ĐẶT VẤN ĐỀ
Chất lượng ATVSTP có liên quan trực tiếp hàng ngày, thường xuyên,
liên tục đến sức khỏe con người, ảnh hưởng lâu dài đến nòi giống dân téc. Sử
dụng thực phẩm không đảm bảo chất lượng, vệ sinh sẽ dẫn đến ngộ độc cấp
tính, ngộ độc mạn tính, các bệnh truyền qua thực phẩm. Chất độc tính lũy
trong cơ thể gây ảnh hưởng đến sức khỏe lâu dài, giảm khả năng lao động,
gây các bệnh mạn tính, rối loạn chuyển hóa và có thể gây ung thư. Không
những thế, nó còn ảnh hưởng đến sự phát triển kinh tế, xã hội, an ninh chính
trị và quan hệ quốc tế [13]. Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng
ngõa bệnh tật Mỹ thì hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy
trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26]. Tại các
nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm
gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2
triệu người [22].
Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là một vấn đề đang được quan tâm hàng
đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đó cú 4,2 triệu người bị
ngộ độc thực phẩm. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 5600000
ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng trong 9
tháng đầu năm ngoái ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy trong đó có 12
ca tử vong. Thực tế theo các chuyên gia phải gấp ít nhất 10 lần con số được
công bố [10].[20].
Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ
chính tác động đến sức khoẻ con người trên thế giới (Wood và CS 1983).
Trong đó, vi khuẩn E.coli sinh độc tố (ETEC) là một trong những nguyên
nhân gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển
1
và cho khách du lịch đến những vựng cú dịch lưu hành. Thực phẩm và nước
bị ô nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này.
Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với
ETEC ở vựng cú dịch lưu hành (Black và CS, 1981,1982; Ryder và CS,
1976). Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ

Tuy nhiên các kỹ thuật này giá thành còn cao và phức tạp cho nên rất khó áp
dụng cho các phong xét nghiệm thực phẩm ở tuyến tỉnh. Xuất phát từ thực
tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Thiết kế và biểu hiện protein
tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt LT của ETEC và sản xuất kháng thể
đa dũng khỏng LT trên quy mô phũng thớ nghiệm” . Đây là bước quan
trọng cho nghiên cứu tiếp theo nhằm mục đích sản xuất bộ sinh phẩm chẩn
đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của ETEC ở trên một số nhóm thực phẩm
Mục tiêu nghiên cứu:
1. Thiết kế vector biểu hiện gen mã hóa cho kháng nguyên tái tổ hợp
EltB và biến nạp vào tế bào khả biến DH5α
2. Biểu hiện và tinh sạch Protein EltB trong tế bào vi khuẩn E.coli BL21
3. Sản xuất kháng thể kháng LT trên thỏ ở quy mô phòng thí nghiệm
3
Chương 1
TỔNG QUAN
1.1.Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm
1.1.1.Trên thế giới
Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngõa bệnh tật Mỹ thì
hàng năm trên thế giới có khoảng 1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70%
nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [26]. Tại các nước đang
phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra,
trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu
người [22].
Tại Úc, mỗi ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm. Ở Mỹ
hàng năm ước đoán có khoảng 5 đến 6 triệu người bị mắc bệnh do nguyên
nhân ăn uống và hơn 9000 trường hợp tử vong [12].[48].
Một nghiên cứu khác về bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm VSV gây bệnh
ở New-York Mỹ, phát hiện có sự gia tăng gấp 4 lần từ 1980 đến 1990. [6].
Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm do
virus viêm gan A làm tử vong 9 người. Năm 1999 xảy ra 591 vụ ngộ độc thực

đến cơ sở, việc thống kê báo cáo còn chưa được thiết lập nên số ca ngộ độc
thực phẩm thực tế hàng năm còn cao hơn rất nhiều. Theo ước tính của WHO,
ngộ độc thực phẩm hàng năm ở Việt Nam khoảng trên 8 triệu ca. Ngoài tình
trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm mạn tính cũng đang
diễn ra khá phức tạp. Ngộ độc thực phẩm mạn tính thường Ýt được chú vì
biểu hiện lâm sàng thường không dữ dội như ngộ độc cấp tính. Tuy nhiên,
hậu quả của ngộ độc thực phẩm mạn tính còn nguy hiểm hơn nhiều, dẫn đến
biết bao hệ lụy cho sức khỏe cộng đồng.
5
Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người
tử vong, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ
độc là 323 người với 242 người nhập viện.
Nguyên nhân chính là do vi sinh (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính là
Salmonella, Streptoccocus, E.Coli và Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và
hóa chất. Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân do không lấy
được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở.
Mới đây nhất, ngày 30/12, có 461 công nhân thuộc 4 công ty trên địa
bàn quận 12 và huyện Húc Mụn, TP.HCM đã lần lượt phải nhập viện cấp cứu
vì ngộ độc thực phẩm (Dinh dưỡng .com.vn)
1.2.Ngộ độc thực phẩm do E.coli
1.2.1. Vài nét về E.coli
E.coli do Eschirich phân lập từ phân người năm 1885
E.coli ký sinh bình thường trong đại tràng người và một số động vật.
Sau khi trẻ ra đời khoảng 3h, người ta đã thấy E.coli trong đại tràng và từ đó
nó sống suốt đời với cơ thể vật chủ
E.coli góp phần tiêu hóa thức ăn, phân giải muối mật, sản xuất một số
sinh tố, giữ thăng bằng vi khuẩn chí ở ruột. Trong số vi khuẩn hiếu khí ở đại
tràng, E.coli chiếm 80%
6
Một số hình ảnh của E.coli

- Bắt mầu Gram (-)
- Di động bằng hệ thống lông xung quanh thân hoặc không di động.
- Có thể có vỏ.
8
1.2.3.2. Tính chất nuôi cấy
- Là loại hiếu khí hay hiếu kỵ khí tùy tiện.
- Nhiệt độ thích hợp 37
o
C nhưng có thể mọc ở 40
o
C, sống được ở nhiệt
đô 5-40
o
C
- pH 7,4.
- E.coli phát triển dễ dàng trên môi trường nuôi cấy thông thường, một
số có thể phát triển trên môi trường tổng hợp rất nghèo chất dinh dưỡng.
- Ở những điều kiện thích hợp, E.coli phát triển rất nhanh, thời gian phân
chia thành một thế hệ mới khoảng 20 đến 30 phút.
- Trong môi trường lỏng (như canh thang) sau 3-4h E.coli đã làm đục
nhẹ môi trường, sau 24h làm đục đều. Những ngày sau, dưới đáy ống có thể
có cặn.
- Trên môi trường đặc sau khoảng 8-10h, dùng kính lúp có thể thấy được
khuẩn lạc. Sau 24h đường kính khuẩn lạc khoảng 1,5mm, hình thái khuẩn lạc
điển hình là dạng S: tròn, lồi, ướt, màu xám, bề mặt sáng bóng, bờ đều, nhưng
cũng có thể gặp dạng M hoặc dạng R.
- Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA tạo khúm trũn ướt (dạng S)
màu trắng đục. Để lâu khóm trở nên khô nhăn (dạng R). Kích thước khóm 2-
3mm.
- Trên thạch mỏu: Cú chủng dung huyết β, có chủng không dung huyết α.

hiện qua một số các yếu tố trung gian gọi là CFA (Colonization Factor
Antigen “yếu tố kháng nguyên cư ngụ”) hoặc các yếu tố kháng nguyên trên bề
mặt E.coli (E.coli surface antigen). Các CFA này có bản chất là protein và
chúng có tính kháng nguyên nguyên mạnh, có khả năng gây ngưng kết hồng
cầu của một số loài khác nhau [36].[38].[46].
- Cho đến nay người ta đã phát hiện ra một số loại CFA khác nhau như
CFA I, CFA II, CFA III, CFA IV. CFAII được mô tả như một yếu tố kháng
10
nguyên lông riêng biệt có chứa 1 hoặc 2 kháng nguyên lông bề mặt khác [36].
[38].[46].
- Các CFA này còn liên quan chặt chẽ với các yếu tố độc lực LT và ST:
CFA I và CFA II liên quan với LT và ST hoặc chỉ ST đơn thuần nhưng CFA
III chỉ liên quan với chủng ETEC chỉ sản xuất LT [36].
- Các yếu tố CFA được mã hóa bởi các gen nằm trên plasmid và plasmid
này cũng mã hóa cho các độc tố LT và ST, [36].[38].[46].
- Các nghiên cứu về dịch tễ học thấy rằng CFA I, CFA II và CFA IV xuất
hiện khoảng 75% trong các chủng ETEC gây bệnh ở người trên thế giới. [34].
● Độc tố
ETEC gây tiêu chảy nhờ hoạt động của độc tố ruột không chịu nhiệt LT
và độc tố ruột chịu nhiệt ST. Một chủng E.coli có thể chỉ có LT, chỉ có ST
hoặc cả 2 loại độc tố này
◘ Độc tố không chịu nhiệt LT
LT là một protein có tính kháng nguyên mạnh, có tính chất của một
ngoại độc tố. Cấu trúc và chức năng gần giông với choleragen của vi khuẩn
tả. Có 2 type huyết thanh của LT là LT I và LT II, chúng không có phản ứng
miễn dịch chéo với nhau. LT I có ở những chủng gây bệnh cho cả người và
động vật, LT II hiếm khi phân lập được ở trên người. Nhưng cả động vật và
người, sự có mặt can LT II không liên quan đến bệnh. Do vậy thuật ngữ LT
chỉ để ám chỉ LT I. LT là độc tố có trọng lượng phân tử thấp 86 kDa bao gồm
28 kDa tiểu đơn vị A và 11,5 kDa của 5 tiểu đơn vi B (LTB). Khả năng bỏm

cystein mà chính nhờ các cầu nối disufide, ST bền vững với nhiệt độ. Có 2
lớp ST khác nhau về cấu trúc và cơ chế hoạt động là Sta và STb. Gen mã hóa
cho 2 lớp này thường nằm trên plasmid, cũng có khi nằm trên transposon.
Độc tố ST hoàn chỉnh chứa 18-19 acid amin trọng lượng phân tử 2 kDa.
Receptor của STa là enzym trên màng gai là Guanyl cyclase(GC-C). Khi Sta gắn
với GC-C trên tế bào biểu mô ruột, kích thích hoạt động can GC làm tăng GMPc.
GMPc hoạt động giống AMPc. STb chứa 48 acid amin throng lượng phân tử 5,1
kDa. STb làm mất nhung mao hoặc teo một phần nhung mao ruột. [41]
- Những dòng E.coli có cả 2 loại nội độc tố LT và ST sẽ gây ra tiêu chảy
trầm trọng và kéo dài
♦ Nhóm EPEC (Enteropathogenic E.coli): gồm các type thường gặp
O26:B6, O44, O55:B5, O112:B11, O124, O125:B5, O142 là nguyên nhân
gây tiêu chảy ở trẻ em dưới 2 tuổi
♦ Nhóm EIEC (Enteroinvasine E.coli): những E.coli này bỏm lờn niêm
mạc và làm tróc niêm mạc gõy loột niêm mạc do đó gõy tiờu chảy có đờm lẫn
12
máu (giống Shigella). Các chủng này có thể lên men hay không lên men
đường lactose và có phản ứng lysin decarboxylaza âm tính. Thường gặp các
type O125, O157, O144…
♦ Nhóm VETEC (Verocytoxin produccing E.coli): Vừa gây tiêu chảy
vừa là nguyên nhân gây viêm đại tràng xuất huyết (hermorrhagic colilic) và
làm tổn thương mao mạch gây hiện tượng sưng phù (ederma) rất nguy hiểm
đến tính mạng (do biến chứng). Nhóm VETEC bao gồm các type: O26, O11,
O113, O145, O157 ; đây là ngoại độc tố vetec gây tiêu chảy. Các biến chứng
trên do vi khuẩn tiết ra một trong 2 loại ngoại độc tố VT1 (verocytoxin) và
VT2 gây tác động thần kinh.
Gần đây người ta phát hiện chủng E.coli mới ký hiệu là E.coli O157:H7.
Chủng này đã gây ra những vụ ngộ độc lớn trên thế giới trong những năm gần
đây (theo CDC, Center for Disease Control and prevention của Mỹ) :
* Triệu chứng lâm sàng:

triển trong thực phẩm và nước
ETEC là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ
em các nước đang phát triển nhưng không phải là yếu tố chớnh gõy tiêu chảy
ở trẻ em các nước phương Tây. ETEC là một vi khuẩn quan trọng gây tiêu
chảy ở người Âu châu, nhưng lại không quan trọng bằng EAEC ở người Á
châu. Các chủng ETEC thường kết hợp với 2 hội chứng lâm sàng chính là sự
tiêu chảy ở trẻ em mới thôi bú mẹ ở các nước phát triển và sự tiêu chảy ở
những người đi du lịch.
14
1.3.2. Ở Việt Nam
Ở Việt Nam, E.coli là một trong những căn nguyên quan trọng gây tiêu
chảy ở trẻ em đặc biệt là trẻ em dưới 5 tuổi.[4] Theo báo cáo của chương
trình quốc gia giám sát tớnh khỏng thuốc của các vi khuẩn gây bệnh thường
gặp (1988 – 1994) thì E.coli đứng thứ hai ( sau S.aureus) về tỉ lệ phân lập
được tính chung tất cả các loại bệnh phẩm ở nước ta.
Một số nghiên cứu đã được tiến hành nhằm tìm hiểu vai trò gây bệnh của
ETEC tại viờt nam cho thấy: khoảng 5-8% các trường hợp tiêu chảy ở trẻ em
dưới 5 tuổi là do ETEC. Kỹ thuật ELISA cũng đã được áp dụng để phát hiện
khả năng sinh độc tố của các chủng ETEC cho thấy 14/221 (6,3%) các chủng
E. coli phân lập từ các bệnh nhân tiêu chảy cấp có sinh độc tố ruột. Thêm vào
đó các nghiên cứu sâu về E. coli sinh độc tố bằng các kỹ thuật sinh học phân
tử như phát hiện tỷ lệ mang gen độc tố của E. coli (bao gồm cả độc tố LT) của
các trường hợp tiêu chảy cấp tinh của trẻ em. Hay việc phát hiện gen độc tố
của E. coli ở các trang trại bò sữa cũng đã được tiến hành tại Việt Nam. Tuy
nhiên trong lĩnh vực Vệ sinh An toàn thực phõm, phần lớn chúng ta mới áp
dụng các kỹ thuật nuôi cấy truyền thống để phát hiện mức độ ô nhiễm E. coli
trong thực phẩm các kết quả đều cho thấy mức độ ô nhiễm E. coli trong thực
phẩm ở Việt nam khá cao chiếm 50%-90% các mẫu xét nghiệm, tuy nhiên
chúng ta chưa có các thống kê về tình hình ô nhiễm của các E. coli gây bệnh
trong đó có ETEC, do vậy, trong tương lai, rất cần có những nghiên cứu sâu

mất rất nhiều thời gian do có quá nhiều tupe huyết thanh của E.coli. Đồng
thời một số chủng vi khuẩn gây bệnh đường ruột khác có thể phản ứng chéo
với kháng huyết thanh của E.coli như Shigella, Samonella, V. cholerae non
01 [34].
16
1.4.2. Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu
Thử nghiệm này tường được dùng để sàng lọc EAEC. Độ nhạy và độ đặc
hiệu của thử nghiệm tạo vỏng trờn môi trường lỏng trong chẩn đoán EAEC
khoảng 90%. Hơn nữa nó cho kết quả nhanh, đơn giản, dễ thực hiện ở các la
bo vi sinh bệnh viện. [11].
1.4.3. Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm
Một số thử nghiệm trên súc vật dựa trên đặc điểm độc lực can DEC đã
được thực hiện như phương pháp quai ruột dùng để phát hiện độc tố ruột ST,
phương pháp thử nghiệm trên chuột đang bú, thử nghiệm Sereny…[34].
Phương pháp này không những tốn kém mà còn thiếu sự tiêu chuẩn hóa
( Nguyễn Vũ Trung, 2004).
1.4.4. Phương pháp miễn dịch
Một vài xét nghiệm miễn dịch đã được sử dụng như miễn dịch phóng xạ
và ELISA dùng để xác định các độc tố LT và ST của ETEC , Kỹ thuật ELISA
dùng để phát hiện nhanh các chủng EPEC và EHEC thuộc nhóm huyết thanh
O26 [34].
ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) là một kỹ thuật sinh
hóa để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Hiện
nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu y học.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng
thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên- antigen (KN) chưa biết được gắn trên một bề mặt;
(2) Kháng thể - antibody (KT) biết trước được "rửa" qua bề mặt đó.
Kháng thể này được gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này

điwax. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.
18
1.4.4.2. Sandwich ELISA:
Phương pháp được sử dụng để phát hiện KN trong mẫu nghiên cứu và
bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều
trường hợp):
(1) Chuẩn bị bề mặt (microtiter) có gắn KT
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt.
(3) Phủ mẫu chứa kháng KN cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng KN không được gắn kết sẽ bị rửa trôi
(5) Thờm cỏc KT đặc hiệu cho KN cần chẩn đoán
(6) Thêm KT thứ cấp đã được gắn với enzym (KT thứ cấp đặc hiệu cho
KT sơ cấp ở bước 5)
(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.
(8) Thêm cơ chất. Enzym sẽ biến đổi cơ chất tạo màu, phát quang hay
tín hiệu hóa điện.
(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa
qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT.
Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu
cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát
19
hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với
enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất.
Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.
1.4.4.3. ELISA cạnh tranh:
(1) "Ủ" KT không được đánh dấu với KN.
(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa KN.
(3) Rửa đĩa, KT không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng KN càng lớn,
lượng KT gắn thành công với KN trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".
(4) Thêm KT thứ cấp (KT của KT ở bước 1). KT thứ cấp gắn với

chúng ta có thể tạo ra một số lượng lớn các bản sao của một đoạn DNA mong
muốn. [4].[7].
Phản ứng PCR dựa trên nguyên lý tổng hợp DNA trong tế bào, trong đó
DNA được nhân lên theo cơ chế bán bảo tồn. Về nguyên tắc để bắt đầu quá
trình tổng hợp DNA, hai sợi DNA làm khuôn mẫu bị tách ra dưới tác dụng
của nhiệt độ. Hai đoạn oligonucleotide từ 20-40 nucleotide gọi là mồi sẽ gắn
vào các vị trí bổ sung trên đoạn DNA mẫu.
Trong điều kiện của PCR, hai mồi sẽ được kéo dài về hai phía, tạo ra
đoạn DNA mới bổ sung với đoạn khuôn mẫu. Với một cặp mồi đặc hiệu một
đoạn DNA nào đó sẽ được tổng hợp sau mỗi chu kỳ của PCR. Việc thao tác
được thực hiện trực tiếp trên chất liệu di truyền (đặc biệt trờn cỏc gen của vi
khuẩn ) để khuyếch đại đặc hiệu trên hàng triệu hay hàng tỷ lần trong thời
gian ngắn [7].[9].
Như vậy, số cặp mồi cần thiết sẽ tương ứng với số đoạn DNA cần khuếch
đại. Mỗi phản ứng PCR sẽ được thực hiện với sự tham gia của một cặp mồi đặc
hiệu. Tuy nhiên trong nhiều trường hợp, việc tiến hành nhiều phản ứng PCR sẽ
mất khá nhiều thời gian và việc sàng lọc sẽ gây tốn kém. [15]
Chính vì vậy, nhiều tác giả đã cải tiến đưa ra phương pháp sử dụng
nhiều cặp mồi trong một phản ứng PCR, để cùng một lúc khuếch đại được
21
nhiều đoạn DNA. Trong chẩn đoán vi sinh, điều này đông nghĩa với việc phát
hiện được nhiều tác nhân gây bệnh chỉ bằng một phản ứng PCR. Kỹ thuật này
được gọi là PCR đa mồi. Ưu điểm của PCR đa mồi là tiết kiệm được rất nhiều
thời gian và nguyên vật liệu.
Tuy nhiên sự có mặt của một số chất trong phân như: sắc tố mật, muối
mật, polysaccharid, các chất cặn bã, xơ từ thức ăn đó tiờu húa…và một lượng
lớn DNA không phải từ E.coli sẽ ức chế phản ứng PCR, làm giảm đáng kể độ
nhạy và độ đặc hiệu của kỹ thuật. Vấn đề đặt ra ở đây là làm sao chiết tách và
tinh sạch được DNA của các chủng E.coli gây tiêu chảy trực tiếp từ bệnh phẩm.
Đã có một số phương pháp tách chiết và tinh sạch DNA trực tiếp từ

sử dụng rất rộng rãi trong các nghiên cứu và chẩn đoán như que thử nhanh phát
hiện kháng nguyên bề mặt (HbsAg) của vius viêm gan B, hay que thử nhanh
để phát hiện V. cholerae O1 và O139 trong các mẫu bệnh phẩm lâm sàng
(Crystal Vc, dipstick)… Ở nghiên cứu của chúng tôi cũng dựa trên nguyên lý
của kỹ thuật sắc ký miễn dịch (immunochromatographic), kháng thể tiểu đơn
vị B của độc tố LT đã được gắn hạt vàng được sử dụng để phát hiện nhanh,
chính xác độc tố LT của ETEC trong các mẫu thực phẩm.
23
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Đối tượng nghiên cứu
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid
- Tế bào vi khuẩn khả biến Escherichia coli chủng DH5α sử dụng cho
mục đích tỏch dũng và biểu hiện protein EltB,
- Tế bào biểu hiên protein BL21
- Chủng ETEC chuẩn (… ) mang gen độcn tố LT
- vector biểu hiện pGEX mang đoạn gen mã hóa cho protein EltB
2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị
* Hóa chất:
- Dung dịch tách chiết DNA từ vi khuẩn: TE (Tris- EDTA)
- Dung dịch CaCl
2
0,1M
- Taq ADN polymerase
- Nước khử ion
- Kháng sinh ampicillin
- Enzym cắt giới hạn (BamHI và XhoI)
- Thạch điện di Agarose
- dung dịch đệm TAE
- Ethidium bromide

C và -80
o
C (SANYO), tủ ấm.
- Lò vi sóng (SamSung)
- Lò hấp ướt: ALP (Nhật Bản)
- Pipet định mức, đầu cụn cỏc loại, ống PCR, ống eppendorf loại 1,5ml,
0,2 ml, ống Falcon, găng tay, giấy thấm.
- Nhà chăn nuôi động vật thí nghiệm đạt tiêu chuẩn gây miễn dịch cho
thỏ
- Bàn cố định thỏ
- Máy ly tâm
- Tủ ấm 37
0
C
- Tủ lạnh
- Máy đọc ELISA bước sóng 450nm
- Máy voltex
25