Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng Đại học y h nội
Trịnh Thị Quế
thiết kế vector v bớc đầu biểu hiện protein
tiểu đơn vị B độc tố không chịu nhiệt
của etec trên vi khuẩn
e.coli

luận văn thạc sĩ y học H nội - 2011
Bộ giáo dục v đo tạo Bộ y tế
Trờng Đại học y h nội
Trịnh Thị Quế


dạy cho tôi những kiến thức quý báu và đã tạo điều kiện cho tôi được tham
gia thực hiện đề tài:“Nghiên cứu quy trình sản xuất bộ sinh phẩm
immunoblotting chẩn đoán độc tố không chịu nhiệt (LT) của E.coli sinh độc
tố ở trên một số nhóm thực phẩm”
Tôi xin trân trọng cảm ơn:
Đảng ủy, Ban Giám hiệu, phòng Đào t
ạo Sau đại học trường Đại học Y
Hà Nội
Đảng ủy, Ban Giám đốc bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam
PGS.TS Nguyễn Thị Hà người đã dành cho tôi những ý kiến vô cùng quý
báu để tôi tiến bộ hơn trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn
này.
Các thầy cô trong Bộ môn Hóa sinh, trường Đại học Y Hà Nội đã cho tôi
kiến thức trong quá trình học tập.
Tập thể các anh chị trong trung tâm nghiên cứu Gen – Protein trường
Đại h
ọc Y Hà Nội, đã hướng dẫn, sát cánh bên tôi khi thực hiện luận văn
này.
Các anh chị khoa xét nghiệm bệnh viện đa khoa tỉnh Hà Nam đã tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới cha mẹ, chồng con, anh chị
em, bạn bè đồng nghiệp đã động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học
tập và làm luận văn.
Hà nội, ngày 14 tháng 10 năm 2011.
Bs TrÞnh ThÞ QuÕ
(E coli sinh độc tố gây tiêu chảy)
E. coli
Escherichia coli
EAEC
Enteroadherent E.coli
(E.coli bám dính đường ruột)
EHEC
Enterohemorrhagic E.coli
(E.coli gây chảy máu đường ruột)
EIEC
Enteroinvasive E.coli
(E.coli xâm nhập đường ruột)
ELISA Enzym Linked Immuno Sorbent Assay
(kỹ thuật miễn dịch gắn enzym)
EltB Escherichia coli Heat Labile Toxin B
(tiểu đơn vị B độc tố
không chịu nhiệt của E.coli)
EPEC
Enteropathogenic E. col
(E. coli gây bệnh)
ETEC
Enterotoxigenic Escherichia coli
(E.coli sinh độc tố ruột)
LT Heat Labile Toxin (Độc tố không chịu nhiệt)
PBS Phosphate Buffer Saline-natri
(Dung dịch đệm phosphat)
PCR Polymerase Chain Reaction
Sandwich ELISA
ELISA kẹp chả
ST Heat Stable Toxin (Độc tố chịu nhiệt)

1.3.1. Trên thế giới 23
1.3.2. Việt Nam 23
1.3.3. Bệnh cảnh lâm sàng và dịch tễ học của ngộ độ
c thực phẩm do
ETEC 24
1.4. Các phương pháp xác định E.coli 25
1.4.1. Phương pháp định danh kinh điển 25
1.4.2. Thử nghiệm tạo váng và gây ngưng kết hồng cầu 26
1.4.3. Phương pháp thử nghiệm trên động vật thực nghiệm 26
1.4.4. Phương pháp miễn dịch học 27
1.4.5. Phương pháp nuôi cấy trên tế bào 30
1.4.6. Kỹ thuật sinh học phân tử 31
1.4.7. Kỹ thuật sắc ký miễn dịch: 36
Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 37
2.1. Đố
i tượng nghiên cứu 37
2.1.1. Chủng vi khuẩn và plasmid 37
2.1.2. Hóa chất, máy móc và thiết bị 37
2.1.3. Môi trường và đệm 39
2.1.4. Cặp mồi sử dụng 40
2.2. Phương pháp nghiên cứu 41
2.2.1. Sơ đồ nghiên cứu 41
2.2.2. Các phương pháp tiến hành nghiên cứu 41
Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 53
3.1. Khuyếch đại đoạn gen biến nạp EltB bằng kỹ thuật PCR 53
3.2. Nuôi cấy và tinh sạch plasmid pGEX và cắt bằng enzym giới hạn 53
3.3. Cắt đoạn gen EltB bằng các enzym giới hạn 54
3.4. Nối đoạn gen EltB vào vector pGEX 55
3.4.1. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật PCR 55
3.4.2. Kiểm tra đoạn gen biến nạp bằng kỹ thuật cắ


DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1. Hình ảnh E.coli trên kính hiển vi điện tử 16
Hình 1.2. Khuẩn lạc E.coli trên môi trường thạch Endo và Mac-conkey 16
Hình 1.3. Các bước trong Sandwich ELISA. 29
Hình 2.1. Sơ đồ các bước tiến hành nghiên cứu 41
Hình 2.2. Sơ đồ biến nạp EltB vào vector biểu hiện pGEX 44
Hình 3.1. Hình ảnh PCR khuếch đại gen EltB. 53
Hình 3.2. Hình ảnh plasmid pGEX sau khi đã được tinh sạch và cắt bằng enzym 54
Hình 3.3. Kiểm tra đoạn gen EltB sau cắt bằng enzym 54
Hình 3.4. Kiểm tra đoạn gen EltB sau khi biến nạp vào vector pGEX-13X

nhân do sử dụng thực phẩm không an toàn [28]. Tại các nước đang phát triển,
mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó
bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và gây tử vong khoảng 2,2 triệu người [23].
Ở Việt Nam ngộ độc thực phẩm là m
ột vấn đề đang được quan tâm hàng
đầu, theo ước tính của bộ Y tế, chỉ riêng năm 2001 đã có 4,2 triệu người bị
ngộ độc thực phẩm. Từ năm 2001-2006, cả nước ghi nhận được hơn 560.0000
ca tiêu chảy do ngộ độc thực phẩm, trong đó có 84 ca tử vong. Riêng trong 9
tháng đầu năm 2010 đã ghi nhận được hơn 750.000 ca tiêu chảy và 12 ca tử
vong liên quan đến thực phẩm. Tuy nhiên theo các chuyên gia thì số liệu
thựcph
ải gấp ít nhất 10 lần con số được công bố [6, 16].
Các bệnh liên quan đến thực phẩm hiện nay vẫn là một mối nguy cơ
chính tác động đến sức khỏe con người trên thế giới
[50]. Trong đó, vi khuẩn
E.coli sinh độc tố (Enterotoxigenic- ETEC) là một trong những nguyên nhân
gây bệnh tiêu chảy quan trọng cho trẻ em ở các quốc gia đang phát triển và
cho khách du lịch đến những vùng có dịch lưu hành. Thực phẩm và nước bị ô
nhiễm là những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi khuẩn này. Các
mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm cao với ETEC ở
vùng có dịch lư
u hành [25,43]. Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra vào
những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi cho vi khuẩn phát
triển trong thực phẩm và nước. ETEC có khả năng sinh độc tố chịu nhiệt (heat

12

stable toxin-ST) và độc tố không chịu nhiệt (heat labile toxin-LT). Độc tố
không chịu nhiêt có cấu trúc và chức năng như độc tố tả (cholera toxin). Vì
vậy người bị nhiễm độc tố này sẽ bị tiêu chảy cấp tính với mức độ mất nước


13

Chương 1
TỔNG QUAN

1.1. Tình hình vệ sinh an toàn thực phẩm
1.1.1. Trên thế giới
Theo thống kê của Trung tâm kiểm soát và phòng ngừa bệnh tật Mỹ (Center
for Disease Control and Prevention - CDC) thì hàng năm trên thế giới có khoảng
1,3 tỷ người tiêu chảy trong đó có 70% nguyên nhân do sử dụng thực phẩm không
an toàn [28]. Tại các nước đang phát triển, mỗi năm có khoảng 1/3 dân số bị
các bệnh do thực phẩm gây ra, trong đó bệnh tiêu chảy là thường gặp nhất và
gây tử vong khoảng 2,2 triệu ng
ười [23].
Tại Úc, mỗi ngày có khoảng 11.500 người bị ngộ độc thực phẩm. Ở Mỹ
hàng năm ước đoán có khoảng 5 đến 6 triệu người bị mắc bệnh do nguyên
nhân ăn uống và hơn 9.000 trường hợp tử vong [12, 49].
Một nghiên cứu khác về bệnh từ thực phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật gây bệnh
ở New - York Mỹ, phát hiện có sự gia tăng gấp 4 lần từ 1980 đến 1990 [18].

Ở Trung Quốc năm 1998 có 292.000 người bị ngộ độc thực phẩm do
virus viêm gan A làm tử vong 9 người. Năm 1999 xảy ra 591 vụ ngộ độc thực
phẩm với 17.971 người mắc, chết 108 người. Nguyên nhân chính là do thực
phẩm bị ô nhiễm vi sinh vật là 8.505 trường hợp, do hóa chất là 9.506 trường
hợp, thực vật hoặc động vật có chất độc là 2.719 trường hợp. Phần lớn các
trường hợp ngộ độc x
ảy tại các căng tin là 7.529 trường hợp [10]. Một thống
kê trong 10 năm xác định các yếu tố nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm tại
Trung Quốc cho thấy 93,24 % là nguyên nhân vi sinh vật, chỉ có 6,76% bởi

nhiễm vi sinh vật gây bệnh trong thực phẩm còn diễn ra phổ biến ở rất nhiều
địa phương khác trên cả nước [6].
Cùng với tình trạng ô nhiễm thực phẩm, ngộ độc thực phẩm ở Việt Nam
xảy ra cũng rất thường xuyên. Theo thống kê chưa đầy đủ c
ủa Cục ATVSTP,
từ năm 2000 đến năm 2007 trung bình mỗi năm có khoảng 181 vụ ngộ độc

15

thực phẩm xảy ra với khoảng 5.211 người mắc và khoảng 48 ca tử vong. Tỷ
lệ mắc ngộ độc thực phẩm trung bình là 6,05/100.000 dân, tỷ lệ chết là
0,06/100.000 dân/ năm. Tuy nhiên trên thực tế do chưa có hệ thống giám sát
đến cơ sở, việc thống kê báo cáo còn chưa được thiết lập nên số ca ngộ độc
thực phẩm thực tế hàng năm còn cao hơn rất nhiều. Theo ước tính của tổ chứ
c
y tế thế giới (WHO), ngộ độc thực phẩm hàng năm ở Việt Nam khoảng trên 8
triệu ca. Ngoài tình trạng ngộ độc thực phẩm cấp tính, ngộ độc thực phẩm
mạn tính cũng đang diễn ra khá phức tạp. Ngộ độc thực phẩm mạn tính
thường ít được chú ý vì biểu hiện lâm sàng không dữ dội như ngộ độc cấp
tính. Tuy nhiên, hậu quả của ngộ độ
c thực phẩm mạn tính còn nguy hiểm hơn
nhiều, dẫn đến biết bao hệ lụy cho sức khỏe cộng đồng.
Riêng trong quý IV năm 2010, cả nước xảy ra 18 vụ ngộ độc làm 4 người
tử vong, trong đó có 3 vụ ngộ độc lớn từ 30 người trở lên. Số người bị ngộ
độc là 323 người với 242 người nhập viện (Dinh dưỡng.com.vn)
Nguyên nhân chính là do vi sinh vật (gồm 4 nhóm vi khuẩn chính là
Salmonella, Streptoccocus, E.Coli và
Staphylococcus); do độc tố tự nhiên và
hóa chất. Có 5/18 vụ ngộ độc không xác định được nguyên nhân do không lấy
được mẫu thực phẩm lưu tại cơ sở.

Có nhiều cách phân chia loài E.coli nhưng cách phân loại theo týp huyết
thanh là hay được dùng hơn cả. Cách phân loại này dựa trên cấu trúc kháng
nguyên khác nhau có trên bề mặt tế bào vi khuẩn.
- Kháng nguyên O là quyết định kháng nguyên quan trọng nhất. Bản chất
là lipopolisaccarid nằm trên vách tế bào vi khuẩn. Có 171 loại kháng nguyên
O đã được xác định, trong đó có một số kháng nguyên có phản ứng chéo với
các vi khuẩn khác [35, 45].
- Kháng nguyên K là kháng nguyên bề mặt. Kháng nguyên K nằm bên
ngoài kháng nguyên O. Người ta đã xác định được khoả
ng 80 loại kháng
nguyên K [9, 35].
- Kháng nguyên H là kháng nguyên lông có bản chất hóa học là protein.
Có 56 loại kháng nguyên lông khác nhau đã được xác định [9, 35].
Dựa trên các kháng nguyên O, K và H người ta đã phân biệt được trên
700 týp huyết thanh khác nhau của E.coli
Phân loại dựa vào sự ly giải bởi phage đặc hiệu có khoảng 50 týp phage
Phân loại dựa vào tính chất gây bệnh chia làm 5 loại [22].
- EPEC (Enteropathogenic E.coli): E.coli gây bệnh đường ruột
- EHEC ( Enterohemorrhagic E.coli): E.coli gây chảy máu đường ruột
- ETEC (Enterotoxigenic E.coli): E.coli sinh
độc tố ruột
- EIEC (Enteroinvasive E.coli): E.coli xâm nhập đường ruột
- EAEC (Enteroadherent E.coli) E.coli bám dính đường ruột 
18

1.2.3. Đặc điểm sinh học
1.2.3.1. Hình thái học

19

- Trên môi trường thạch dinh dưỡng tạo các khuẩn lạc tròn ướt (dạng S)
màu trắng đục. Để lâu các khuẩn lạc trở nên khô nhăn (dạng R). Kích thước
khóm 2-3mm.
- Trên thạch máu: Có chủng tan huyết β, có chủng tan huyết dạng α.
- Trên môi trường chẩn đoán chuyên biệt như thạch Endo tạo ra các
khuẩn lạc tím có ánh kim.
- Trên môi trường Macconkey, SS tạo các khuẩn lạc màu hồng đỏ do vi
khuẩn E.coli có khả năng lên men đường lactose
- Trên các môi trường
đường: Lên men sinh hơi lactose, glucose,
galactose. Lên men không đều saccarose và không lên men dextrin, glycogen.
1.2.3.3. Tính chất sinh vật hóa học
Phản ứng Indol dương tính, Methyl Red (phản ứng MR) dương tính,
Voges-Proskauer (phản ứng VP) âm tính và Citrat âm tính, H
2
S âm tính, hoàn
nguyên nitrat thành nitrit, Lysine decarboxylaza dương tính.
1.2.4. Khả năng gây bệnh ở đường tiêu hóa
E.coli là vi khuẩn gây bệnh cơ hội.
Hiện tại người ta đã xác định được 5 loại E.coli có khả năng gây tiêu
chảy: ETEC , EPEC , EHEC, EIEC, EAEC.
♦ E.coli sinh độc tố ruột (ETEC)
Để gây được bệnh tiêu chảy, E.coli đòi hỏi phải có hai yếu tố độc lực đó là:
+ Khả năng bám và cư ngụ ở niêm mạc ruột.
+ Khả năng sản sinh ra độc tố.
• Các yếu tố bám dính:
- Khả năng bám và cư ngụ của ETEC vào tế bào màng nhầy biểu mô ruột
non là điều kiện quan trọng trong quá trình gây bệnh. Quá trình này được thực

gây bệnh cho người và động vật. Còn độc tố LT II hiếm khi được phát hiện
trên các chủng ETEC phân lập được ở trên người. Tuy nhiên độc đố LT II
không liên quan đến bệnh trên cả người và động vật. Do vậy, thuật ngữ LT
dùng để ám chỉ LT I.

21

LT là độc tố có trọng lượng phân tử thấp 86 kDa, bao gồm 28 kDa tiểu
đơn vị A và 11,5 kDa 5 tiểu đơn vị B (LTB). Khả năng bám dính của tiểu đơn
vị B vào thụ thể GM1 trên niêm mạc ruột non sẽ cho phép độc tố này xâm nhập
vào bên trong của tế bào niêm mạc ruột. Tiểu đơn vị A mang hoạt tính enzym
gồm 2 peptid

A
1
và A
2
nối với nhau bởi cầu nối disulfide [32, 42, 46].
Cơ chế gây tiêu chảy của LT: Sau khi 5 tiểu đơn vị B giúp độc tố bám
vào tế bào biểu mô ruột thì phần A được đẩy vào bên trong tế bào. Peptid A1
có hoạt tính enzym ADP- ribosyltransferase và chuyển một nửa phân tử ADP-
ribosyl từ NAP tới tiểu đơn vị A của protein gắn GTP. Gs làm hoạt hóa
enzym adenylate cyclase. Khi enzym adenylate cyclase hoạt hóa thì AMPc
nội bào tăng lên dẫn đến ức chế hấp thu Na
+
ở tế bào niêm mạc ruột có lông,
tăng bài tiết Cl
-
vào lòng ruột, gây tăng nhanh áp lực thẩm thấu trong lòng
ruột. Hậu quả là một lượng lớn nước từ trong tế bào được kéo ra ngoài lòng

(hermorrhagic colilic) và làm tổn thương mao mạch gây hiện tượng sưng phù
(ederma) rất nguy hiểm đến tính mạng do vi khuẩn E. coli thuộc nhóm này có
khả năng sinh độc tố stx (shiga toxin producing) như độc tố shiga của vi
khuẩn Shigella dysenteriae týp 1 gây độ
c tế bào. Độc tố này là nguyên nhân
gây ra viêm ruột chảy máu và hội chứng tan máu và urê huyết (HUS). Nhóm
EHEC bao gồm các týp: O26, O11, O104, O113, O145 và O157. Theo báo
cáo của trung tâm kiểm soát bệnh truyền nhiễm (CDC) thì trong những năm
gần đây E.coli O157:H7 chiếm khoảng 70% các vụ dịch ngộ độc do nhóm
EHEC (theo CDC, Center for Disease Control and prevention của Mỹ). Với
chủng E. coli O104:H4, từ trước đến nay chỉ gây ra các trường hợp mắc bệnh
lẻ tẻ và không gây dịch lớn, tuy nhiên trong thời gian vừa qua các týp huyết
thanh này
đã gây dịch với hàng ngàn trường hợp mắc bệnh và tử vong ở tại
Đức và một số quốc gia của liên minh châu Âu như đã trình bày ở bên trên.

23

1.3. Ngộ độc thực phẩm do ETEC
1.3.1. Trên thế giới
Trên thế giới, khoảng 210 triệu ca mắc và 380.000 ca tử vong, xảy ra
chủ yếu ở trẻ em do ETEC, theo số liệu của tổ chức Y tế thế giới. ETEC là
nguyên nhân phổ biến nhất gây tiêu chảy ở những nguời đi du lịch. Thực
phẩm và nước bị ô nhiễm - những phương tiện lây truyền chủ yếu của loại vi
khuẩn này. Các mẫu xét nghiệm thực phẩm và nước thường có tỷ lệ ô nhiễm
cao với ETEC ở vùng có dịch lưu hành. Nhiễm trùng do ETEC thường xảy ra
vào những mùa nóng, ẩm ướt sẽ là những điều kiện thuận lợi để vi khuẩn phát
triển trong thực phẩm và nước.
ETEC là một trong những nguyên nhân hàng đầu gây tiêu chảy ở trẻ
em các nước đang phát triển nhưng không phải là yếu tố chính gây tiêu chảy ở

ẫu xét nghiệm, tuy nhiên
chúng ta chưa có các thống kê về tình hình ô nhiễm của các E. coli gây bệnh
trong đó có ETEC, do vậy, trong tương lai, rất cần có những nghiên cứu sâu
hơn để đánh giá tỷ lệ lưu hành của các E. coli gây bệnh trong thực phẩm.
1.3.3.Bệnh cảnh lâm sàng và dịch tễ học của ngộ độc thực phẩm do ETEC
* Triệu chứng lâm sàng của ngộ độc thực phẩm do ETEC:
Bệnh tiêu chảy do ETEC thường bắ
t đầu đột ngột sau một thời gian ủ
bệnh ngắn 14- 50giờ. Biểu hiện lâm sàng là tiêu chảy toàn nước, không có
nhầy máu, ít khi có sốt và có nôn. Bệnh có thể diễn biến nhẹ, tự khỏi nhưng
cũng có thể diễn biến nặng giống tả.
*Dịch tễ học của ETEC
ETEC gây bệnh chủ yếu cho trẻ em và khách du lịch, thường gây ra các
vụ dịch nhỏ có tính chất lẻ tẻ. Có một s
ố vụ dịch tiêu chảy do ETEC đã được
miêu tả trong các y văn.
- Ở trẻ em ETEC gây tiêu chảy chiếm tỷ lệ 10-31 % [42].
- Người ta thấy rằng trong số những người đi du lịch bị tiêu chảy thì có
20 -40% là do ETEC.

25

- Bệnh thường xảy ra vào mùa nóng ẩm.
- Bệnh lây qua thực phẩm và ít gặp hơn ở nguồn nước bị nhiễm khuẩn.
Sự lây truyền qua thức ăn sam của trẻ cai sữa là rất quan trọng đối với nhiễm
bệnh ở trẻ nhỏ. Hiếm gặp bệnh lây trực tiếp qua tay bị nhiễm khuẩn [2, 35].
- Sự lưu hành của bệnh là nhiễm trùng gặp ch
ủ yếu ở các nước đang
phát triển. Ở các nước đang phát triển, trẻ em trong 3 năm đầu của cuộc đời
nhiều lần bị nhiễm trùng đường tiêu hóa do ETEC. Trẻ lớn và người lớn ít