Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp trong
chẩn đoán bệnh da Đại cương:
Miễn dịch huỳnh quang ( Immunofluorescence: IF) là một kỹ thuật hoá mô cần
thiết để phát hiện kháng nguyên và vị trí khu trú của các kháng nguyên đó. Kháng
thể đặc hiệu được gắn với phức hợp huỳnh quang (Fluorescein Isothiocyanate:
FITC ), giúp chúng ta dễ dàng quan sát thấy được các phản ứng miễn dịch, đồng
thời không làm thay đổi các phản ứng miễn dịch. Phức hợp khỏng thể huỳnh
quang được thờm vào mụ tổ chức và sẽ gắn chặt vào kháng nguyên, sẽ tạo nên
một phức hợp miễn dịch bền vững. Không một kháng thể nào bị mất trong quá
trình rửa, và kết quả được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang. Bộ điều hoà
của kính hiển vi chứa nguồn ánh sáng có cường độ lớn, kích thích kính lọc để tạo
ra bước sóng có khả năng gây hoạt hoá huỳnh quang, tấm chắn của kính lọc có tác
dụng loại bỏ các bước sóng gây nhiễu của ánh sáng. Khi quan sát bằng kính hiển
vi huỳnh quang phải quan sát dưới với nền tối, kháng nguyên gắn đặc hiệu với
kháng thể huỳnh quang có thể được phát hiện bởi màu xanh lục sáng.
Có 3 loại kỹ thuật MDHQ cơ bản dùng trong chuyên ngành da liễu:
- MDHQ trực tiếp ( Direct Immunofluorescein : DIF )
- MDHQ gián tiếp ( Indirect Immunofluorescein : IIF )
- MDHQ gián tiếp bổ thể ( Complement Indirect immunofluorescein : CIIF )
MDHQ trực tiếp là kỹ thuật xét nghiệm để xác định kháng thể ở da của người
bệnh.
MDHQ gián tiếp là kỹ thuật xác định kháng thể ở trong huyết thanh, huyết tương,
dịch bọng nước hoặc các dịch khác.
MDHQ gián tiếp bổ thể là sự biến đổi của kỹ thuật MDHQ gián tiếp để xác định
kháng thể có gắn bổ thể ở trong dịch của người bệnh.

Miễn dịch huỳnh quang trực tiếp
( Viết tắt: DIF )

khó khăn.
2. Các loại tổn thương khác : mảnh sinh thiết đúng vào vị trí của tổn thương
3. Những tổn thương nghi ngờ là tổn thương của viêm mao mạch nên cắt các tổn
thương sớm < 12 giờ
Vị trí cắt sinh thiết Bọng nước Xq bọng nước Da lành Cách bảo quản và vận chuyển bệnh phẩm
Mảnh sinh thiết dùng để làm phản ứng MDHQ không nên cố định bằng bất kỳ một
loại hoá chất nào. Để tránh cho mảnh sinh thiết bị khô, nên gói bệnh phẩm trong
gạc tẩm ướt bằng nước muối 9 ‰. và để ngay bệnh phẩm vào ni tơ lỏng càng sớm
càng tốt.
Trong trường hợp không có Ni tơ lỏng, thì nên giữ bệnh phẩm trong môi trường
vận chuyển Michel ở nhiệt độ 4°c và chuyển đến phòng xét nghiệm trước 24 giờ
Cách làm đông lạnh nhanh:
Có nhiều phương pháp làm đông lạnh bệnh phẩm nhanh. nếu đông lạnh trong Ni
tơ lỏng, thì nên để bệnh phẩm trong một ống khô, sạch hoặc trong ống nhựa, ống
tráng nhôm hoặc để trong nang gelatin trước khi cho vào Ni tơ lỏng. Tuyết của đá
khô hoặc Aceton hoặc cồn Ethanol cũng có thể là chất làm lạnh để bảo quản bệnh
phẩm, nhưng bệnh phẩm nên để trong ống để tránh tiếp xúc với chất làm tan mô.
Một phương pháp làm đông lạnh tạm thời khác là dùng cốc 15mm có tráng nhôm.
Hoặc vùi bệnh phẩm vào chất vùi gọi là OCT rồi làm đông nhanh và giữ bệnh
phẩm ở - 70°C cho tới khi đem ra làm phản ứng.
Môi trường vận chuyển bệnh phẩm:
Khi vận chuyển bệnh phẩm cần để bệnh phẩm trong một môi trường vận chuyển
gọi là dung dịch cố định Michel, dung dịch này cho phép vận chuyển bệnh phẩm
một cách dễ dàng ở điều kiện nhiệt độ xung quanh, môi trường này tránh cho
mảnh mô không bị thoái hoá, không ức chế các men của phản ứng miễn dịch. Khi
lấy bệnh phẩm ra khỏi môi trường vận chuyển, cần rửa mảnh mô trong dung dịch
Buffer ( PBS) 30 phút và làm đông lạnh và giữ mô ở nhiệt độ – 70 °C cho đến khi

đều, có thể là hạt lớn, kích thước không đều, hoặc hạt to hình tròn hay bầu dục tạo
thành búi. Đôi khi các hạt này có kích thước cực kỳ nhỏ và đứng sát vào nhau tạo
thành hình ảnh của giả dải hoặc hạt nhỏ. để phân biệt với thể hạt nhỏ với kiểu dải
dọc màng đáy là rất khó, lúc này cần làm thêm miễn dịch huỳnh quang gián tiếp (
IIF ) để có chẩn đoán xác định cuối cùng.
- Thứ tư là loại Ig nào lắng đọng, hầu hết các trường hợp là sự kết hợp của các Ig
với bổ thể, chủ yếu là C3.
Khi đưa ra kết quả phải dựa vào vị trí của lắng đọng miễn dịch. Với các bệnh khác
nhau có thể lắng đọng miễn dịch ở cùng một vị trí nhưng khác nhau về kiểu lắng
đọng ( kiểu hạt hoặc kiểu dải ), loại Ig lắng đọng ( IgG, Ig M, IgA ) và có sự lắng
đọng ở mạch máu kèm theo hay không ?
Lắng đọng ở khoảng gian bào của tế bào biểu mô :
Sự lắng đọng huỳnh quang của IgG và bổ thể C3 ở vị trí này chỉ gặp ở bệnh nhân
Pemphigus, đặc biệt ở những bệnh nhân pemphigus chưa điều trị, không phải tất
cả các vị trí của da đều có sự lắng đọng này.
Lắng đọng ở vùng màng đáy:
Sự lắng đọng ở vùng này rất phức tạp, vì sự lắng đọng này gặp ở nhiều bệnh như :
bệnh da có bọng nước, bệnh mạch máu, bệnh Collagen và một số bệnh khác. Nên
chú ý tới kiểu lắng đọng ( hạt, dải ) loại Ig lắng đọng
( IgG, IgA, IgM ) và kèm theo lắng đọng ở mạch máu hay không để phân biệt các
bệnh khác nhau.
- Dạng dải: Dạng này gợi ý nhóm bệnh pemphigoid, Ly thượng bì bọng nước bẩm
sinh, Viêm da bọng nước do lắng đọng IgA thành dải, hoặc porphyrias.
+ IgG và/hoặc IgM, không có IgA: Gợi ý bệnh Pemphgoid, IgG và IgM cùng lắng
đọng gặp ở 80% trường hợp, nhưng cũng có khi lắng đọng ở da bình thường(
hiếm). Lắng đọng thành dải của IgG ở bệnh pemphigoid cũng có thể gặp trong ly
thượng bì bọng nước mắc phải, để phân biệt hai bệnh cần quan sát vị trí bọng nước
dưới kính hiển vi điện tử hoặc dùng kỹ thuật muối bão hoà làm tách màng đáy để
xác định vị trí lắng đọng của huỳnh quang miễn dịch tại vùng nào của màng đáy,
trong pemphigoid huỳnh quang miễn dịch sẽ lắng đọng ở phía trên laminar densa,

Lắng đọng huỳnh quang miễn dịch ở nhân tế bào biểu mô gai:
Lắng đọng Ig ở nhân tế bào, kết hợp với kháng thể kháng nRNP hướng tới bệnh
Mixed connective tissue hay SLE.
Lắng đọng ở các thể Cytoid :
Lắng đọng của các Ig ở các thể cytoid, là những thể tròn, hoặc hình Oval ở trung
bì nông, ngay sát thượng bì hoặc ở lớp sâu của thượng bì (thể Civatte), gặp trong
bệnh viêm da dạng lichen, đặc biệt ở bệnh lichen phẳng.
Bảng hình ảnh DIF không bình thường ở một số bệnh da
STT Bệnh DIF
1
Pemphigus vulgaris
P. vảy lá
P. sùi
Lắng đọng của bổ thể C3 và Ig ở khoảng
gian bào ( IgG 80 -100%, IgA/IgM 20%, C3
khi bệnh nặng)
2 P. da mỡ
Lắng đọng của IgG/C3 ở khoảng gian bào
và ở vùng màng đáy ( dạng hạt)
3 Pemphigoid Bullous
Lắng đọng của các Ig thành dải ở vùng
màng đáy: IgG/C3 80%, IgA/IgM 27%
4 Pemphigoid cicatricial
Lắng đọng của Ig thành dải ở vùng màng
đáy: IgG/C3 80%, IgA 40%
5
Ly thượng bì bọng nước
mắc phải
Lắng đọng của IgG thành dải ở vùng màng
đáy ở 100% trường hợp

mạch máu của trung bì nông và trung bì sâu
12
Lichen Planus Lắng đọng của các IgG, IgM, IgA, C3 ở các
thể Civatte và Fibrinogen thành dải ở màng
đáy
13
Mixed connective tissue IgG ở nhân của tế bào gai ( không đặc hiệu),
disease và IgG, IgM ở màng đáy
14 Lupus Erythematous IgG,IgM, IgA, C3 dạng hạt ở màng đáy
15 Porphyria Cutanea tarda IgG ở vùng màng đáy và huyết quản