BIỂU HIỆN GEN LACZ MÃ HOÁ BETA-
GALACTOSIDAZA CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA
COLI ATCC 11105 TRONG E. COLI BL21

Trần Minh Trí, Nguyễn Thị Thanh Lịch, Trương Nam
Hải.
Viện công nghệ Sinh học, Trung tâm KHTN&CNQG.
Ngô Tiến Hiển
Viện Công nghiệp thực phẩm.

ĐẶT VẤN ĐỀ

-Galactosidaza (-D-galactosidase galactohydrolase,
EC3.2.1.32) xúc tác quá trình thuỷ phân galactosyl ở vị trí
tận cùng của hydratcacbon, glycoprotein và galactolipit [1].
-Galactosidaza thuỷ phân cơ chất từ đầu không khử, tại vị
trí -D-galactosyl tận cùng của -D-galactosizit [2, 3] để
chuyển hóa lactoza thành galactoza và glucoza [3, 4]. -
Galactosidaza có mặt phổ biến trong giới động vật, thực
vật, nấm và vi sinh vật. Ở vi khuẩn, cấu trúc và khối lượng
phân tử của -galactosidaza rất khác nhau. Enzym này có
thể tồn tại dưới dạng một tiểu phần như -galactosidaza của
Thermus sp.A4 (khối lượng phân tử 75 kDa), và dạng nhiều
tiểu phần như -galactosidaza của T. aquaticus (khối lượng
phân tử lớn hơn 700 kDa). -galactosidaza của E. coli tồn
tại dưới dạng một protein gồm 4 tiểu phần giống nhau,
chức năng hoạt động của mỗi tiểu phần độc lập với nhau và
có khối lượng phân tử là 116,353 kDa [2].

-Galactosidaza được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành
công nghiệp. Trong công nghiệp thực phẩm, -

gen của các hãng Perkin Elmer (Mỹ), Eppendorf (Đức),
Binder (Đức), Infors (Thuỵ Sỹ), Toledo (Thuỵ Sỹ),
Phamacia (Thuỵ Điển), Bio Rad (Mỹ), Sovall (Mỹ), MJ –
Research (Mỹ).

I.2. Chủng vi khuẩn

- Chủng vi khuẩn E. coli ATCC11105 là chủng cung cấp
nguồn gen LacZ mã hoá cho -galactosidaza.

- Chủng vi khuẩn E. coli BL 21[E omp hsd SB(rBmB)gal
dcm (DE3) plysS(Caml)] được sử dụng làm vật chủ cho
biểu hiện dòng gen.

I.3. Nhân gen LacZ mã hoá

-galactosidaza bằng kỹ
thuật PCR

Dựa vào trình tự gen LacZ của E. coli trong ngân hàng gen
quốc tế (gi:7428187), cặp mồi LacZF1-Nco I và LacZR2-
Xho I được thiết để dùng cho PCR (hãng GENSET
Singapore Biotech.Pte Ltd tổng hợp). PCR được tiến hành
như sau: Biến tính ADN ở 94
0
C trong 3 phút; nhân ADN
bằng 25 chu trình nhiệt với các bước sau: 94
0
C trong 1
phút, 55

0
C, sau 2 giờ
(OD
600nm
= 0.6), môi trường được bổ sung chất cảm ứng
IPTG (nồng độ cuối cùng 1mM) và tiếp tục nuôi lắc 200
v/phút ở nhiệt độ 20
0
C. Tế bào được thu sau 12 giờ cảm
ứng.

I.6. Tinh sạch

-galactosidaza

Chuẩn bị cột 1.5x15 cm. Chuyển 4 ml dịch Talon Resin lên
cột. Cân bằng cột bằng đệm: 50 mM sodium phosphat; 300
mM NaCl, pH 7,4. Tinh chế mẫu qua cột ái lực: ly tâm thu
tế bào sau cảm ứng ở điều kiện 5000 v/phút trong 10 phút ở
4
0
C. Hoà tế bào E. coli trong 10 ml đệm Tris 10 mM pH 8;
0,2 phenylmethylsulphonyl fluoride. Tế bào được phá bằng
lyzozyme khi ủ ở 30
0
C, 60 phút. Dịch sau khi phá được li
tâm ở 13.000 v/phút trong 10 phút. Enzym từ dịch nổi được
tinh chế nhờ cột ái lực chứa các hạt sepharose gắn Co
2+
.

1mol o-nitrophenil trong 1 phút ở 30
0
C theo điều kiện thí
nghiệm.

I.9. Động học enzym

Phân tích động học của -galactosidaza được thực hiện với
các nồng độ cơ chất khác nhau: 0,02 mg, 0,04 mg, 0,06mg,
0,08 mg, 0,1 mg, 0,2 mg, 0,3mg, 0,4mg, 0,5 mg với lượng
enzym cho phản ứng là 300 ng. Tổng thể tích cho mỗi phản
ứng là 1ml hỗn hợp, phản ứng diễn ra ở 300C trong 5 phút.
Dừng phản ứng bằng 0,5 ml Na
2
CO
3
và OD được đo ở
bước sóng 420 nm. Kết quả được xử lý bằng chương trình
toán học trên máy tính. Từ đó, các thông số động học của
enzym K
m
và k
cat
được xác định [7].

II. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

1. Nhân gen LacZ bằng PCR

Trong kỹ thuật PCR, hai đoạn mồi được chọn nhằm giới


2. Đưa gen LacZ vào vectơ biểu hiện pET22b(+)

Vectơ pET được Studier và cộng sự thiết kế dựa trên hệ
điều khiển promotơ mạnh có nguồn gốc từ phage T7. Hiện
nay, có hơn 42 dạng vectơ pET được sử dụng cho biểu hiện
trong 15 vật chủ khác nhau. Vectơ pET-22b(+) có chiều dài
5493 bp , được sử dụng chủ yếu cho tách dòng và biểu hiện
gen tái tổ hợp trong E. coli. pET-22b(+) mang gen lac I mã
hoá cho protein repressơ, can thiệp vào quá trình điều hoà
hoạt động của promotơ trên vectơ và được cảm ứng bằng
cơ chất tổng hợp IPTG. Gen pelB mã hoá cho peptit tín
hiệu dẫn của các protein tiết tái tổ hợp ra bên ngoài màng tế
bào [Cat. No 69744-3]. Vectơ biểu hiện pET-22bLacZ
được thiết kế theo sơ đồ 1.

Sơ đồ 1: Thiết kế vectơ biểu hiện pET-22bLacZ mang gien
mã hoá cho -galactosidaza của chủng vi khuẩn E. coli
ATCC 11105 Đoạn gen LacZ được nhân lên bằng PCR của chủng E. coli
ATCC 11105, mục đích đoạn gen này đưa vào vectơ pET-
22b(+) tại hai điểm cắt Nco I và Xho I ở trong vùng đa nối.
Để đưa đoạn LacZ vào vectơ thì sản phẩm PCR và ADN
plasmit phải được cắt triệt để bằng hai enzym hạn chế Nco
I và Xho I. Đoạn gen lacZ và plasmit sau khi cắt được nối
với nhau bằng ADN-ligaza. Sản phẩm nối ghép được biến
nạp vào E. coli BL21 bằng phương pháp xung điện. Sau khi
chọn lọc và kiểm tra các thể biến nạp chúng tôi đã chọn


Kết quả là trên đĩa có một vạch khuẩn lạc mầu xanh và một
vạch khuẩn lạc mầu trắng. Vạch khuẩn lạc mầu xanh đậm
(do -galactosidaza thuỷ phân X-gal tạo màu xanh) là
những tế bào chứa vectơ pET-22bLacZ đã được biểu hiện.
Vậy -galactosidaza tái tổ hợp đã được biểu hiện trên môi
trường thạch đĩa LB + Amp + IPTG + X-gal.

4. Tinh sạch

-galactosidaza bằng cột sắc kí ái lực

* Kiểm tra lượng

-galactosidaza ở dạng tan

-galactosidaza tái tổ hợp biểu hiện trong E. coli được tổng
hợp lượng khá lớn khi có mặt chất cảm ứng mạnh IPTG.
Quá trình tổng hợp -galactosidaza tái tổ hợp quá mạnh
nên dễ dẫn tới hiện tượng lỗi trong quá trình hình thành cấu
trúc hoạt động của enzym. Các protein bị lỗi thường tồn tại
ở dạng không tan, thể vùi và không có hoạt tính. Khi cảm
ứng cho biểu hiện ở 37
0
C -galactosidaza hầu như tồn tại
dưới dạng không tan. Để khắc phục hiện tượng này, cần
phải thay đổi một số điều kiện khi cảm ứng sao cho tế bào
tổng hợp -galactosidaza chậm hơn. Khi nuôi cảm ứng ở
nhiệt độ thấp hơn: 30
0

Đ/C 5: Thang protein chuẩn.

Ảnh trên cho thấy, -galactosidaza được thu lại dưới dạng
tinh sạch, trọng lượng khoảng 116 kDa.

4. Xác định hoạt tính

-galactosidaza bằng cơ chất
ONPG
Hàm lượng -galactosidaza được tính theo phương pháp
Bradford là 0,05 mg/ml. Hoạt tính riêng -galactosidaza
được xác định khi cho phản ứng thuỷ phân cơ chất tổng
hợp ONPG (o-nitrophenyl -D- galactopyranoside). Phản
ứng enzym được tiến hành với các nồng độ cơ chất ONPG
khác nhau, phản ứng được ủ ở 30
0
C trong 5 phút. Khi hỗn
hợp phản ứng chuyển sang mầu vàng thì dừng phản ứng
bằng 0,5 ml Na
2
CO
3
1M. Hoạt tính enzym được xác định
bằng cách đo độ hấp phụ của hỗn hợp sau phản ứng ở OD
420 nm
. Từ đó các thông số K
m
, k
cat
được xác định như trong


Lời cảm ơn

Công trình được thực hiện theo hợp đồng của đề tài KC –
04 – 07 “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzym trong chế
biến một số nông sản thực phẩm”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Obon J. M., Castellar M. R., Iborra J. L., Manjon A.,
2000, “-Galactosidase immobilization for milk lactose
hydrolysis: a simple experimental and modeling study of
batch and continuous reactors”, Biochemical Education, 28,
164-68.
2. Leahy M., Vaughan P., Fanning L., Fanning S.,
Sheehan D., 2001, “Purification and some characteristics of
a recombinant dimeric Rhizobium meliloti -galactosidase
expressed in Escherichia coli”, Enzyme and Microbial
technology, 28, 682-688.
3. Smith D. L, Gross K. C., 2000, “A Faminly of at Least
Seven -galactosidase Genes is Expressed during Tomato
Fruit Development”, Plant Physiology, 123, 1173-1183.
4. Kim C., Chung H., Lee M., Choi L., Kim M., 1999,
“Development of dried liposomes containing -
galactosidase for the digestion of lactose in milk”,
International Journal of Pharmaceutics, 183, 185-193.
5. “Talon Metal Affinity Resins User Manual PT1320
(PR16704)”, 2001, Clontech, 1-39.
6. Daniel M. Bollag., Michael D. Rozcki.,Stuartj. E.
delstein., 1996 Protein method, p. 63-67.

have been cloned and/or isolated from a range of microbial
sources. One well-characterised -galactosidase is from E.
coli, which is a tetramer of identical 116 kDa subunits for
which the three-dimensional structure available. In this
research, we have been successful in cloning and over-
expressing of the gene encoding -galactosidase from E.
coli ATCC11105 in E. coli BL21. The whole coding
sequence for mature -galactosidase protein was PCR
amplified by a pair of primers containing restriction sites of
Nco I and Xho I in forward and reverse primer,
respectively. PCR product was cut by Xho I and Nco I and
ligated into Xho I - Nco I pre-cut pET22b(+) vector by
DNA T4 – ligase. Obtained recombinant vector was
transformed into E. coli BL21 for selection of -
galactosidase overexpressing under induction with 1mM
IPTG. First, desired clone was selected by blue colony
indication on agar medium containing IPTG and X-gal. It is
later confirmed by a big, clear protein band of around 116
kDa on SDS- PAGE of supernatant of SDS -treated cells.
Next, the enzyme was purified by affinity chromatography
(Talon Metal Affinity Resins). Finally, the concentration of
the enzyme were determined by standard Bradford of 0,05
mg/ml. The specific activity of the enzyme was determined
using ONPG as subtrate of 157.6 U/mg. This enzyme
kinetic has K
m
values for ONPG of approximately 0.664
mM and Kcat approximately 86467 s-1.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Đinh Duy Kháng.