cs, 2002).
Và ngay trong cùng một kiểu gen, mức ñộ khác biệt di truyền cao giữa các
chủng vi rút thực ñịa (field vi rút) ñang lưu hành tại các vùng ñịa lý cũng ñược xác
nhận. ðiều này do ñặc tính biến ñổi di truyền cao của các chủng vi rút giúp nó trốn
tránh ñược ñáp ứng miễn dịch của vật chủ. Gần ñây dịch bệnh xảy ra tại một số
nước cho thấy sự biến ñổi của chủng NA tại một số nước châu Á như Trung Quốc,
Việt Nam cho thấy ñộc lực vi rút ñã có thay ñổi ñáng kể thể hiện ở việc dịch bệnh
xảy ra với tỷ lệ lợn chết cao (Feng Y và cs, 2008).
Hiện nay có 2 kiểu gen của vi rút PRRS chính ñược công nhận là Châu Âu
(Nhóm I) có tên gọi là Lelystad và Bắc Mỹ (Nhóm II) có tên gọi là VR2332. Khi so
sánh về di truyền ñã thấy sự khác nhau rõ rệt (khoảng 40%) giữa 2 kiểu gen này. Ở
Châu Á và Nam Mỹ người ta ñã phân lập ñược cả 2 kiểu gen, trong mỗi kiểu gen
các chủng khác nhau có mức ñộ tương ñồng khác nhau.
Châu Á dịch ñã xuất hiện từ rất sớm ngay từ năm 1989 tại Nhật Bản. Tại châu
Âu bệnh bắt ñầu xuất hiện năm 1990 ở ðức, sau ñó lan ra rộng khắp toàn bộ châu
Âu. Bệnh xuất hiện lúc ñầu với rất nhiều tên gọi khác nhau như bệnh thần bí ở lợn,
bệnh lợn PRRS, hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn, bệnh Heko – Heko, Hội chứng
sảy thai và bệnh ñường hô hấp (Porcine epidemic abortion and respiratory
syndrome). ðến năm 1991 khi bệnh lây lan ra nhiều nước trên thế giới với triệu
chứng hô hấp và sinh sản ñặc trưng, nên tại uỷ ban Châu Âu ñã có tên chính thức là
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
6
“Porcine reproductive and respiratory syndrome” - viết tắt là PRRS. Năm 1992 Tổ
chức thú y thế giới công nhận tên PRRS như một tên gọi quốc tế cho bệnh này.
Ngày nay tên PRRS ñã ñược sử dụng rộng rãi. Hình 2.3. Sơ ñồ hệ gen của vi rút PRRS
(Nguồn: virus-structure)
gọi PRRS, cũng như cung cấp cho ñộc giả một bảng danh sách tên gọi trước khi
có tên PRRS.
Từ năm 2000 ñến 2003, R Thanawongnuwech và cs ñã tiến hành một
nghiên cứu quy mô rộng lớn tại Thái Lan và ñưa ra kết quả PRRSV từ 137 mẫu
phân lập từ nhiều ñiạ phương thuộc nước này gồm cả chủng dòng Châu Âu và
dòng Bắc Mỹ. Trong ñó, vi rút thuộc chủng dòng Bắc Mỹ chiếm 33,58%, dòng
Châu Âu chiếm 66,42%.
Indik và cs (2005) ñã ñưa ra bằng chứng về sự có mặt của chủng PRRSV
dòng Bắc Mỹ ở Áo ở mức ñộ phân tử. Không giống như nhiều nước khác, chủng
vaccine dòng Bắc Mỹ chưa ñược phép nhập vào Áo, vì thế lý do duy nhất ñể giải
thích sự có mặt của chủng vi rút PRRS dòng Bắc Mỹ ở Áo là do việc nhập lợn ñã
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
8
ñược tiêm vaccine chủng vi rút Bắc Mỹ. Nghiên cứu ngày nhấn mạnh tầm quan
trọng của các phân tích chi tiết trình tự gen của các biến thể di truyền vi rút PRRS
ñang lưu hành ở từng khu vực.
Jun Han và cs (2006) ñã khẳng ñịnh về mặt di truyền học và tính kháng
nguyên hai loại vi rút Lelystad và VR- 2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất
phát từ một tổ tiên thì chúng ñược tiến hoá theo hai hướng khác nhau. Hai vi rút này
ñã trở thành hai dòng vi rút nguyên mẫu, dòng Châu Âu (vi rút Lelystad) và dòng
Bắc Mỹ (VR2332).
Tại Trung Quốc, một căn bệnh bí hiểm ñã xảy ra còn ñược gọi là bệnh sốt
cao vào năm 2006 và người ta thấy có dấu hiệu của PRRS. Căn bệnh này ñã lan
rộng ra hơn 10 tỉnh và tấn công 2.000.000 lợn, gây chết 400.000 lợn. Không giống
với PRRS ñiển hình, căn bệnh bí hiểm này xảy nhiều trên lợn lớn với dấu hiệu sốt
cao, và một số triệu chứng như dịch tả lợn. Khi phân tích hệ gen, người ta thấy các
vi rút PRRS phân lập ñược thuộc nhóm II và tương ñồng rất cao với chủng HB-1,
một chủng PRRS của Trung quốc (96,5%).
Vi rút PRRS có thể tiêu diệt tới 40% ñại thực bào làm phá huỷ phần lớn hệ
nucleotide các dòng vi rút PRRS ñại diện ñang lưu hành cho thấy ña hình di truyền
lớn trong trình tự ORF5 và ORF7, và cây phả hệ di truyền cũng bộc lộ khác biệt di
truyền lớn giữa các chủng vi rút nghiên cứu . Kết quả này phù hợp với nghiên cứu
trước ñây của Stadejek và cs vào năm 2002 khi phân tích các vùng biến ñổi trong
trình tự axit amin của ORF5 và ORF7.
Amonsnin và cs (2009) ñã phân tích trình tự nucleotide toàn bộ hệ gen của
chủng PRRSV thu từ ñợt dịch bệnh năm 2001 tại Thái Lan. Kết quả cho thấy kích
thước phân tử của hệ gen chủng PRRSV dòng châu Âu (EU) và dòng Bắc Mỹ (NA)
tương ứng là 14934 và 15412 nucleotide. Cũng giống như các nhà nghiên cứu trước
ñây về cấu trúc hệ gen PRRSV, hệ gen của vi rút PRRS Thái bao gồm: 2 vùng
không phiên mã (ñầu 5’- và ñuôi 3’-), 8 ORF, trong ñó 2 gen không cấu trúc là
ORF1a và ORF1b (Nsp – Nonstructure protein) và ORF2 – 7 là các gen mã hoá
protein cấu trúc. Dựa trên trình tự hệ gen, cây phả hệ di truyền cho thấy trong 2
chủng PRRSV thì một thuộc về dòng châu Âu và một thuộc về dòng Bắc Mỹ. So
sánh trình tự toàn bộ hệ gen của 2 chủng vi rút PRRS phân lập tại Thái Lan với các
chủng có nguồn gốc châu Âu, Bắc Mỹ cung cấp thông tin quý giá cho việc ñánh giá
mức ñộ biến ñổi di truyền và tiến hoá phân tử của các chủng này, cụ thể là: chủng vi
rút 0INPI ñược cho là có nguồn gốc từ vaccine nhưng tại thời ñiểm năm 2001 thì
vaccine US – MVL (Modified Live Virus) chưa có mặt tại thị trường Thái Lan, vì
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
10
thế lý do của việc lưu hành chủng vi rút 0INP1 có thể là do sự có mặt của PRRSV
trong lợn giống hoặc tinh trùng nhập khẩu từ Mỹ.
Gonin và cs (2009) ñã giải trình tự nucleotide GP5 của vi rút PPRS phân lập
tại Hàn Quốc năm 2007 – 2008. Kết quả cho thấy sự khác biệt di truyền tương ñối
cao (1,3 – 12,9%) giữa chủng vi rút ñang lưu hành so với chủng vi rút cải vaccine
(Modified live virus). Cây phân loại di truyền cũng cho thấy biến ñổi di truyền giữa
các chủng tăng theo thời gian từ 1997 – 2008. Vì thế tác giả khuyến cáo cần có ñề
xuất trong việc lựa chọn loại vaccine thích hợp hơn nhằm khống chế bệnh PRRS
phát triển, tiến hóa của mình PRRSV ORF5 ñã ñạt tới sự khác biệt trung bình về
mặt di truyền là 12,5% với khoảng cách các cặp lớn nhất là 27,8%. Shi và cs,
(2010) ñã khuyến cáo sự phát triển nhanh chóng như vậy có thể gây ra những
khó khăn trong chẩn ñoán vi rút và hiệu quả của vắc-xin và vì vậy các công
trình nghiên cứu tốc ñộ phát triển của vi rút, giải trình tự của các mẫu nên ñược
tiến hành thường xuyên.
2.1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước
Cho ñến nay ở Việt Nam chưa có nhiều nghiên cứu về Hội chứng rối loạn và
sinh sản ở lợn, ñặc biệt là nghiên cứu sâu về mầm bệnh, tính chất kháng nguyên
cũng như ñộc lực của vi rút gây bệnh. Việc ñiều tra sự lưu hành của vi rút PRRS
cũng chưa ñược tiến hành một cách rộng rãi.
Năm 1997 Việt Nam nhập 51 lợn giống từ Mỹ khi kiểm tra có 10/ 51 con có
huyết thanh dương tính với PRRS. Từ năm 1997 ñến 2006 có rất nhiều tác giả trong
nước nghiên cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở ñiều tra, giám sát tỷ lệ
lưu hành huyết thanh.
Từ năm 1999 – 2002 một số nhà khoa học Nhật Bản kết hợp với Trường ðại
học Cần Thơ cũng ñã tiến hành ñiều tra một số trường hợp bệnh ở lợn có hiện tượng
lợn con chết và lợn nái sảy thai và ñiều trị kháng sinh không hiệu quả. Trong nghiên
cứu này, người ta ñiều tra một số nguyên nhân gây bệnh trong ñó có hội chứng rối
loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. ðiều tra ñược tiến hành ở các ñàn lợn gia ñình, một
số trại giống của Nhà nước và một số lò mổ. Các nhà khoa học ñã phát hiện thấy
kháng thể PRRS trong huyết thanh ở các ñàn lợn nuôi gia ñình và có tỷ lệ lưu hành
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
12
cao ở các trại lợn của Nhà nước cùng với hiện tượng tỷ lệ lợn con chết cao. Ngoài
ra, cũng phát hiện thấy vi rút giả dại và vi rút Dịch tả lợn.
Bắt ñầu từ tháng 3 năm 2007, khi các ổ dịch lâm sàng PRRS bùng nổ thì
việc nghiên cứu về bệnh ở Việt Nam mới ñược triển khai toàn diện trên cả nước
dưới nhiều hình thức cả về dịch tễ học và các biện pháp chẩn ñoán xét nghiệm,
Phạm Ngọc Thạch và cs (2007) nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng và chỉ
tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên ñã cho thấy, khi lợn mắc
PRRS tần số hô hấp, tim mạch, thân nhiệt ñều cao hơn sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh
lý, sinh hoá máu thay ñổi ñặc biệt là số lượng bạch cầu, ñộ dự trữ kiềm trong máu tăng
cao. Trong khi hàm lượng protêin tổng số, hàm lượng ñường huyết lại giảm rõ rệt.
Lê Văn Năm (2007) khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích ñại thể
ở lợn mắc PRRS tại một số ñịa phương thuộc ðồng bằng Bắc Bộ- Việt Nam ñã thấy
rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích ñại thể của lợn mắc PRRS tương tự như
các tài liệu trong và ngoài nước công bố. Nhưng ñiểm khác ñó là tỷ lệ tiêu chảy, lạc
giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bón ở lợn lớn hơn.
Nguyễn Ngọc Hải và cs (2007) ñã sử dụng kỹ thuật RT- PCR ñể phát hiện vi
rút PRRS trong các mẫu huyết thanh, tinh dịch, mô của lợn có kết quả dương tính
và âm tính với kháng thể PRRS khi dùng phương pháp ELISA. Tác giả ñã không
ghi nhận ñược mối tương quan giữa sự liên hệ của kháng thể kháng PRRS và kết
quả dương tính với vi rút PRRS chẩn ñoán bằng kỹ thuật RT- PCR.
Tô Long Thành và cs (2008) ñã cho biết năm 2008 số lượng bệnh phẩm lợn
mắc PRRS gửi ñến Trung tâm chẩn ñoán thú y TW nhiều hơn năm 2007, khẳng
ñịnh những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS có sự bội nhiễm vi khuẩn.
Chủng vi rút ñộc lực cao của Việt Nam có sự tương ñồng về cấu trúc gen với
chủng vi rút ñộc lực cao của Trung Quốc ñến 99%. Khi sử dụng vi rút PRRS gây
bệnh tại Việt Nam tiêm cho lợn thí nghiệm lợn không chết, huyễn dịch bệnh phẩm
lấy tại ổ dịch của Việt Nam gây chết 100% lợn trong 72h. ðiều này cho thấy vai
trò của vi khuẩn bội nhiễm.
Trần Thị Bích Liên (2008) ñã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam
và thế giới cũng như những ñặc ñiểm cơ bản về PRRSV. ðặc biệt tác giả ñưa ra
Trường ðại Học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp
14
phương pháp chẩn ñoán PRRS như phân lập vi rút bằng phương pháp IPMA kết
hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể. Tác giả chỉ rõ ñể
rút PRRS tại một số tỉnh miền Nam Việt Nam cụ thể là ở Bà Rịa – Vũng Tàu.
ðiều này ñóng góp vào hiểu biết về dịch tễ học cũng như xu hướng biến ñổi di
truyền của các chủng vi rút PRRS tại thực ñịa và hiệu quả của việc sử dụng
vaccine hiện tại ở các tỉnh nói trên.
Võ Khánh Hưng và cộng sự (2012a) ñã phân tích và so sánh trình tự GP5 của
6 chủng vi rút PRRS phân lập tại Tp. HCM và ðồng Nai trong năm 2009 cho thấy
các chủng vi rút PRRS lưu hành tại ðồng Nai và Tp. HCM thuộc dòng châu Mỹ,
cùng nhóm với các chủng vi rút PRRS ñộc lực cao của Trung Quốc (98,5 – 99,7%),
và tương ñồng 87,9 – 88,6% so với chủng vaccine ñang khuyến cáo sử dụng tại Việt
Nam, BSL – PS100 của Bestam Singapo.
Nguyễn Ngọc Hải và cs (2012) ñã sử dụng kỹ thuật nested RT-PCR ñể xác
ñịnh kiểu gen của PRRSV nhiễm trên 46 mẫu bệnh phẩm thu ñược từ các trại chăn
nuôi lợn ở TP. Hồ Chí Minh, ðồng Nai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Bắc Giang và Hà Nội.
Kết quả ghi nhận PRRSV nhiễm trên ñàn lợn Việt Nam thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với
100% mẫu dương tính. Kiểu gen Châu Âu của PRRSV chỉ chiếm 2,18% (1/46 mẫu)
mẫu xét nghiệm.
Nguyễn Thị Lan và cộng sự (2012) khi chẩn ñoán bằng kỹ thuật bệnh lý cho
thấy các triệu chứng lâm sàng chủ yếu của lợn sau cai sữa mắc PRRS bao gồm: sốt,
bỏ ăn, khó thở, tím tái. Bệnh tích ñại thể tập trung chủ yếu ở phổi và hạch lâm ba
với hiện tượng viêm là phổ biến. Các biến ñổi vi thể phổ biến ở phổi với hiện tượng
thâm nhiễm tế bào viêm, các cơ quan khác như hạch, lạch, thận cũng xuất hiện các
tổn thương vi thể. Bằng kỹ thuật RT-PCR, ñã xác ñịnh ñược chính xác ñược lợn
sau cai sữa mắc PRRS.
Nguyễn ðức Hiền (2012) ñã nghiên cứu tình hình nhiễm PRRS trong ñàn lợn
ở Cần Thơ. Xét nghiệm cho thấy 290 mẫu huyết thanh heo chưa tiêm phòng vaccine
PRRS bằng phương pháp ELISA cho thấy tỷ lệ nhiễm PRRSV ở heo nuôi tại thành
phố Cần Thơ là 16,90%. Trong ñó, tỷ lệ nhiễm PRRS ở heo của những trại chăn
nuôi tập trung cao hơn heo nuôi ở các nông hộ (64,0 % so với 38,12%). Tỷ lệ
nhiễm PRRSV cao nhất ñược tìm thấy trên heo nái (69,57%), kế ñến trên heo con
(33,33%) và thấp nhất trên heo thịt (12,16%). Xét nghiệm 194 mẫu huyết thanh heo
dịch ở các nước láng giềng, cụ thể: nguồn bệnh có thể từ Trung Quốc vào Việt Nam
Copyright: Tài liệu đại học ©