ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN NGUYỄN HUỲNH PHƯƠNG UYÊN
NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ HÌNH THÁI TRÊN CÂY
ĐỊA LAN TÍM HỘT (CYMBIDIUM LA BELL “ANNA BELLE”)
IN VITRO BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ GAMMA
60
CO

Chuyên ngành: Di truyền học
Mã số chuyên ngành: 60 42 70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. LÊ QUANG LUÂN Tp. Hồ Chí Minh, Năm 2011

Hình 3.4. Sự hình thành protocorm cây Địa lan

ix

Hình 3.5. Ảnh hưởng của chất sự phối hợp BA (2mg/l) với NAA và TDZ lên hệ số
nhân PLB trên môi trường MS

Hình 3.6. Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên sự nhân chồi của cây Địa lan
Hình 3.7. Cụm chồi Địa lan được hình thành trên môi trường MS sau 4 tuần
Hình 3.8. Khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Địa lan trên các môi trường
Hình 3.9. Cây tái sinh Địa lan hoàn chỉnh
Hình 3.10. Quy trình nhân nhanh in vitro cây Địa lan Tím hột
Hình 3.11. Ảnh hưởng của bức xạ Gamma Co-60 lên các mẫu Địa lan in vitro
Hình 3.12. Mẫu PLB bị chết sau khi chiếu xạ liều cao
Hình 3.13. Các chồi đỉnh của PLB bị chết sau khi chiếu xạ liều thấp
Hình 3.14. Sự hình thành phôi của từ mẫu PLB địa lan sau khi chiếu xạ
Hình 3.15. Các dạng biến dị chlorophyll của cây Địa lan
Hình 3.16. Các dạng biến dị lá dài của cây Địa lan
Hình 3.17. Các dạng biến dị lá ngắn của cây Địa lan
Hình 3.18. Các dạng biến dị nhiều lá của cây Địa lan
Hình 3.19. Các dạng biến dị bẹ lá màu tím của cây Địa lan
Hình 3.20. Cây con chiếu xạ đang theo dõi ở nhà lưới
Hình 3.21. Hình ảnh DNA Địa lan trên gel
Hình 3.22. Kết quả RAPD-PCR với primer OPD-07
Hình 3.23. Mối quan hệ di truyền của các dòng nghiên cứu
Danh mục các công trình của Tác giả
79

DANH MỤC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ


Bảng 2.1. Các nghiệm thức khảo sát khả năng tạo callus

Bảng 2.2. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB với nồng độ chất
ĐHST khác nhau

Bảng 2.3. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân nhanh PLB dưới sự phối hợp
của các chất ĐHST

Bảng 2.4. Các nghiệm thức khảo sát khả năng nhân chồi
Bảng 2.5. Các nghiệm thức khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh
Bảng 2.6. Ký hiệu mẫu thực hiện phản ứng RAPD-PCR
Bảng 3.1. Tình trạng mẫu chồi đỉnh Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần

Bảng 3.2. Tình trạng mẫu phát hoa cây Địa lan sau khi khử trùng 4 tuần
Bảng 3.3. Khả năng tạo callus từ PLB của cây Địa lan
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của sự phối hợp các chất ĐHST đến hệ số nhân PLB
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên sự nhân chồi
Bảng 3.7. Khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh của Địa lan trên 4 loại môi trường
Bảng 3.8. Các dạng biến dị in vitro của cây Tím hột sau khi chiếu xạ gamma
Bảng 3.9. Các dòng biến dị qua thời gian theo dõi và nhân dòng đến M
1
V
2


vii

Bảng 3.10. Khả năng biến dị in vitro của chồi cây lan sau khi chiếu xạ gamma
Bảng 3.11. Nồng độ và độ tinh sạch của DNA Địa lan

VW Vacine and Went

i

MỤC LỤC
Trang phụ bìa
Mục lục i

Danh mục các chữ viết tắt v
Danh mục các bảng vi
Danh mục các hình vẽ, đồ thị viii
Mở đầu 1
Chương 1. TỔNG QUAN 3
1.1. Phương pháp tạo giống cây trồng mới bằng phóng xạ 3
1.1.1. Các khái niệm chung 3
1.2.2. Lịch sử chọn giống đột biến 4
1.1.3. Đột biến và các tác nhân gây đột biến 5
1.1.3.1. Vai trò của chọn giống bằng phương pháp vật lý 5
1.1.3.2. Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến 6
1.1.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ 8
1.1.3.4. Hiệu ứng sinh học của bức xạ lên cơ thể sống 9
1.1.4. Thành tựu của công nghệ bức xạ trong việc chọn tạo giống mới 11
1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu đột biến trên thế giới 11
1.1.4.2. Tình hình nghiên cứu đột biến tại Việt Nam 15
1.1.5. Chọn giống bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp nuôi cấy in vitro 17
1.2. Tổng quan về cây địa lan (Cymbidium) 19
1.2.1. Nguồn gốc và sự phân bố 19
1.2.2. Đặc điểm phân loại học. 20

ii


2.2.1.3. Thí nghiệm 3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB 41
2.2.1.4. Thí nghiệm 4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan 42
2.2.1.5. Thí nghiệm 5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh từ
chồi in vitro của cây Địa lan 43

2.2.2. Nội dung 2. Khảo sát ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan 43
2.2.2.1. Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của bức xạ gamma
60
Co lên sự sinh
trưởng và phát triển của mẫu Địa lan 43

2.2.2.2. Thí nghiệm 2. Gây tạo, xác định và phân lập các biến dị 45
2.2.3. Nội dung 3. Phân tích đa dạng di truyền của một số dòng biến dị
bằng kỹ thuật RAPD 46

2.2.4. Phương pháp xử lý số liệu 48
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 49
3.1. Hoàn thiện quy trình nuôi cấy in vitro cây Địa lan 49
3.1.1. Điều kiện khử trùng tạo mẫu trong ống nghiệm 49
3.1.2. Khảo sát khả năng hình thành callus từ PLB 51
3.1.3. Khảo sát khả năng nhân nhanh PLB 52
3.1.4. Khảo sát khả năng nhân chồi của cây Địa lan 56
3.1.5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh 59
3.2. Ảnh hưởng của bức xạ gamma lên cây Địa lan in vitro 62
3.2.1. Ảnh hưởng của bức xạ gamma
60
Co lên sự sinh trưởng và phát triển
của mẫu Địa lan 62


qua.
Xin cảm ơn các anh chị, các bạn đang công tác tại Phòng Sinh học
Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho tôi hoàn
thành luận văn của mình.
Cảm ơn các bạn lớp Di truyền k19, những người
đã cùng học tập và
sẵn sàng giúp đỡ tôi trong thời gian qua.
Cuối cùng, xin cảm ơn ba mẹ và các em đã khuyến khích và hỗ trợ tôi có
được ngày hôm nay.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011
Nguyễn Huỳnh Phương Uyên
Mở đầu
1

MỞ ĐẦU

Chọn giống thực vật bằng cách gây đột biến nhân tạo là một phương pháp đã
được chứng minh là có hiệu quả cao, góp phần tạo nên những tính trạng quý của
cây trồng. Kỹ thuật này hiện nay là một trong những phương pháp tạo và chọn
giống có nhiều ưu điểm và đã được sử dụng rộng rãi trên khoảng 60 quốc gia từ
khắp các Châu lục. Theo nguồn dữ liệu thống kê các gi
ống đột biến của IAEA
(mutation variaties database) đến năm 2011 toàn thế giới đã tạo ra 3112 giống đột
biến trên nhiều đối tượng cây trồng từ 170 loài thực vật mà chủ yếu là các loại Ngũ
cốc [16], [23], [40], [42], Khoai [48], Mè [11], Cam [24] v.v. trong đó các giống tạo
ra bởi phóng xạ gamma chiếm khoảng 60% [36], [53].
Bên cạnh đó, phương pháp tạo giống bằng tác nhân phóng xạ cũng đã tạo ra
nhiều giống hoa đa dạng từ các gi
ống mẹ ban đầu bao gồm: Cúc [39], [53], Cát

u
cấp bách đối với các nhà chọn giống trong giai đoạn hiện nay.
Từ yêu cầu đặt ra là cần phải tạo ra những giống Địa Lan để cung cấp cho thị
trường trong nước cũng như đáp ứng mục tiêu xuất khẩu. Đề tài “Nghiên cứu tạo
dòng biến dị hình thái trên cây địa lan Tím hột (Cymbidium La Bell “Anna
Belle”) in vitro bằng phương pháp chiếu xạ gamma
60
Co” được tiến hành. Mục
đích của nghiên cứu này là là gây tạo và chọn lọc các dòng Địa Lan Tím hột biến dị
hình thái in vitro để làm nguyên liệu cho quá trình chọn tạo các giống Địa lan đột
biến mới có tính ưu việt mang thương hiệu “Việt” bằng phương pháp chiếu xạ
gamma
60
Co.
Tổng quan tài liệu
3

Chương 1-TỔNG QUAN
1.1. PHƯƠNG PHÁP TẠO GIỐNG CÂY TRỒNG MỚI BẰNG PHÓNG XẠ
1.1.1. Các khái niệm chung
Phóng xạ: Phóng xạ là hiện tượng một hạt nhân tự động phóng ra những bức
xạ gọi là tia phóng xạ và biến thành hạt nhân khác. Quá trình này phát ra năng
lượng. Hiện tượng phóng xạ do các nguyên nhân bên trong hạt nhân gây ra và hoàn
toàn không phụ thuộc vào các tác động bên ngoài (áp suất, nhiệt độ, v.v.).
Công nghệ bức xạ: Công nghệ bức xạ là công nghệ sử dụng bức xạ làm
nguồn năng lượng. Công nghệ bức xạ hiện tại chủ yếu là sử dụng nguồn bức xạ là
60
Co, dòng điện tử gia tốc (electron beam- EB) và ion beam.
Liều hấp thụ: Nếu cùng một liều chiếu của cùng một bức xạ ion hóa thì các
môi trường khác nhau hấp thụ những lượng năng lượng khác nhau. Liều hấp thụ

ã xây
dựng được một nền tảng khoa học vững chắc và không ngừng được hoàn thiện. Nhờ
đó đã tạo ra hàng loạt các giống cây trồng mới, nhất là các giống ngũ cốc, góp phần
xoá đói giảm nghèo mang lại cuộc sống ấm no và cải thiện sức khoẻ cho con người.
Vào năm 1895-1896, Becquerel đã phát hiện ra hiện tượng phóng xạ làm cơ sở
cho các nghiên cứu nhằm ứng dụng phóng xạ trong l
ĩnh vực sinh học và nông
nghiệp. Cùng năm đó, Hugo De Vries đã đề xuất việc sử dụng phóng xạ nhằm mục
đích gây đột biến.
Năm 1901, Hugo De Vries công bố công trình nghiên cứu đột biến trên cây
Oenothera lamarckiana và đưa ra "thuyết đột biến". Đến năm 1904, cũng chính tác
giả này lại đề nghị sử dụng tia X để tạo ra các đột biến.
Năm 1927, Herman Muller đưa ra được bằng chứng xác thực đầu tiên về
chiếu
xạ ion hoá gây ra các đột biến ở ruồi giấm Drosophila. Cũng trong thời gian đó
Natxon và Philipop phát hiện ra tia X có khả năng gây ra biến dị di truyền ở vi nấm.
Năm 1928, Lewis Stadler tiến hành gây đột biến ở lúa đại mạch và ngô bằng
tia X và tia gamma đồng thời đã chỉ rõ tần số đột biến cảm ứng phụ thuộc vào liều
xạ tổng số của tác nhân gây đột biến.
Từ n
ăm 1938-1948, hàng loạt các công trình phát hiện ra các chất đột biến
Tổng quan tài liệu
5

của Sakharov (1938-1939), Rapoport (1940-1948), Gustafson (1940-1948), v.v.
được công bố. Đó là những chất hóa học như Ethylenimine (EI), Diethylsulfate
(DES), dimethylsulfate (DMS), Nitrosomethylurea (NMU), Nitrosoethylurea
(NEU), v.v. trên các động vật, vi sinh vật và thực vật.
Từ năm 1953-1965: Kể từ khi James Watson và Francis Crick khám phá ra
mô hình cấu trúc phân tử DNA, các nhà di truyền học và hoá sinh tập trung chủ yếu

bị biến đổi. Từ đó, công nghệ tạo giống đột biến phát triển mạnh mẽ và mở ra
những lĩnh vực mới trong nghiên cứu di truyền dựa trên nền tảng của di truyền phân
tử hiện đại. Các tia X, tia gamma, chùm neutron và các phóng xạ ion hóa khác đ
ã
được sử dụng như là một tác nhân vật lý bổ sung thêm vào công nghệ tạo giống đột
biến mà trước đó thường sử dụng tác nhân hóa học.
Trong tự nhiên, tỉ lệ đột biến tự sinh từ 1×10
-8
đến 1×10
-5
trong khi đó, phóng
xạ có thể làm thay đổi tính di truyền của sinh vật và gia tăng tần số đột biến lên từ
1×10
-5
đến 1×10
-2
. Mặt khác, các biến dị thu được không phải là GMO (sinh vật
chuyển gen) bởi vì phương pháp này không đưa yếu tố lạ vào bộ gene của sinh vật
chủ mà chỉ làm biến đổi những đặc tính sẵn có trong gene.
Ưu điểm chính của phương pháp này là các kiểu di truyền cơ bản của giống
được giữ lại trong khi những đặc tính cải tiến được thêm. Giống cải tiến được tạo ra
trong một thờ
i gian ngắn nếu so với phương pháp chọn giống truyền thống nhưng
lại cho kết quả tương đương. Với phương pháp chọn giống bằng phóng xạ, những
chủng loại cây từ nguồn nguyên liệu ban đầu được tạo ra vô cùng phong phú với
các đặc tính như: Năng suất cao, chất lượng tốt, có khả năng chống chịu sâu bệnh,
có khả năng đề kháng với những yếu tố bất lợi của môi trường. Đặc biệt trong tình
hình biến đổi khí hậu như hiện nay, yêu cầu tạo ra các giống cây chịu phèn, chịu
mặn và chịu hạn đang cấp thiết.
1.1.3.2. Các tác nhân gây đột biến và hiệu quả tạo đột biến


Hình 1.1. Tỷ lệ đóng góp của các tác nhân trong đột biến tạo giống cây trồng
Theo thống kê của IAEA (International Atomic Energy Agency) năm 2005,
nếu chỉ tính riêng trong lĩnh vực tạo giống mới bằng các tác nhân đột biến khác
nhau thì đóng góp của các tác nhân bức xạ chiếm đến 77,7% (xem Hình 1.1). Trong
đó, tia gamma là tác nhân có đóng góp lớn nhất trong phương pháp tạo giống đột
Tổng quan tài liệu
8

biến, chiếm 60,3%, tiếp theo phương pháp gây tạo đột biến bằng nuôi cấy in vitro
đóng góp 15,7 %, sau đó là tia X chiếm 9,5%. Tác nhân hóa học mặc dù được sử
dụng từ rất lâu nhưng tỷ lệ đóng góp chỉ khoảng 6,6% trong khi đó tia ion mới được
sử dụng gần đây nhưng đã đóng góp tỷ lệ 5,8%.
1.1.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ
Các phóng xạ gây ra quá trình ion hóa tạo ra những biến đổi v
ề mặt hóa học,
phá hủy cấu trúc nguyên vẹn của nhiễm sắc thể trong nhân tế bào, tạo ra các biến
đổi về mặt di truyền, là nguyên nhân gây đột biến.
Sự tương tác của các tia phóng xạ lên hệ thống gây nên sự biến đổi cấu trúc
DNA làm cơ thể bị đột biến. Có hai giả thuyết chính để giải thích hiện tượng này là
thuyết Bia và thuyết gốc tự do.
Thuyết Bia: Sự xuất hi
ện các sai lệnh ở DNA xảy ra một các tức thời với xác
xuất phụ thuộc vào cơ hội bắn trúng “bia” của tia phóng xạ. Dựa vào thuyết này,
người ta giải thích được mối liên quan giữa liều chiếu xạ và tần số xuất hiện đột
biến. Thuyết này cũng là nền tảng xây dựng các nguyên tắc của di truyền phóng xạ.
Tuy nhiên, các nghiên cứu sau này đã chứng minh thuyết “bia” chưa đầy đủ do nó
ch
ưa giải thích được các yếu tố của điều kiện môi trường và điều kiện sinh lý của cơ
thể có ảnh hưởng rõ rệt đến kết quả của quá trình xử lý phóng xạ.

nhiên, hậu quả của đột biến phụ thuộc vào vị trí của nó trong gene. Do đó, không
phải tất cả các đột biến đều dẫn đến những thay đổi về kiểu hình.
1.1.3.4. Hiệu ứng sinh học của bức xạ lên cơ thể sống
Bức xạ ion hóa là một trong những tác nhân làm tăng t
ần số đột biến. Khi bị
chiếu xạ, các thành phần của tế bào dễ bị ảnh hưởng bao gồm: màng, nhân, ty thể và
lưới nội chất. Sau khi chiếu xạ, tế bào có thể lâm vào một trong các tình trạng sau:
xuất hiện các tế bào bất thường, ngừng phân chia (do tổn thương trong bộ máy di
truyền) hoặc chết. Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái cũng như thay đổi
chức năng trong tế bào và mô. Nhi
ều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước cho rằng
bức xạ không tạo ra chức năng mới trong tế bào và mô mà bức xạ làm thay đổi các
chức năng sẵn có hay làm xuất hiện các chức năng trước đó tiềm tàng.
Tổng quan tài liệu
10

Những đặc điểm chung của các hiệu ứng sinh học dưới tác dụng của bức xạ
ion hóa có thể liệt kê như sau:
− Cách tác dụng của bức xạ: Bức xạ có thể gây ra hiệu ứng tại chỗ hay trực
tiếp, toàn thân hay gián tiếp.
− Thời gian xuất hiện của hiệu ứng: Bao gồm hiệu ứng tức thời (biểu hiện
ngay sau khi chiế
u xạ) và hiệu ứng chậm (các hiệu ứng xuất hiện sau một
thời gian tiềm ẩn).
− Tính chất của hiệu ứng: Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái
cũng như thay đổi chức năng. Tuy nhiên, bức xạ không tạo ra các chức
năng mới trong tế bào và tổ chức mà nó có tác dụng thay đổi chức năng sẵn
có trong tế bào.
− Khả năng hồ
i phục bức xạ ion hóa: Gây ra các hiệu ứng thuận nghịch và

và HO
2
. Các sản
phẩm của quá trình này rất hoạt động về mặt hóa học, tác động và làm
Tổng quan tài liệu
11

tổn thương lên các phân tử sinh học. Trong giai đoạn này một số phân
tử quan trọng như enzyme, nucleoprotein sẽ bị tổn thương.
− Giai đoạn sinh học: nếu các tổn thương hóa sinh xảy ra trong giai đoạn hóa
lý không hồi phục được sẽ gây ra những thay đổi trong chuyển hóa dẫn đến
những thay đổi về hình thái và chức năng. Giai đoạn này có thể kéo dài hay
ngắn tùy thuộc vào mức độ tế bào hay tổ chức bị tổn thương (từ vài giây
đến hàng chục năm).
Trong cùng một cơ thể không phải tất cả các tế bào đều nhạy cảm như nhau
với bức xạ ion hóa. Năm 1906, Bergonia và Tribondeau đã đưa ra một định luật:
“Độ nhạy của tế bào trước bức xạ tỷ lệ thuận với khả năng sinh sản và tỉ lệ nghịch
với mứ
c độ biệt hóa của chúng”.
1.1.4. Thành tựu của công nghệ bức xạ trong việc chọn tạo giống mới
1.1.4.1. Tình hình nghiên cứu đột biến trên thế giới
Phương pháp tạo giống bằng thực nghiệm được coi là một trong các thành tựu
to lớn của thế kỷ 20. Từ năm 1950 đến nay, số lượng các giống đột biến không
ngừng gia tăng trong đó giai đoạn tăng nhanh nhất là từ năm 1981-1990 (xem Hình
1.2). Đến đầu thập niên 1990 đã có 1364 giống đột biến được tạo ra trên thế giới,
trong đó khoảng 90% là do xử lý bức xạ [53]. Đến năm 2009 đã có hơn 3100 giống
mới của 170 loài được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến được công bố bởi hơn
60 quốc gia khác nhau và trên các vùng Châu lục khác nhau [36]. Trong năm 2010
bổ sung thêm 12 giống đột biến và năm 2011 bổ sung thêm 4 giống (trong đó Việt
Nam bổ sung thêm 3 gi


Theo cơ sở dữ liệu thống kê các giống đột biến của IAEA [53] hiện nay, Trung
Quốc đang là nước có số lượng giống đột biến cao nhất thế giới với 808 giống được
tạo ra, tiếp theo là Nhật Bản (thứ 2) và Ấn Độ (thứ 3) (xem Bảng 1.1).
Bảng 1.1.
Một số giống đột biến của một số nước trên thế giới năm 2011
Nước
Số
giống
Lúa
Lúa
mì
Lúa
mạch
Ngô
Đậu
tương
Cây
khác
Tia gamma
Số
lượng
Tỷ lệ đóng
góp, %
Trung Quốc 808 290 162 7 47 79 223 500 61,88
Nhật Bản 481 222 7 10 0 30 212 314 65,28
Ấn Độ 329 59 4 13 0 7 246 190 57,75
Nga 215 6 36 29 5 9 130 57 26,51
Hà lan 176 0 0 1 0 0 175 16 9,09
Đức 171 0 2 66 0 1 102 29 16,96