XÁC ĐỊNH PHÂN TỬ LƯỢNG CỦA PHÂN TỬ ADN
MẠCH VÒNG

Nguyễn Thị Hồng Hạnh
Viện Công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG.

I. MỞ ĐẦU

Các ADN mạch vòng được phát hiện trong nhân của vi
khuẩn, trong ty thể, trong các lục lạp của thực vật cũng như
của động vật [1, 2, 3]. Một ADN vòng có thể là một đơn
thể (1a) hoặc một nhị thể với các cấu hình khác nhau. Các
ADN mạch vòng gồm hai phần hệt nhau có thể được sắp
xếp đối xứng (1b) hoặc không đối xứng (1c).

Trong điện trường của điện di thông thường, các ADN
mạch thẳng và ADN mạch vòng dịch chuyển trên cùng một
quĩ đạo. Tuy nhiên, trong từ trường của điện di xung -
PFGE, dưới ảnh hưởng của các vector không cân xứng với
hiệu điện thế và thời gian tác động khác nhau [4], các ADN
mạch thẳng và mạch vòng dịch chuyển trên các quĩ đạo
hoàn toàn riêng biệt và vì vậy có thể xa rời nhau. Dựa trên
nguyên tắc trên, điện di xung –PFGE không cân xứng đã
được sử dụng để phân biết và phân giải các ADN có các
cấu trúc khác nhau

Hình 1- Các ADN mạch vòng có thể là một đơn phân (a),
nhị phân đối xứng gồm hai nửa giống nhau sắp sếp theo
kiểu đầu - chụm - đuôi (b) hoặc không đối xứng có cấu trúc
đầu - chụm - đầu (c).


2. Phương pháp

- Tách chiết ADN.

Nguyên sinh động vật Leishmania được nuôi trong môi
trường GLSH đến giai đoạn log để tách chiết ADN. Ký
sinh trùng được ủ trong dung dịch tan (100 mM Tris pH 9 ,
200 mM EGTA, 2% EDTA và RNA-ase) trong 2 giờ ở
37
o
C. Sau khi bổ xung proteinase K (20g / ml) mẫu được
ủ tiếp trong vài giờ ở 55
o
C. ADN được làm sạch và tách
chiết bằng phenol.

- Cắt ADN của Leishmania

Các men ClaI và Xbal ( Promega) ở các nồng độ khác nhau
được dùng để cắt ADN của Leishmania. Phản ứng cắt được
tiến hành ở 37
o
C trong 2 giờ.

- Chuẩn bị PFGE block

Nguyên sinh động vật Leismania nuôi ở giai đoạn log được
dùng để chuẩn bị PFGE block theo phương pháp của Van
der Ploeg [8]


tử lượng khoảng 28 kb, vì khi cắt CD1 với ClaI, bốn đoạn
ADN với phân tử lượng là 3, kb ; 5., 2 kb ; 6 kb và 13 kb
đã được phát hiện như mong đợi.

Hình 2- Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể CD1 có trọng
lượng phân tử khoảng 28 kb. Bốn đoạn ADN với kích
thước thứ tự từ trên xuống dưới 1 (13 kb); 2 ( 6 kb); 3 (5,
2kb) và 4 (3, 7 kb) là sản phẩm cắt hoàn toàn của CD1 với
Cla I

Xác định cấu trúc của mạch vòng CD1. Việc xem xét phân tử lượng của CD1 được khởi xướng khi
rất ngẫu nhiên một đoạn ADN có phân tử lượng  56 kb
được phát hiện trong điện trường cuả điện di không cân
xứng PFGE. Đoạn ADN này lai đặc trưng với CD1 (hình 3)
và không lai với các ADN khác. Chúng tôi giả thiết đoạn
ADN mới phát hiện có thể có nguồn gốc từ CD1 với phân
tử lượng là 56 kb, nó là một nhị nguyên, cấu tạo từ hai nửa
giống nhau theo kiểu đầu – chụm - đuôi.
Các kết quả thực nghiệm cho thấy, khi hàm lượng men ClaI
cao (1g ADN / 1 đơn vị men), CD1 bị cắt hoàn toàn và
cho bốn mảnh ADN với kích thước 13kb ; 6kb ; 5, 2 kb và
3,7 kb (hình 4, hàng 1), còn khi lượng men ClaI bị giảm,
CD1 bị cắt hạn chế và cho các sản phẩm cắt khác với
trường hợp đầu (hình 4, hàng 2, 3, 4, 5). Các đoạn ADN
với kích thước 28 kb, 56 kb, các tín hiệu phóng xạ đi từ
giếng của gel quan sát như dự đoán. Như vậy, CD1 đã là
một nhị nguyên cân xứng có trọng lượng phân tử là 56 kb

B) Các nhiễm sắc thể của gel A được lai với CD1 phóng
xạ.

Hình 4- Sự phối hợp của các phương pháp cho phép xác
định cấu trúc nhị phân của CD1.
A. Các đoạn của ADN bị cắt bởi men Cla I ở các nồng độ
khác nhau ( 1: 1 g ADN /1 đơn vị Cla I; 2: 1 g / 0, 5 đơn
vị Cla I; 3: 1 g/ 0, 25 đơn vị Cla I; 4: 1 g / 0, 125 đơn vị
Cla I và 5: 1 g / 0, 065 đơn vị Cla I )
B. Lai Southern của gel A
Các mũi tên chỉ các phân tử lượng từ trên xuống dưới 56kb;
28 kb; 6 kp; 5,2 kb và 3,7 kb. Hình 5 - Yếu tố di truyền ngoài nhiễm sắc thể trong nhân
của L. mexicana M379, chủng Garnham CD1 là một nhị
nguyên cân xứng và có trọng lượng phân tử là  56 kb TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Julian. D and Smith. D. (1978). Plasmid-determine
resistance to antimicrobial agents. Ann. Rev. Microbial. 32
: 469 – 518.
2 - Liu, J; Salina, G; Gạịandran, N; Muithui, D;
Muyderman, S and Hamer, R (1991). DNA recombination
associated with short direct repeat. Mol. Biochem.
Parasitol. 50 : 351 - 355.
3 - Southern. E. M (1975). Detection of specific sequences
among ADN fragments separated by gel electrophoresis. J.

Harbor laboratory Press. Cold Spring Harbor.

SUMMARY

EVALUATION OF THE STRUCTURE AS WELL AS
THE MOLECULAR WEIGHT OF CIRCULAR DNAS

Nguyen Thi Hong Hanh
Institute of Biotechnology, NCST

Living organisms possessed ADNs of linear and circular
structuctures with different linear and circular
configurations. Circular DNAs in the genome of living
organisms could adopt different configurations as well as
different molecular weight. In some case, it is difficult to
determine exactly their molecular weight as well as their
configuration.

The extrachromochomal circular elements CD1 was found
in the genome of Garnham strain G1 of Leishmania
mexicana M379. It seemed to be a dimer with molecular
weight  57 kb with head-to-tail configuration. By using
three methods:

i) limit and complete restring genomic DNA by appropriate
enzymes

ii) Pulsed-Field gel Electrophoresis (PFGE)

iii) Southern blot analysis, we were able to evaluate the real