20 Các chất đồng vị phóng xạ thƣờng dùng để đánh dấu mẫu dò là
32
P,
35
S và
3
H.
Trong đó
32
P đƣợc sử dụng nhiều nhất và nó phát tia ß có năng lƣợng rất cao nên tín
hiệu nhận đƣợc rõ. Nhƣng bên cạnh đó thì
32
P có hai nhƣợc điểm lớn là:
- Chu kỳ bán rã ngắn (15 ngày) nên phải sử dụng nhanh. Mẫu dò đƣợc đánh dấu
bằng
32
P không sử dụng đƣợc nhiều lần trong một thời gian dài dẫn đến chi phí cao.
- Do năng lƣợng rất cao của tia xạ nên tín hiệu nhận đƣợc không tinh mà
khuếch tán trên một vùng rộng.
35
S phát tia có năng lƣợng thấp lại có chu kỳ bán rã dài (2 – 3 tháng) nên giúp
giải quyết đƣợc nhƣợc điểm trên của
32
P nhƣng năng lƣợng do
35
Hình 2.5: Cơ chế phát hiện probe
đánh dấu huỳnh quang
Hình 2.4: Cơ chế phát hiện các phân tử lai có probe đánh dấu bằng biotin.
Hình a: Streptavidin có gắn với chất phát huỳnh quang, hình b: phát hiện
biotin kết hợp với khuếch đại tín hiệu (Tyramide signal amplification).
phân tử lai đƣợc phát hiện khi cho ligand của nó là avidin (hay streptavidin) vào phản
ứng. Avidin (hay streptavidin) trƣớc đó có gắn với một nhóm phát huỳnh quang hay
một enzyme xúc tác cho phản ứng tạo màu. Kết quả là những tín hiệu phát sáng hay tín
hiệu màu nhận đƣợc trên màng lai. Hệ thống huỳnh quang: các probe đƣợc đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang
sẽ phát sáng khi quan sát dƣới tia UV (ultra violet). Cách đánh dấu này rất hữu ích khi
kiểm tra các mẫu vi khuẩn hoặc mẫu tế bào trực tiếp dƣới kính hiển vi. Thuận lợi của
hệ thống đánh dấu này là cùng một lúc ta có thể lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với
các chất phát huỳnh quang khác
nhau và các phân tử lai đƣợc
phát hiện cùng một lúc.
Hệ thống dùng kháng
thể: ngƣời ta dùng một nhóm
kháng nguyên gắn vào probe và
phát hiện sự hiện diện của probe
này bằng các kháng thể đặc hiệu. Các kháng thể này phải đƣợc đánh dấu bằng các tác
nhân đánh dấu nhƣ trên để nhận biết. Hệ thống này đƣợc dùng rộng rãi hiện nay nhất
là hệ thống đánh dấu bằng Digoxigenin – AntiDigoxigenin/Alkaline phosphatase (DIG

sẽ in dấu ấn lên một phim và kết quả thu nhận là những chấm trên phim.
Hệ thống dùng chất phát quang bằng phản ứng hóa học: ngƣời ta dùng các chất
hóa học có khả năng phát sáng để đánh dấu vào probe và phát hiện chúng bằng cách
đo ánh sáng phát ra bằng một máy đo đặc hiệu.
23 Hình 2.8: Lai trên nhiễm sắc
thể của nấm Thinopyrum
ponticum
Hình 2.7: Lai trên khuẩn lạc
II.5.6 Các phƣơng pháp lai tại chỗ ISH
II.5.6.1 Lai trên khuẩn lạc
Phƣơng pháp này đƣợc sử dụng để
phát hiện dòng vi khuẩn có mang vector tái
tổ hợp cần tìm trong một ngân hàng gen.
Ngân hàng gen (tức tập hợp các
dòng vi khuẩn tái tổ hợp) đƣợc trải trên
mặt thạch của đĩa petri. Sau khi các khuẩn
lạc đạt kích thƣớc xác định, ngƣời ta thu
lấy dấu ấn của chúng bằng cách áp một
màng lai lên mặt các khuẩn lạc. Trƣớc khi
thực hiện thao tác này, cả đĩa thạch và
màng lai đều phải đƣợc đánh dấu trƣớc để

biểu hiện cũng nhƣ tƣơng tác giữa mRNA với các thành phần khác của tế bào và mô.
Nghiên cứu trên DNA và RNA đã tách chiết và tinh sạch không cho phép thu nhận các
thông tin vừa kể. Trong trƣờng hợp đó ngƣời ta thƣờng hay sử dụng phƣơng pháp lai
trên tế bào và mô.
Mô đƣợc xử lý bằng các phƣơng pháp mô học (cố định, khử nƣớc, tẩm paraffin,
cắt thành từng lát mỏng, đính trên lame) và dùng để thực hiện lai. Thao tác xử lý mẫu
lai và phát hiện phân tử lai tƣơng tự nhƣ lai trên nhiễm sắc thể. Kết quả đƣợc đọc trực
tiếp trên lame nhờ kính hiển vi quang học.
Phương pháp này được sử dụng trong các trường hợp sau:
Đối tƣợng nghiên cứu có tổ chức phức tạp, bao gồm nhiều tập hợp tế bào khác
nhau nhƣ não bộ. Ở đây ngƣời ta có thể định chính xác vị trí và sự phân bố của một
DNA hay mRNA trong một nhóm tế bào chuyên biệt của tổ chức. Các thông tin này sẽ
góp phần vào việc xác định vai trò của mRNA trong tổ chức đó.
Các phƣơng pháp miễn dịch tế bào cho phép phát hiện một protein chuyên biệt
thông qua kháng thể đặc trƣng của nó. Khi phối hợp phƣơng pháp miễn dịch tế bào và
lai tại chỗ, ngƣời ta sẽ phát hiện đồng thời mRNA và protein của nó. Từ đó xác định
đƣợc mối tƣơng quan giữa hoạt động phiên mã và dịch mã của một gen.
25 Bằng cách lai nhiều lát cắt liên tục (có cấu trúc gần nhƣ đồng nhất) với nhiều
mẫu dò khác nhau, ngƣời ta có thể xác định vị trí, sự phân bố và tƣơng tác giữa các
mRNA cùng tham gia vào một quá trình sống.
Hiện nay kỹ thuật đánh dấu mẫu dò bằng hóa chất đã có nhiều tiến bộ rất lớn.
Điều này đã tạo những bƣớc nhảy vọt lớn cho các phƣơng pháp lai tại chỗ, đặc biệt là
cho phép quan sát đồng thời nhiều tập hợp phân tử lai khác nhau do các mẫu dò đƣợc
đánh dấu bằng các hóa chất cho nhiều màu khác nhau.

Các nghiên cứu về bệnh Taura và virus TSV thì tƣơng đối ít hơn, Nunan L.M.,
Poulos B.T., Lightner D.V, 1998 đã dùng kỹ thuật RT – PCR để phát hiện virus TSV.
Trong thí nghiệm này, họ đã sử dụng primer tạo ra từ một đoạn cDNA trên genome
của TSV và khuếch đại đƣợc một gen có kích thƣớc 231 bp. Bằng kỹ thuật này, nhóm
nghiên cứu đã phát hiện đƣợc TSV khi gây nhiễm thực nghiệm trên P. vannamei và P.
stylirostris. Một nhóm nghiên cứu khác gồm Erickson H.S., Zarain-Herzberg M.,
Lightner D.V. đã thực hiện nghiên cứu các phƣơng pháp khác nhau để chẩn đoán và
phát hiện TSV trên tôm thẻ nói chung. Qua thí nghiệm này nhóm đã đƣa ra các
phƣơng pháp hiện nay có thể áp dụng để chẩn đoán TSV nhƣ RT – PCR, Western blot,
Immuno – dot blot, Immunohistochemistry và In Situ hybridization (11 – 2002).
II.5.8.2 Ứng dụng phương pháp ISH trong chẩn đoán mầm bệnh trên động vật
nuôi thủy sản
Trong thủy sản mà đặc biệt là chẩn đoán các mầm bệnh nguy hiểm trên tôm,
ngoài các biện pháp truyền thống đã đƣợc áp dụng trƣớc đây thì ISH đã phát huy đƣợc
thế mạnh của một phƣơng pháp chẩn đoán mới, hiệu quả cao. Một loạt các thí nghiệm
đã đƣợc thực hiện dựa trên phƣơng pháp ISH nhƣ phân biệt các dòng Baculovirus BP
– type khác nhau (Durand S., Lightner D.V., Bonami J.R., 1998); phát hiện
Piscirickettsia salmonis trên họ cá hồi (Venegas C.A., Contreras J.R., Larenas J.J. và
Smith P.A., 2004); phân tích quần thể vi khuẩn cộng sinh với loài chình nuôi và đã
xác định đƣợc 27 dòng Vibrio spp (Moreno Y., Arias C.R., Meier H., Garay E., Aznar
R., 1999); phát hiện Macrobrachium rosenbergii nodavirus trên tôm càng xanh (Sri
Widada J., Durand S., Cambournac I., Richard V., Bonami J.R. và ctv, 2003); phát
hiện virus đốm trắng gây nhiễm thực nghiệm trên tôm he, cua và tôm hùm (Poh-Shing
Chang, Hsiao-Chao Chen, Yu-Chi Wang, 1998)…
II.5.9 Xu hƣớng phát triển của phƣơng pháp này
Hiện nay, phƣơng pháp ISH đã đƣợc ứng dụng rộng rãi và đã đƣợc phát triển
thêm một bƣớc mới, ngƣời ta có thể đồng thời phát hiện nhiều trình tự đích khác nhau
trên cùng một mẫu mô hoặc tế bào bằng cách lai với nhiều probe đƣợc đánh dấu với
nhiều tác nhân khác nhau. Các tín hiệu sau khi lai sẽ đƣợc phát hiện dựa vào các phản


Phú Yên. Các mẫu này đƣợc thực hiện chẩn đoán đồng thời ba phƣơng pháp mô học,
PCR và ISH.
III.3 Hóa chất thí nghiệm
III.3.1 Hóa chất có sẵn trong bộ kit chẩn đoán DiagXotics của Mỹ
28 Đệm PBS đậm đặc 10 lần (10X PBS Buffer)
Proteinase K (dạng bột)
Đệm PBS 1 lần (1X PBS Buffer)
Đệm PBS/Glycine đậm đặc 10 lần (10X PBS/Glycine Buffer)
Dung dịch lai (Hybridization Solution)
Đệm SSC đậm đặc 30 lần (30X SSC Buffer)
Dung dịch đệm ngăn ngừa phản ứng dƣơng tính giả đậm đặc 10 lần (10X
Blocking Buffer)
Dung dịch kháng Digoxigenin (Anti – Digoxigenin/AP Conjugate Solution)
Đệm TBS đậm đặc 10 lần (10X TBS Buffer)
Dung dịch phát triển màu (Development Solution)
Đệm dừng phản ứng (Stop Buffer)
Mẫu đối chứng dƣơng
Mẫu đối chứng âm
Trong đó, thành phần của dung dịch lai gồm:
Probe đánh dấu DIG (Digoxigenin)
SSC 4X (Sodium Chloride/Sodium Citrate) buffer
Formamide 50%
Denhardt’s (Bovine Serum Albumin, Ficoll 400, PVP)
Dextran Sulfate 5%

ống eppendorf, bếp điện và nồi cách thủy, nhiệt kế, cân phân tích, hủ nhuộm mẫu,
micropipette loại có thể tích 10 – 100 µl và 100 – 1000 µl, tip có đầu lọc 100µl và
1000 µl, các loại pipette có thể tích 1ml, 5 ml, 10 ml, giấy lọc Whatman #1, lame
dƣơng và các dụng cụ cần thiết khác.
III.5 Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm theo quy trình của bộ kit
III.5.1 Chuẩn bị hóa chất
Pha loãng các hóa chất có trong bộ kit về nồng độ làm việc nhƣ PBS 1X,
PBS/Glycine 1X, SSC 2X, SSC 1X, SSC 0,5X, Blocking buffer 1X, TBS 1X, Stop
buffer 1X, cồn 95%, cồn 80%, cồn 50%. Tất cả các dung dịch trên đƣợc pha loãng
trong nƣớc cất hai lần.
Chuẩn bị Proteinase K bằng cách dùng pipette hút 1 ml đệm PBS 1X có sẵn
trong bộ kit cho vào lọ Proteinase K nguyên chất rồi hút 1 ml của lọ Proteinase K cho
vào lọ đựng đệm PBS 1X, trộn hai hóa chất này hòa đều vào nhau. Sau cùng ta phân
dung dịch vừa thu đƣợc vào các eppendorf và trữ ở -20
0
C, 1 ml cho mỗi eppendorf.
Pha dung dịch paraformaldehyde 0,4% bằng cách thêm 0,2 gram bột
paraformaldehyde vào 50 ml đệm PBS 1X, khuấy đều dung dịch ở 37
0
C cho đến khi
nào paraformaldehyde hòa tan hoàn toàn. Sau đó trữ dung dịch ở 2 – 7
0
C và dùng
trong 2 tuần.
30 31
Sơ đồ 3.1: Quy trình xử lý mẫu trƣớc khi thực hiện chẩn đoán
Tổng thời gian xử lý mẫu: 12,5 giờ
Paraffin đƣợc dùng trong quy trình xử lý mẫu này là hỗn hợp với sáp ong theo
tỷ lệ 5 paraffin : 1 sáp ong.
III.5.2.3 Đúc mẫu trong paraffin
Đặt mẫu đã xử lý vào khuôn inox, dùng bình rót paraffin (5 paraffin : 1 sáp
ong) vào khuôn chứa mẫu, cố định các mẫu sao cho nó nằm yên dƣới đáy và tách rời
nhau. Sau đó đặt khuôn inox chứa mẫu và paraffin lên bề mặt của dụng cụ làm lạnh,
đợi khuôn lạnh khối paraffin chứa mẫu đã cứng và tách khối paraffin ra khỏi khuôn.
III.5.2.4 Cắt mẫu
Dùng máy cắt Microtome cắt mẫu thành từng lát dày 5 – 6 m. Mẫu cắt đƣợc
trải lên lame, nhỏ vài giọt cồn 70% lên mẫu rồi cho mẫu qua bể chứa nƣớc 40
0
C để
làm căng bề mặt mẫu. Sau đó đính mẫu lên lame dƣơng và giữ ấm ở 40
0
C trong 4 – 6
giờ mới thực hiện chẩn đoán.
III.5.3 Quy trình chẩn đoán theo bộ kit
III.5.3.1 Ngày thứ nhất
Cố định lát cắt mô trên lame kính bằng cách ủ lame ở 60
0
C trong 30 phút.
Xử lý mẫu trƣớc khi lai


 Sau đó tiến hành xử lý mẫu với PBS 1X, tạo điều kiện cho Proteinase K
hoạt động tốt.
 Dùng enzyme Proteinase K để xử lý mô, phân hủy màng tế bào và màng
nhân vì enzyme này chỉ có khả năng phân cắt protein có trong mẫu mô đã cố định trên
lame và không ảnh hƣởng gì đến acid nucleic trong mẫu.
 Rửa mẫu với dung dịch PBS/Glycine 1X để loại bỏ các enzyme còn
thừa.
 Sau đó cho mẫu vào trong hủ nhuộm sạch có chứa paraformaldehyde
0,4%, ủ 10 phút ở 4
0
C giúp sợi DNA duỗi thẳng ra thuận lợi cho quá trình bắt cặp bổ
sung.
Tiến hành lai: Mẫu dò hay probe trong dung dịch lai trƣớc đó đã đƣợc biến tính
bằng cách đun 10 phút ở 95
0
C, làm lạnh nhanh và giữ lạnh ở 4
0
C. Sau đó, ta cho dung
dịch lai lên lame và biến tính mẫu mô ở 95
0
C trong 6 phút.
Phản ứng lai giữa hai thành phần trên xảy ra ở 42
0
C trong 12 – 18 giờ (ủ qua
đêm).


Dung dịch PBS
1X/glycine 5 phút, RT
1. Hút 75 l dung dịch lai/lame, đậy lamelle lại
2. Đặt lame lên bàn lai ở 95
0
C trong 6 phút
3. Tiếp tục cho lame vào phòng ẩm, ủ qua đêm ở 42
0
C
Mẫu trên lame ủ
60
0
C trong 30 phút
Cồn tuyệt đối 2 lần, 1 phút/lần
Cồn 95% 2 lần, 1 phút/lần
Cồn 80% 2 lần, 1 phút/lần
Cồn 50% 1phút 1 lần
Nƣớc cất 5 lần
Sơ đồ 3.2: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ nhất
Dung dịch TBS
1X 5 phút/lần, 2x
Dung dịch phát triển
màu 2 giờ, ủ trong tối
Dung dịch stop
buffer1X, 5 phút
Thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, 60 giây
Rửa màu thừa bằng nƣớc cất.
Cồn 95% 1 phút, 3x
Cồn 99,5% 1 phút, 3x
Xylene 1 phút, 3x
Sơ đồ 3.3: Tóm tắt các bƣớc thực hiện trong ngày thứ hai
 Rửa mẫu với dung dịch TBS 1X để loại bỏ những phân tử Anti – DIG gắn AP
thừa.
 Ủ mẫu với dung dịch phát triển màu 2 giờ, trong tối ở nhiệt độ phòng.
 Kết thúc phản ứng hiện màu bằng dung dịch Stop buffer 1X.
 Nhuộm màu bổ sung bằng thuốc nhuộm Bismark Brown Y 0,5%, mẫu mô –
những vùng không có phân tử lai dƣới kính hiển vi quang học có màu vàng nâu. Rửa
sạch màu thừa bằng nƣớc cất hai lần. Chúng ta có thể quan sát kết quả lai dƣới kính
hiển vi quang học ngay sau bƣớc này. Nếu muốn giữ mẫu lâu thì tiếp tục cho lame mẫu
qua cồn 95%, cồn tuyệt đối, xylene và dán keo cytoseal 60.

định cho PCR và dung dịch cố định chung cho cả mô học và ISH) tiêm vào gan tụy và
vùng xung quanh gan tụy. Lƣợng dung dịch cố định dùng từ 0,1 – 10 ml, thay đổi tùy
theo kích thƣớc tôm. Sau đó cho mẫu vào lọ có chứa dung dịch cố định tƣơng ứng. Số
tôm thu từ 5 – 10 con/ao.
Tỷ lệ hóa chất dùng cố định mẫu là hóa chất : mẫu = 10 : 1.
III.6.2 Bố trí thí nghiệm
Chẩn đoán theo quy trình bộ kit để ổn định phƣơng pháp.
Thay đổi một số bƣớc trong quy trình để đƣa ra một quy trình tối ƣu áp dụng
trong điều kiện phòng thí nghiệm tại Viện.
Thí nghiệm để so sánh độ ổn định, độ chính xác và hiệu quả giữa phƣơng pháp
ISH vừa tìm đƣợc với mô học và PCR.
Các bố trí cụ thể nhƣ sau:
III.6.2.1 Phương pháp ISH để chẩn đoán virus Taura TSV trên tôm thẻ chân trắng
Penaeus vannamei
A. Bố trí thí nghiệm thử nghiệm phƣơng pháp
Để thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT của phƣơng pháp
ISH, chúng tôi thực hiện thí nghiệm theo quy trình bộ kit đã nêu ở mục III.5 trên ba
mẫu tôm dƣơng tính với TSV, một đối chứng dƣơng và một đối chứng âm. Vì chúng
36 tôi không thu đƣợc những mẫu dƣơng tính điển hình nên thực hiện thí nghiệm này trên
các mẫu cũ, đƣợc lƣu lại trong phòng thí nghiệm mô học từ năm 2004. Các mẫu tôm
này dƣơng tính với TSV khi xét nghiệm bằng mô học và PCR, thực hiện thí nghiệm
lặp lại 2 lần.
B. Bố trí thí nghiệm để tìm quy trình ISH tối ƣu cho TSV trên Penaeus vannamei
Sau khi thực hiện thử nghiệm khả năng chẩn đoán mầm bệnh TSV trên TCT,

0
C trong 10 phút, làm lạnh đột
ngột và giữ lạnh ở 4
0
C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính
lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 60
0
C trong 6 phút.
Nghiệm thức V: probe đƣợc biến tính riêng ở 95
0
C trong 10 phút, làm lạnh đột
ngột và giữ lạnh ở 4
0
C cho đến khi lai. Khi lai cho dung dịch lai có probe đã biến tính
lên lame và thực hiện biến tính mẫu ở 50
0
C trong 6 phút.
(b) Thí nghiệm tìm thời gian cắt thích hợp với Proteinase K
Ở đây, chúng tôi tiến hành thí nghiệm trên hai đối tƣợng là tôm postlarvae và
tôm thƣơng phẩm để tìm ra thời gian tối ƣu áp dụng trên từng đối tƣợng đó, mỗi đối
tƣợng thực hiện 5 mẫu và hai đối chứng (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các mẫu
37 dùng trong thí nghiệm này đều đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với TSV.
Thí nghiệm đƣợc bố trí lặp lại hai lần và thực hiện trên 5 nghiệm thức sau: 11 phút, 13
phút, 15 phút, 17 phút và 19 phút.


38 paraformaldehyde do Trung Quốc và Việt Nam sản xuất, nhằm giảm chi phí thực hiện
chẩn đoán và phù hợp điều kiện hiện tại của phòng thí nghiệm Mô học của Viện.
Bố trí 2: Chúng tôi tiến hành thay đổi một số chỉ tiêu trong quy trình chuẩn của
bộ kit ở mục III.5, mỗi chỉ tiêu cải tiến là một thí nghiệm. Các thí nghiệm đƣợc thực
hiện trên các mẫu tôm sú đã đƣợc mô học và PCR xác nhận là dƣơng tính với WSSV
và hai đối chứng kèm theo (đối chứng dƣơng và đối chứng âm). Các thí nghiệm đƣợc
bố trí nhƣ sau: Bảng 3.1: Các thí nghiệm tìm quy trình ISH tối ƣu cho WSSV trong phòng thí
nghiệm
Số thí
nghiệm
Các chỉ tiêu cần cải tiến

1.
Áp dụng quy trình xử lý mẫu
nhanh giảm thời gian
5 mẫu

5 mẫu 2

2.
Biến tính mẫu và probe đồng
thời trên lame trƣớc khi lai
5 mẫu
5 mẫu
2
3.
Kết hợp quy trình xử lý mẫu
nhanh với biến tính mẫu và
probe đồng thời trên lame trƣớc
khi lai
5 mẫu
5 mẫu
2
Trong đó:
(a) Quy trình xử lý mẫu:
Quy trình xử lý mẫu chuẩn theo bộ kit nhƣ đã nêu ở mục III.5.2.2 và sơ đồ 3.1.
Quy trình xử lý mẫu nhanh trong thí nghiệm: là quy trình đã đƣợc Bộ môn Mô
học TTQGQTCBMT & PNDBTSKVNB trực thuộc Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản II áp dụng trong chẩn đoán mô học. Quy trình đƣợc thực hiện trong

0
C để probe bắt cặp với trình tự đích trên mẫu.
Biến tính mẫu và probe đồng thời trên lame trong thí nghiệm: trong thí nghiệm
này, chúng tôi bỏ qua bƣớc biến tính probe trong dung dịch lai trƣớc khi lai. Khi thực
hiện lai, chúng tôi cho dung dịch lai có probe chƣa biến tính lên mẫu và thực hiện biến
tính đồng thời mẫu và probe ở 95
0
C trong 6 phút, sau đó ổn định nhiệt độ ở 42
0
C và ủ
qua đêm.
(c) Kết hợp quy trình xử lý mẫu nhanh với biến tính mẫu và probe đồng thời trên
lame trƣớc khi lai
Trong thí nghiệm này chúng tôi thực hiện kết hợp hai quy trình trên trong chẩn
đoán WSSV bằng ISH.
III.6.2.3 Bố trí thí nghiệm so sánh giữa phương pháp ISH với mô học và PCR
Trong phần bố trí này, mẫu có dấu hiệu bệnh sau khi thu về phòng thí nghiệm
đƣợc chia thành hai phần, một phần cố định trong cồn 95
0
để thực hiện chẩn đoán bằng
PCR; phần còn lại cố định trong dung dịch Davidson đối với tôm sú và cố định trong
dung dịch R-F đối với TCT và dùng để kiểm tra mô học và ISH. Thí nghiệm đƣợc bố
trí nhƣ sau:


R-F
30
15
15
2
ISH
R-F
30
15
15
2 PCR
Cồn 95%
30
15
15
2
Đối với bệnh đốm trắng trên tôm sú Penaeus monodon
Bảng 3.3: Thí nghiệm so sánh ISH với mô học và PCR trên P. monodon
Phƣơng
pháp
chẩn

15
15
2 PCR
Cồn 95%
30
15
15
2 CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
IV.1 Kết quả trên tôm thẻ chân trắng P. vannamei
IV.1.1 Thí nghiệm thử nghiệm khả năng phát hiện TSV bằng phƣơng pháp ISH
42 Hình 4.2: Đối chứng âm trên mang tôm

dƣơng
+++
+++
Tín hiệu lai tƣơng đối rõ nhƣng rất ít và
không tập trung.
Đối chứng âm
-
-
Không có tín hiệu lai phát ra, mẫu rõ và
nhuộm màu thuốc nhuộm bổ sung.
Kết quả đƣợc đọc dƣới KHV quang học và cách đọc nhƣ sau:
Mẫu dƣơng tính: có các thể vùi kết tủa màu xanh đến đen trong tế bào chất,
những tế bào không bị nhiễm virus thì cấu trúc mô bình thƣờng và bắt màu thuốc
nhuộm bổ sung (màu cam).
Mẫu âm tính: không có màu xanh hoặc đen, chỉ bắt màu Bismark Brown Y
(màu thuốc nhuộm bổ sung) và có màu cam sau quá trình lai. 43
44 lai, ở giai đoạn biến tính mẫu ở 95
0
C trong 6 phút. Vì TSV là virus mang vật chất di
truyền là RNA mạch đơn nên khi ta biến tính mẫu ở 95
0
C có thể làm phân hủy hoàn
toàn cấu trúc RNA nên probe không tìm thấy trình tự đích để bắt cặp và tạo tín hiệu
sau khi lai. Bên cạnh đó, lƣợng RNA có thể mất đi do các dung dịch lai và dung dịch
rửa có mặt RNase, enzyme này có tác dụng phân cắt RNA trong mẫu mô, nhƣng lý do
này rất ít xảy ra vì các hóa chất mà chúng tôi sử dụng đều có trong bộ kit ISH chẩn
đoán mầm bệnh TSV do công ty DiagXotics của Mỹ cung cấp.
Ngoài ra, khi chúng tôi thực hiện lai trên đối chứng dƣơng của bộ kit thì các tín
hiệu lai không nhiều và rải rác. Ngƣời ta thực hiện đối chứng dƣơng bằng cách gây
nhiễm tôm thẻ chân trắng với virus Taura liều cao, rồi thu lấy các cơ quan nhƣ phụ bộ,
gan tụy, dạ dày, mang…cố định, đúc, cắt và đính lên lame dƣơng. Theo lý thuyết, các
tín hiệu lai nhận đƣợc trên đối chứng dƣơng phải nhiều, rõ ràng và tập trung chứ
không phải rất ít nhƣ trong kết quả mà chúng tôi thu đƣợc, kể cả lần thí nghiệm thứ
hai. Điều này khẳng định một lần nữa có thể lƣợng RNA của mẫu đã bị phân hủy trong
quá trình lai, ở giai đoạn biến tính mẫu.
Trên đối chứng âm, mẫu rất rõ và không bị nhiễm bẩn chứng tỏ quá trình lai
đƣợc thực hiện rất tốt và không bị ngoại nhiễm.
Qua kết quả mà chúng tôi nhận đƣợc nhƣ trên và những lý do đã đƣợc đƣa ra
nhƣ vậy, chúng tôi tiến hành một loạt các thí nghiệm khác để ổn định phƣơng pháp lai
áp dụng trong chẩn đoán mầm bệnh TSV.
IV.1.2 Kết quả thí nghiệm ổn định phƣơng pháp ISH trên P. vannamei
IV.1.2.1 Kết quả thí nghiệm tìm nhiệt độ biến tính mẫu tối ưu khi lai
Do mẫu và probe mà chúng tôi sử dụng khác nhau hoàn toàn về bản chất, mẫu