PHÁT HIỆN VIRUT GÂY BỆNH ĐẦU VÀNG TRÊN
TÔM SÚ BẰNG KỸ THUẬT RT-PCR

Phan Quốc Việt, Nguyễn Hoàng Chương, Phạm Anh
Tuấn, Nguyễn Văn Hảo, Hồ Huỳnh Thuỳ Dương
Khoa Sinh học - Trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên -
ĐHQG Tp HCM
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản I
Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng Thuỷ Sản II

TỔNG QUAN

Virut gây bệnh đầu vàng (YHV-Yellow Head Virus), tìm
thấy đầu tiên tại Thái Lan vào đầu những năm 1990, có vật
chất di truyền là ARN. Đây là một trong những tác nhân
chính gây bệnh đầu vàng ở tôm cùng với một số virut
tương cận như GAV (Gill-Associated Virus) và LOV
(Lymphoid Organ Virus). YHV tác động trên tôm chủ yếu
ở giai đoạn tôm con đến tôm gần trưởng thành. Tôm bệnh
sẽ chết hàng loạt sau 2 - 4 ngày, với sự xuất hiện màu vàng
ở phần đầu ngực và sự nhạt màu của toàn cơ thể. Các quan
sát mô bệnh học cho thấy tình trạng hoại tử của những tế
bào có nguồn gốc ngoại phôi bì và trung phôi bì cùng với
sự hình thành những thể vùi ưa kiềm trong tế bào chất.

Với khả năng lây nhiễm và gây chết nhanh, bệnh gây ảnh
hưởng không nhỏ đến nền kinh tế của những quốc gia có
nghề nuôi tôm phát triển. Do chưa có thuốc chữa trị đặc
hiệu nên công tác phòng ngừa và chẩn đoán bệnh sớm là rất
cần thiết. Các phương pháp chẩn đoán truyền thống như mô
bệnh học hay dựa trên kinh nghiệm của người nuôi không

YHV được công bố (Tang & Lightner, 1999). Các đoạn
mồi này gồm đoạn mồi xuôi YHVf và các đoạn mồi ngược
YHVr và YHVi với trình tự như sau : YHVf 5'-GTGACC
ATYTYAACTGCAAGATCTCACGRCAACTCA-3',
YHVr 5'-CTGCYACTGAATTTCC
GACGAGAGTGTTAGGAGG-3', YHVi 5'-
GTCTCACACACATGGACTTC-3'.
đoạn mồi do hãng GENSET OLIGO (Singapore) tổng hợp
và cung cấp.

Phương pháp RT-PCR : bao gồm hai bước RT và PCR.
Trong bước RT, phản ứng được thiết lập với1 hạt bead RT-
PCR (Amersham), 1 l đoạn mồi YHVr, 19 l ARN, ủ ở
42
0
C-45 phút. Để tiến hành phản ứng PCR, cho thêm vào
hỗn hợp RT 2 l đoạn mồi YHVf, 1.5 l đoạn mồi YHVi
và nước vừa đủ 50 l. Chương trình PCR : 95
0
C-3'; 15 chu
kỳ 94
0
C-30", 62
0
C-30", 72
0
C-30"; 36 chu kỳ 94
0
C-30",
48

đoạn ADN có kích thước 186 bp từ sản phẩm PCRI.

Hình 2 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm
PCRI và II từ RNA YHV.
1,2 : Sản phẩm PCRI (303 bp);
3 : Thang X 174 Hae-III;
4,5 : Sản phẩm PCRII (186 bp). Hình 3 : Kết quả điện di trên gel agarose 2% các sản phẩm
PCRII từ RNA YHV trộn với dịch chiết tôm
1 : Thang 186 bp
2, 3, 4, 5 : 1 l, 5 l, 10 l, 15l RNA YHV trộn với dịch
chiết tôm Các kết quả trên cho thấy tín hiệu dương tính nhận được có
cường độ cao, với kích thước như dự kiến ; đồng thời
không thấy sản phẩm ký sinh. Phản ứng tiến hành trên dịch
chiết tôm kết hợp với ARN YHV cũng cho kết quả dương
tính rõ và có cường độ tương ứng với hàm lượng ARN
trong mẫu. Điều này cho thấy đoạn mồi và chương trình
PCR hoạt động tốt.
Tính đặc hiệu của sản phẩm PCR : Chúng tôi sử dụng mẫu
dò đặc hiệu cho YHV để kiểm tra tính đặc hiệu của các sản
phẩm PCR nhận được. Phản ứng Southern blot được tiến
hành trên các sản phẩm PCR khác nhau, được nhân bản từ
ADN MBV (Monodon Baculovirus), ARN YHV và ADN
WSSV (White Spot Syndrome Virus).


đoán mô học là dương tính với bệnh đầu vàng nhưng lại
cho kết quả RT-PCR âm tính. Điều này có thể do nhiều
nguyên nhân : (1) đoạn mồi không phát hiện được các biến
chủng của YHV địa phương, (2) Mẫu không được bảo quản
tốt dẫn đến sự phân hủy ARN virut, (3) Bệnh do một virut
tương cận nhưng không phải là YHV.

Hình 6: Kết quả phát hiện YHV trên 20 mẫu tôm nghi
nhiễm đầu vàng.
11: Thang 100 bp ; 1 - 21: Sản phẩm PCR từ các mẫu tôm
nghi nhiễm. KẾT LUẬN:

- Quy trình RT-PCR do chúng tôi thiết lập phát hiện được
YHV với độ đặc hiệu cao và độ nhạy là 6pg ARN YHV
tinh sạch.

- Trên 20 mẫu tôm sú nghi nhiễm, quy trình phát hiện 02
mẫu nhiễm YHV.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1- Cowley J.A., Dimmock C.M., Wongteerasupaya C.,
Boonsaeng V., Panyim S. & Walker P.J. 2001. Yellow
head virus from Thailand and gill-associated virus from
Australia are closely related but distinct prawn viruses. Dis.
Aquat. Org.,
2- Tang K.F.J. & Lightner D.V. 1999. A yellow head virus

genetic polymorphism of YHV or the presence of other
members of the YHCV.

ACKNOWLEDGMENTS: We gratefully acknowledge J.A.
Cowley who provided YHV RNA.

Ngưòi thẩm định nội dung khoa học: GS. Lê Đình Lương