XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ NUCLEOTID VÙNG SIÊU
BIẾN I Ở NGƯỜI VIỆT NAM

Trần Mỹ Linh, Vũ Thị Thư, Phan Minh Tuấn, Lê
Quang Huấn, Lê Trần Bình
Viện Công nghệ sinh học

GIỚI THIỆU

ADN của hệ gen ty thể ở người có 16 569 cặp bazơ với 2
vùng chính: vùng mã hoá và vùng điều khiển (Anderson,
1981). Vùng mã hoá mang thông tin di truyền cho các phân
tử sinh học khác nhau tham gia vào quá trình tạo năng
lượng của tế bào (13 gen mã hoá cho các phân tử protein,
22 gen mã hoá cho tRNAs và 2 gen mã hoá cho rRNA),
vùng điều khiển chịu trách nhiệm điều khiển phân tử
mtADN (Parsons et al, 1997; Hagelberg et al. 1987; Lee et
al. 1999). Trong vùng điều khiển lại chứa 2 vùng biến đổi
có sự khác nhau rất lớn trong quần thể (Greenberg et al.
1983), chúng được gọi là vùng siêu biến I (342 cặp bazơ)
và vùng siêu biến II (268 cặp bazơ). ADN có tính bảo thủ
cao trong các thế hệ do chúng được cấu tạo dạng mạch
vòng nên ít chịu sự tác động của các tác nhân gây đột biến,
hơn nữa không có hiện tượng tái tổ hợp như ADN nhân vì
chúng chỉ có một bản sao từ mẹ (Case and Wallace 1981;
Giles et al. 1980). Mặt khác, ADN ty thể lại có sự đa hình
cao nhờ sự có mặt của 2 vùng siêu biến (Budowle et al.
1999, Kalmar at al. 2000).

Các công trình nghiên cứu gần đây cho thấy thông tin của
hệ gen ty thể không chỉ giúp ta xác định mối quan hệ huyết

nghiệm đều là những hoá chất tinh khiết của các hãng
Sigma và Merck.

Phương pháp tách chiết ADN từ các mẫu máu

ADN thu được từ các mẫu máu đã chống đông bằng EDTA
theo quy trình dưới đây có độ tinh sạch cao và có thể sử
dụng cho các thí nghiệm về sinh học phân tử như PCR, cắt
enzym hạn chế

1. Mẫu máu (1ml) máu trộn đều với đệm SSC (0,8 ml),
ly tâm 12 000 vòng/phút thời gian 1 phút. Loại bỏ dịch ly
tâm.

2. Thêm 1ml đệm SSC, vortex, sau đó ly tâm như trên và
loại bỏ hoàn toàn dịch ly tâm.

3. Thêm 375 l 0,2M NaOAc, vortex, sau đó thêm 25l
SDS 10% và 5 l proteinase K (20mg/ml H
2
O), vortex, ủ 1
giờ ở 55
0
C.

4. Thêm 120 l phenol:chloroform:isoamylalcohol
(25:24:1), vortex, ly tâm 2 phút, tốc độ 12 000 vòng/phút.
Hút lớp nước phía trên vào ống mới, thêm 1ml cồn 100%
lạnh, ủ ở –20
0

(Đệm chiết gồm 10 mM Tris, 100 mM NaCl, 39 mM DTT,
10 mM EDTA and 2% SDS, proteinase K, 10g/ml).

3. Chiết 1 lần với phenol: chloroform: isoamyl alcohol
(25:24:1), 2 lần với chloroform.

4. Dịch chiết chứa ADN được cô đặc trong ống
Microcon-100 (Amicon).

Nhân đoạn gen vùng siêu biến và xác định trình tự

Nhân đoạn gen vùng siêu biến được tiến hành với cặp mồi
LOOP460F/ LOOP460R và chu trình nhiệt như sau: 94
0
C-3
phút và 35 chu kỳ ( 94
0
C-30 giây, 56
0
C-1 phút, 68
0
C-1 phút
30 giây), ổn định 8 phút ở 72
0
C và kết thúc ở 4
0
C. Sản
phẩm PCR được gắn trực tiếp vào vector pCR

2.1, sau đó

0
C-30 giây, 56
0
C-1 phút,
68
0
C-1 phút 30 giây), ổn định 8 phút ở 72
0
C và kết thúc ở
4
0
C.

Sản phẩm PCR được kiểm tra bằng điện di trên gel agaroza
1 %. Kết quả được trình bầy trên hình 2.

Hình 2: Kết quả kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose
1%
Kênh 1: Chỉ thị phân tử ADN
Kênh2: Sản phẩm PCR từ mẫu tóc
Kênh3: Sản phẩm PCR từ mẫu máu Tách dòng đoạn gen vùng siêu biến I

Sản phẩm PCR không cần phải qua một bước tinh chế nào
mà được sử dụng trực tiếp cho phản ứng gắn với vector
tách dòng: trộn sản phẩm PCR (1l) với vectơ pCR

2.1

enzym hạn chế EcoR I
trên gel agarose 0,8%
Kênh 1: ADN plasmit chưa cắt với enzym hạn chế EcoR
I
Kênh 2, 3: ADN plasmit của các khuẩn lạc khác nhau
cắt với enzym hạn chế EcoR I
Kênh 4: Sản phẩm PCR trước khi gắn vào vector
Kênh 5: Chỉ thị phân tử ADN Xác định trình tự đoạn gen vùng siêu biến I

ADN plasmit sau khi được kiểm tra và khẳng định đã được
gắn sản phẩm PCR được gửi cho “BIOSERVICE UNIT”,
Bangkok, Thailand để xác định trình tự. Kết quả xác định
trình tự nucleotid sản phẩm PCR từ mẫu máu người Việt
nam (sản phẩm PCR từ mẫu tóc chưa gửi xác định trình tự)
như sau:
So sánh trình tự nucleotid của sản phẩm PCR mà chúng tôi
thu được với trình tự vùng siêu biến trong mtADN đã được
Anderson, 1981 công bố chúng tôi thu được kết quả như
sau: REF: Trình tự nucleotid vùng siêu biến I đã được công bố
trong Ngân hàng gen Quốc tế.
VN1: Trình tự nucleotid vùng siêu biến I mà chúng tôi đã

mtADN mà Anderson và cộng sự đã công bố trong ngân
hàng gen Quốc tế.

3. Sự sai khác về trình tự nucleotid xẩy ra tại các vị trí 16
111, 16 223 và 16 362 trong ADN ti thể. Sự sai khác này
đều là các đột biến thay thế: ở vị trí 16 111 và 16 223 gốc
cytozin được thay thế bằng gốc timin (C >T), còn vị trí 16
362 thi gốc timin lại được thay thế bằng cytozin (T >C).
Sự sai khác này đã làm thay đổi vị trí nhận biết của các
enzym cắt hạn chế cũng như xuất hiện thêm các vị trí nhận
biết của các enzym cắt giới hạn mới: xuất hiện vị trí nhận
biết của enzym Bsr I ở vị trí 16 108, enzym Hph I ở vị trí
16 104, enzym Mae III ở vị trí 16 110 và mất đi vị trí nhận
biết của enzym cắt hạn chế Mnl I ở vị trí 16 235

TÀI LIỆU THAM KHẢO

1. Anderson, S., Bankier, A. T., Barrell, B. G., de Bruijn,
M. H. L., Coulson, A. R., Drouin, J., Eperon, I. C.,
Nierlich, D. P., Roe, B. A., Sanger, F., Schreier, P. H.,
Smith, A. J. H., Staden, R., and Young, I. G. Sequence and
organization of the human mitochondrial genome, Nature
(1981) 290: 457–465.
2. Case, J. T. and Wallace, D. C. Maternal inheritance of
mitochondrial DNA polymorphisms in cultured human
fibroblasts, Somatic Cell Genetics (1981) 7:103–108.
3. Giles, R. E., Blanc, H., Cann, H. M., and Wallace, D.
C. Maternal inheritance of human mitochondrial DNA,
Proceedings of the National Academy of Sciences (1980)
77:6715–6719.

mitotypes, Human Genetics (1997) 100:167–171.
11. Parsons TJ, Muniec DS, Sullivan K, Woodyatt N,
Alliston-Greiner R, Wilson MR, Berry DL, Holland KL,
Weedn VW, Gill P, and Holland MM (1997)A High
Observed Substitution Rate in the Human Mitochondrial
DNA Control Region, Nature Genetics, 15, pp. 363-368.
12. Willard JM, Lee DA, and Holland MM, (1998),
Recovery of DNA for PCR Amplification from Blood and
Forensic samples Using a Chelating Resin, Methods in
Molecular Biology: Forensic DNA profiling Protocols, 98,
pp. 9-18.
13. Budowle B, Wilson MR, DiZinno JA, Stauffer C,
Fasano MA, Holland MM, Monson KL (1999),
Mitochondrial DNA Regions HVI and HVII Population
Data; Forensic Science International, June 1999.
14. Lee DA, Willard JM, Ross JP, Katz DE, Holland
MM, (1999) The Use of DNA Analysis in the Identification
and Re-association of Remains Recovered from TWA
Flight 800 and KAL Flight 801, The 6th Indo Pacific
Congress on Legal Medicine and Forensic Sciences,
INPALMS-1998-KOBE, Yoshitsugu Tatsuno (ed.), pp.
249-252.
15. Hagelberg E., Sykes B. and Hedges R (1989) Nature,
342, 485.
16. Hanni C., Brousseau T., Laudet V. and Stehelin D.
(1995) Nucl. Acids Res., 23, 881-882.
17. Kalmar T., Bachrati CZ., Marcsik A. and Rasko I.
(2000) Nucl. Acids Res., 28, E67-e67.

SUMMARY

substitution C >T at nucleotide position 16,111; 16,223
and substitution T >C at nucleotide position 16,362. These
substitution to appear recognized site for restriction enzyme
Bsr I at position 16,108, and restriction enzyme Hph I at
nucleotide position 16,104, and enzyme Mae III at
nucleotide position 16,110 but disappear recognized site for
restriction enzyme for Mnl at position 16, 235.

Those, further systematic studies on mtDNA from
Vietnamese population could be done based on the use of
optimized protocols.

Người thẩm định nội dung khoa học: TS. Nguyễn Thị Kim
Cúc.