16
syringae là một ví dụ cụ thể cho trường hợp trên và chúng có thể gây bệnh cho nhiều
loài thực vật khác nhau [9], [38].
Ngoài ra, có nhiều vi sinh vật gây bệnh khác cũng đã được ghi nhận trên
nhiều loài thực vật khác nhau như: nấm Phytophthora, Xanthomonas,…[82]. Tuy
nhiên, bên cạnh các vi sinh vật có hại cũng tồn tại nhiều vi sinh vật có lợi cho thực vật.
Cơ chế tạo ra ảnh hưởng có lợi của vi sinh vật lên thực vật rất đa dạng. Trong trường
hợp của vi khuẩn sống ở rễ chúng có thể biến dưỡng nitrogen từ khí quyển thành
nitrate, ammonia, tạo các chất trung gian để cô lập các chất khoáng cho thực vật, tổng
hợp các phytohormone, hay tổng hợp các chất trung gian để cô lập các chất khoáng
cần thiết cho vi sinh vật gây bệnh, làm cho vi sinh vật gây bệnh không thể sử dụng
được các chất khoáng này hay tổng hợp các chất kháng vi sinh vật gây bệnh cho thực
vật như các chất kháng sinh, các enzyme thủy phân vách tế bào, các hydrogen cyanide
để ức chế sự phát triển của vi sinh vật gây bệnh hay kích thích tạo tính kháng bệnh của
thực vật [19], [33], [50], [74]. Trong đó, nấm Trichoderma là nấm hiện diện trên nhiều
thực vật, trên nhiều cơ quan khác nhau và chúng là nấm có lợi, không những chúng có
khả năng gia tăng tăng trưởng, gia tăng năng suất mà còn gia tăng khả năng kháng
bệnh của cây đối với các bệnh gây hại do Fusarium, Alternaria, Cochliobolus
heterostrophus, Rhizoctonia solani,… [17], [35], [44], [56]. Trong mối quan hệ đó, sự
cộng sinh giữa cây họ đậu và vi khuẩn đất được cho là nhân tố quan trọng cho môi
trường và trong nông nghiệp đã được nghiên cứu từ rất sớm. Vi khuẩn rễ có thể tìm
thấy trong hầu hết 18.000 loài của họ đậu Leguminosae (thực vật hai lá mầm), ở rễ cây
mía (thực vật một lá mầm) và nhiều loài thực vật khác [9], [70], [87], [97].
Cơ chế ảnh hưởng lên sự phát triển của thực vật bởi vi sinh vật trong điều kiện
in vitro cũng đã được nghiên cứu và chứng minh. Một số vi sinh vật có khả năng kích
thích sự phát triển hình thái và tăng trưởng của thực vật. Vi khuẩn Methanotrophic là
một ví dụ điển hình, có khả năng kích thích sự hình thành callus (mô sẹo) của hạt lúa
mì và gia tăng khả năng tạo rễ trong môi trường nuôi cấy, vì vậy làm cho tỷ lệ tái sinh
cây cũng đạt hiệu quả và rút ngắn được thời gian. Sự gia tăng khả năng tạo callus (mô

Mối quan hệ giữa vi khuẩn PPFM với thực vật không phải là mối quan hệ một
chiều, mà cùng với việc hấp thu các chất tiết ra thực vật thì vi khuẩn PPFM có thể tổng
hợp và tiết ra các chất khác nhau có lợi cho quá trình sinh trưởng và phát triển của
thực vật. Chủng PPFM đầu tiên được phân lập bởi Basile và ctv (1969), có khả năng
kích thích sinh trưởng của cây địa tiền (liverwort, Scapania nemorosa) trong môi
trường nuôi cấy in vitro. Sau đó, Corpe và Basile (1982), chứng minh rằng PPFM gia
tăng khả năng tạo callus (mô sẹo), gia tăng khả năng tái sinh cây từ mô cây anh thảo
(cây báo xuân) Streptocarpus prolixus. Corpe và Basile (1982), cũng chứng minh được
rằng vi khuẩn PPFM có khả năng tổng hợp vitamine B
12
(cyanocobalamine) và kích
thích sinh trưởng, phát triển của cây rêu Jungermannia leiantha và Gymnocolea inflata
[39], [40], [51], [84].
Các công trình nghiên cứu gần đây đã chứng minh được rằng, vi khuẩn PPFM
có khả năng tương tác với cây đậu nành trong việc chuyển hóa nicken, PPFM có khả
năng gia tăng tỷ lệ nẩy mầm của hạt, cũng như gia tăng năng suất cây đậu nành. Khả 18
năng kích thích tăng trưởng, gia tăng năng suất của thực vật khi xử lý PPFM trên lá
cũng được ghi nhận trên cây bông (Gossypium hirsutum L.) và cây mía (Saccharum
officinarum L.). Trong nghiên cứu của Maliti (2000), thì một số chủng PPFM có khả
năng gia tăng khả năng tạo callus (mô sẹo) từ phôi hạt lúa, trong khi một số chủng
khác lại có khả năng kích thích sinh trưởng và phát triển của các cơ quan như lá, rễ,
thân lúa. Nhưng một số chủng khác lại ức chế phát triển của rễ lúa. Trong nghiên cứu
của Madhaiyan và ctv (2005), đã chỉ ra rằng tất cả các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. trong nghiên cứu có khả năng kích thích sự nẩy mầm của hạt
lúa, kích thích tăng trưởng, gia tăng tỷ lệ tạo nhánh, gia tăng khả năng kháng bệnh và
giảm tỷ lệ cây bệnh với Rhizoctonia solani, cũng như góp phần làm gia tăng năng suất
lúa (hơn 55,44g/ lỗ) [40], [59], [60], [61].

định ở nhiều vi sinh vật. Những vi khuẩn sống trong đất và vi khuẩn quan hệ với
thực vật có khả năng tổng hợp phytohormone bao gồm vi khuẩn gram âm, gram
dương, vi khuẩn gây bệnh cho thực vật, vi khuẩn cộng sinh và vi khuẩn biến dưỡng
nitrogen. Nhiều loài vi khuẩn trong nhóm này có thể tổng hợp và tiết vào môi
trường nuôi cấy nhiều hơn một hormone. Chủng Rhizobium có thể tổng hợp
gibberellins (GA) và auxin, Azotobacter spp. có thể tổng hợp GA, auxin và
cytokinins, Acetobacter và Herbaspirillum có thể tổng hợp IAA và GA. Nên chúng
có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của thực vật trong điều kiện in vivo
cũng như in vitro [24], [71].
Sự tổng hợp IAA của một số PPFM cũng đã được ghi nhân. Sự tạo indole
và dẫn xuất của chúng từ L- tryptophan là môt đặc trưng phân biệt của những vi
khuẩn gram âm hiếu khí. Trong nghiên cứu của Ivanova và ctv (2001), bằng cách sử
dụng những thuốc thử Salkowski và Van Urk đã chỉ ra rằng 4 loài Methylobacteria
là Methylobacterium mesophilicum, Aminobacter aminovorans, Methylovorus mays
và Paracoccus kondratievae có thể tạo IAA. Trong nghiên cứu của Omer và ctv
(2004), chứng minh rằng vi khuẩn hiếu khí Methylobacteria có thể tổng hợp auxin
(chủ yếu là IAA) từ L-tryptophan ngoại bào. PPFM cũng có thể tổng hợp lượng nhỏ
IAA trong môi trường với peptone là nguồn cacbon và nitrogen. Trong nghiên cứu
khác của Omer và ctv (2004), chỉ ra rằng ba trong số 16 chủng PPFM được kiểm tra
trong môi trường nuôi cấy lỏng có thể tổng hợp IAA. Ba chủng tạo IAA đã tích lũy
phytohormone với khối lượng biến thiên trong khoảng 6 – 13,3mg/l trong môi
trường bổ sung L-tryptophan và 1,1 – 2,4mg/l khi không bổ sung L-tryptophan vào
môi trường nuôi cấy, đến 12 ngày sau thì hàm lượng IAA tạo ra trong môi trường có
bổ sung L-tryptophan cao gấp 6 lần so với nuôi cấy không có L-tryptophan [24],
[26], [71].
Cytokinins được tạo ra bởi vi khuẩn bằng ít nhất hai con đường. Con đường đầu
tiên là tổng hợp de novo, là dạng chuyển đổi trực tiếp đồng phân (isopentenylation)
của AMP (adenine monophosphate) bởi enzyme dimethylallyl transferase (DMAT),
được ghi nhận đầu tiên ở vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens. Con đường thứ hai của
quá trình tạo cytokinins bởi vi khuẩn là quá trình chuyển đổi của tRNA tương tự như

chất C1 thì không có sự tích lũy PHB được phát hiện. Trong một nghiên cứu khác
của Ackermann và ctv (1994), lại cho thấy rằng, vi khuẩn Methylobacterium
rhodesianum có thể tổng hợp PHB trong điều kiện giới hạn dinh dưỡng. Trong
nghiên cứu này, ông chứng minh được rằng, khi vi khuẩn sinh trưởng trong điều kiện 21
giới hạn nitrogen thì có thể chúng tích lũy PHB lớn 2% trọng lượng thô của sinh khối
sau 20 giờ nuôi cấy, còn trong điều kiện bị giới hạn của phosphate thì sự tích lũy
PHB ít hơn và trong điều kiện giới hạn của nguồn cacbon thì PHB được tích lũy nhỏ
hơn 2% trọng lượng sinh khối khô của vi khuẩn sau 20 giờ nuôi cấy [10], [65].
Ngoài ra, vi khuẩn Methylobacterium có khả năng sử dụng các chất hữu cơ
khác nhau gồm các chất gây ô nhiễm môi trường và tổng hợp các hợp chất có lợi cho
chính vi khuẩn cũng như có lợi cho đời sống của con người. Trong nghiên cứu của
Van Aken và ctv (2004), chứng minh rằng vi khuẩn PPFM cộng sinh được phân lập
từ môi trường nuôi cấy mô cây dương Populus deltoides nigra DN34. Chủng vi
khuẩn thuần thuộc Methylobacterium sp. BJ001 có thể chuyển đổi hoàn toàn chất
25mg/l TNT, 20mg/l RDX, 2,5mg/l HMX sau 55 ngày nuôi cấy để tạo ra CO
2
. Trong
khi đó, trong nghiên cứu của Fournier và ctv (2005), cho rằng chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. JS178 có khả năng phân hủy (sử dụng Nitramine 4-Nitro-2,4-
Diazabutanal – NDAB – là sản phẩm phân cắt của hợp chất RDX – hexahydro-1,3,5-
trinitro-1,3,5-triazine – là hợp chất độc giàu năng lượng) tạo ra khoáng nitramine
trong điều kiện hiếu khí. Methylotrophic đóng vai trò quan trọng trong hệ sinh thái
do chúng có khả năng sử dụng methan-một loại khí gây hiệu ứng nhà kín. Ngoài ra,
vi khuẩn Methylobacterium cũng có khả năng phân hủy nhiều hợp chất hữu cơ gây ô
nhiễm khác bao gồm methyl chloride, methyl bromide, methyl iodide,
dichloromethane, methyl tert-butyl ether, methylated amines, những hợp chất có chứa
ethylated sulfur, và cyanate và thiocyanate [28], [36], [88], [89].

Để định danh vi sinh vật theo phương pháp truyền thống thường phải dựa vào các
khóa phân loại (bảng sinh hoá). Khóa phân loại prokaryote đầy đủ nhất, phổ biến
nhất, được sử dụng là khóa phân loại Bergey`s [4], [41], [77], [97].

23
Bảng 2.3: Đặc điểm sử dụng các nguồn carbon của các loài thuộc chi
Methylobacterium [41]
Chất
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13

Trimethylanine
–
–
–
+
–
–
–
–
–
+
–
–
–
–
+
Acetate
+
+
+
+
+
+
+

+
+
+
–
+
+
Glutamate
–
–
+
+
–
–
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
–
+
+
Glucose
+

–
+
+
–
–
–
–
–
–
–
+
+
Fructose
+
+
–
+
+
+
+
–
–
+
–
+
–
+
+
+
+

–
–
V
–
–
–

v

Serbacate –
–
–
–
–
+
v

+


+
nutrient agar v
+
+
+
+
+
–

+
+
Methane –
v
–

nhiên, phương pháp này đòi hỏi kỹ thuật và trang thiết bị hiện đại.
+ Sử dụng mẫu dò (probes)
Mẫu dò là một trình tự acid nucleic được sử dụng để xác định sự hiện diện của
một trình tự nucleotid đặc trưng của một chủng vi sinh vật đã biết trước. Mẫu dò là 24
một đoạn mạch đơn của acid nucleic thường là DNA được gắn với một nhân tố nhận
biết là phóng xạ hay chất phát huỳnh quang.
+ Khuếch đại trình tự đặc trưng bằng phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
[4], [67], [95].
Phương pháp PCR là phương pháp khuếch đại nhanh nhiều bản sao của các
đoạn DNA mà không cần phải qua tạo dòng. Phương pháp này được K. Mullis đưa ra
năm 1985 và Saiki hoàn thiện năm 1988. Đây là phương pháp được thực hiện hoàn
toàn trong ống nghiệm và trong một thời gian ngắn có thể thu rất nhiều bản sao DNA.
Nguyên tắc của phương pháp PCR
Phương pháp này được thực hiện trong ống nghiệm với sự hiện diện của
enzyme DNA-polymerase, theo nguyên tắc bán bảo tồn trong nhân bản DNA. Sự
khuếch đại được thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại. Phản ứng xảy ra nhờ
enzyme DNA-polymerase. DNA sẽ tách thành hai mạch và từ 2 mạch DNA thành 4
mạch DNA, 4 mạch DNA thành 8 mạch DNA và cứ như thế nhân lên đến vô cùng.
+ Giải trình tự (sequencing) [5].
Là kỹ thuật xác định tất cả các thành phần nucleotide tạo nên phân tử acid
nucleic chuyên biệt nào đó. Phương pháp giải trình tự đầu tiên do Maxam và Gilbert
(1977), Sanger và ctv (1977), công bố.
Một số phương pháp giải trình tự đang được sử dụng:
- Phương pháp Maxam và Gilbert
Phương pháp này dựa trên sự phân cắt hóa học tại vi trí đặc biệt của base tạo ra
một phân tử DNA có đầu được đánh dấu và hình thành nên một loạt các đoạn DNA có
đầu được đánh dấu bằng các loại base khác nhau.

Sau khi sử dụng các kiểm tra sinh lý, sinh hóa để định danh các loài thuộc chi
Methylobacterium thì việc sử dụng trình tự 16S rRNA để dịnh danh vi khuẩn
Methylobacterium là rất cần thiết vì các kiểm tra sinh lý, sinh hóa không thể đem lại
kết quả chính xác. Phương pháp PCR khuếch đại trình tự 16S rRNA để phát hiện các
loài Methylobacterium đã được sử dụng rộng rãi bởi tính chính xác của nó. Ngoài ra,
trên ngân hàng gen của NCBI đã lưu trữ tất cả các trình tự gần như nguyên vẹn rDNA
16S (mã hóa cho 16S rRNA). Cho nên chỉ cần so sánh trình tự của chủng vi khuẩn cần
định danh với các trình tự có sẵn trên ngân hàng thì có thể định danh được loài vi sinh
vật mục tiêu [29], [30], [31], [68].

26
Phần III: Vật liệu và phƣơng pháp
3.1. Vật liệu
3.1.1. Mẫu thí nghiệm
 Mẫu lá, đất, nước được lấy ngẫu nhiên trên ruộng lúa ở Tây Ninh
 Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 06/ 02/ 2006 đến ngày 18/ 06/ 2006.
 Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại Trại thực nghiệm Sinh học và Phòng
Công nghệ Sinh học Phân tử, Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên,
Đại học Quốc Gia thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2. Thiết bị, dụng cụ
 Máy hấp vô trùng autolave
 Máy lắc tròn 100 vòng/phút
 Máy ly tâm Miko 22R (Hettich Zentrifugen)
 Máy điều nhiệt theo chu kỳ Techine

3
.6H
2
O 1mg
- (NH
4
)
2
SO
4
0,5 g
- CuSO
4
.5H
2
O 5 g
- MnSO
4
.5H
2
O 10 g
- Na
2
MoO
4
.2H
2
O 10 g
3.1.3.3. Môi trƣờng khảo sát khả năng sử dụng hợp chất cung cấp nguồn cacbon
của vi khuẩn Methylobacterium sp. [4], [6], [34]
Môi trường khảo sát là môi trường MMS. Trong đó, methanol được thay thế
bằng 1% các chất cung cấp cung cấp nguồn cacbon.
3.1.3.4. Môi trƣờng nhân sinh khối vi khuẩn [4], [6].
Môi trường khoáng MS bổ sung 30g/l sucrose, 1mg/l glycine, 1mg/l B1,
100mg/l meso inositol, 2g/l cao thịt, 2g/l casein hydrolyase ký hiệu: CMS.
Môi trường cao thịt – peptone (CP) gồm 0,3% cao thịt, 1% peptone, 0,5%
NaCl, pH = 6,5.
3.1.3.5. Bộ thử nghiệm sinh hóa định danh trực khuẩn gram âm IDS14GR. 28
3.2. Phƣơng pháp tiến hành thí nghiệm

Lấy mẫu

Tăng sinh vi khuẩn

Phân lập

Làm thuần

Xác định hình thái

10
–2
,… 10
– 6
. Sau đó từ mỗi nồng độ hút 100 l cho vào môi trường rắn.
- Đối với mẫu nước chúng tôi tiến hành phân lập trực tiếp không qua quá trình
tăng sinh, hút cho vào môi trường rắn mỗi đĩa là 40 l
- Đối với mẫu lá sau khi tăng sinh dùng pipet vô trùng hút 100 l cấy vào môi
trường rắn
- Sau khi cấy chuyển vào môi trường rắn đem tất cả các đĩa môi trường đã cấy vi
khuẩn nuôi ở nhiệt độ 30
0
C. Sau 2 – 4 ngày xem kết quả và chọn khuẩn lạc
hồng đặt trưng để làm thuần.
3.2.4. Làm thuần.
Khuẩn lạc thuần đóng vai trò quan trọng quyết định đến kết quả và độ chính xác
trong thử nghiệm sinh hóa cũng như các thử nghiệm khác. Do đó, để có khuẩn lạc
thuần phục vụ cho tiến trình thử nghiệm sinh hóa chúng tôi tiến chọn lọc khuẩn lạc có
màu hồng đặc trưng trên môi trường phân lập cấy ria trên đĩa môi trường mới nhiều
lần (3 – 4 lần), để tạo chủng thuần.
3.2.5. Giữ giống.
Để có chủng vi khuẩn tiến hành các nghiên cứu có liên quan nên chúng tôi dùng
vi khuẩn thuần cấy sang môi trường giữ giống GPA và bảo quản giống trong glycerol
50% trong điều kiện đông lạnh.
3.2.6. Khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Được tiến hành với các thử nghiệm chủ yếu sau:
3.2.6.1. Thử nghiệm gram và đo kích thƣớc tế bào [4], [6], [7]
Thử nghiệm Gram là thử nghiệm đầu tiên, đơn giản trong các thử nghiệm sinh hóa
nhưng thử nghiệm Gram có ý nghĩa quan trọng trong quá trình định danh vi sinh vật.
Để xác định Gram các chủng đã phân lập và làm thuần chúng tôi tiến hành theo hai

- Tẩy màu bằng cồn trong khoảng 10 – 15 giây.
- Rửa lại bằng nước.
- Phủ dịch fuschin lên lam kính trong khoảng 30 giây. Đổ bỏ fuschin và rửa bằng
nước.
- Dùng giấy thấm để thấm hay để khô tự nhiên.
- Xem kết quả dưới kính hiển vi độ phóng đại của vật kính 100X với một giọt
dầu 31
 Các chủng vi khuẩn trong thí nghịêm được thử nghiệm sau 2, 4, 6, 8 ngày nuôi
cấy trên môi trường CMS.
+ Đo kích thước tế bào
Sau khi nhuộm gram, quan sát dưới khính hiển vi độ phóng đại vật kính 100X và đo
kích thước tế bào.
3.2.6.2. Mối quan hệ với oxi
Được tiến hành qua thử nghiệm catalase và hoạt tính oxidase trong bộ thử
nghiệm IDS14GR.
+ Thử nghiệm catalase
Nguyên tắc: Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase trong vi khuẩn.
Phương pháp thử:
- Thử trên lam: Dùng que cấy lấy khuẩn lạc thuần đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một
giọt H
2
O
2
30% lên vi sinh vật trên lam.
- Thử trong ống nghiệm: Nhỏ trực tiếp 1ml H
2
O

chúng tôi tiến hành thử nghiệm khả năng sử dụng nguồn cacbon của các khuẩn lạc
thuần phân lập được.
Vật liệu: Các khuẩn lạc thuần đã phân lập.
Tiến hành: Pha môi trường MMS hấp vô trùng, sau đó bổ sung 1% chất cung
cấp nguồn cacbon và chất chỉ thị pH 2ml/l vào môi trường điều chỉnh pH môi trường ở
7 2 bằng KOH 1N và HCl 1N. Sau đó cho môi trường vào các lổ của microplate
1ml/lỗ, cấy vi khuẩn vào các lỗ ngoài trừ lỗ đối chứng.
Các chất cung cấp nguồn cacbon đã thử nghiệm: L-arabinose, fructose, ethanol, L-
glutamate, acetate, methylamine, trimethylamine, serbacate, D-glocose, sucrose,
manitol, maltose, betaine, citrate, lactose và môi trường nutrient agar tổng hợp (Merk).
3.2.6.5. Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm sinh hóa IDS 14GNR.
Để có thể định danh chính xác hơn các dòng vi khuẩn đã phân lập và thử
nghiệm ở trên, nên chúng tôi tiếp tục khảo sát các đặc điểm sinh lý, sinh hóa khác
bằng bộ thử nghiệm sinh hóa định danh vi khuẩn gram âm IDS 14GNR của công ty
Nam Khoa.
Các thử nghiệm trong bộ thử nghiệm IDS 14GNR bao gồm:
+ Khả năng lên men glucose (MR)
Nhằm kiểm tra khả năng của vi sinh vật lên men glucose tạo các sản phẩm
cuối mang tính acid và vượt qua khả năng ổn định pH của môi trường. Đây là phép thử
định tính về khả năng sinh acid (xác định pH) do một số vi sinh vật sinh acid nhiều
hơn các vi sinh vật khác.
+ Khả năng khử nitrate
Xác định sự hiện diện của enzyme nitratreductase ở vi sinh vật, và chúng có
khả năng sử dụng nitrate làm nguồn thức ăn nitơ. Ngoài ra, một số vi sinh vật có khả 33
năng sử dụng nitrate làm chất nhận electron hay H
+
trong hô hấp kị khí để oxy hóa các

Nhằm xác định khả năng thủy phân glycoside esculin thành glucose và
esculetin của một số vi khuẩn, trong điều kiện có sự hiện diện của 40% muối mật.
+ Khả năng sinh H
2
S
Xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng sinh H
2
S từ các acid amin chứa
lưu huỳnh tạo chất tủa màu đen.
+ Thử nghiệm Voges – Proskauer
Nhằm xác định khả năng của vi sinh vật có khả năng tạo sản phẩm cuối cùng
mang tính trung tính là acetoin (acetylmethylcarbinol – AMC) do lên men glucose.
+ LDC (lysin decarboxylase)
Mục đích: Phát hiện vi khuẩn có khả năng phân giải lysin trong môi trường
bằng cách khử nhóm carboxyl nhờ enzyme lysin decarboxylase.
+ Khả năng sử dụng malonate 34
Nhằm khảo sát khả năng của vi khuẩn sử dụng sodium malonate làm nguồn
cacbon. Khi vi khuẩn sử dụng malonate sẽ sinh ra phản ứng kiềm, và làm biến đổi màu
môi trường.
+ Khả năng sinh indole
Mục đích: Khảo sát khả năng thủy giải tryptophan trong môi trường tạo nhân
indole
Tất cả các hóa chất của phản ứng sinh hóa được tẩm trong các đĩa giấy, sau đó
cho vào các giếng được đánh số. Khi sử dụng lấy sinh khối vi khuẩn trên môi trường
thạch, huyền phù vào nước muối sinh lý, sau đó cho 200μl dịch huyền phù này cho
vào mỗi giếng ủ 36 giờ và đọc kết quả theo bảng sau:
Bảng 3.1: Hướng dẫn đọc kết quả bộ thử nghiệm sinh hoá IDS14GNR.

xanh lá đậm
Vàng lợt
6
Citrate
Không
xanh biển
Xanh lá/vàng
7
Esculin
Không
Đen
Không
8
Sinh H
2
S
Không
Đen
Không
9
Sinh indole
Kovac
Chuyển màu
đỏ
Không đổi màu
10
Voges – Poskauer
1 giọt KOH, 1 giọt
naphthol
Đỏ

đĩa có số khuẩn lạc trong khoảng 20 – 300.
Tính số lượng tế bào trên ml mẫu bằng công thức: N
di
= A x 10 x di. Trong đó:
- N
di
: số lượng tế bào ở độ pha loãng di
- A: số khuẩn lạc đếm được trên đĩa.
- d: số lần pha loãng i.
Xây dựng đường tương quan tuyến tính giữa OD và log(N/ml) bằng phần mềm
excel.
+ Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của vi khuẩn
Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ thích hợp cho sử phát triển của các chủng
đã phân lập phục vụ cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
Vật liệu: Bốn chủng vi khuẩn đã phân nhóm ở những thí nghiệm trên được
nuôi cấy trên môi trường cao-pep lỏng ở 20, 25, 30, 35, và 40
0
C và đo OD ở
bước sóng 610nm sau ba ngày.
+ Khảo sát ảnh hưởng của pH đến sự phát triển của vi khuẩn
Mục đích: Nhằm xác định nhiệt độ và pH tối ưu cho sự phát triển của các
chủng phân lập được để làm cơ sở cho những nghiên cứu ứng dụng sau này.
Tiến hành:
Cấy vi khuẩn vào các ống nghiệm chứa môi trường cao thịt-peptone lỏng với
các khoảng pH từ 4,0 – 8,5 (cách nhau 0,5). Nuôi cấy lắc 100vòng/phút, sau ba ngày
ghi nhận độ đục OD
610nm
.
3.2.6.7. Xác định đƣờng cong tăng trƣởng của vi khuẩn
Nhằm xác định thời gian thích hợp để thu sinh khối và các hoạt chất do vi

 Ly tâm 13000 vòng/phút, trong 5 phút  thu dịch nổi.
 Biến tính bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform (1:1).
 Ly tâm 13000 vòng/phút, 5 phút  thu dịch nổi.
 Biến tính lần hai bằng 500 l dung dịch phenol – chloroform, lắc nhẹ.
 Tủa DNA bằng 1ml cồn tuyệt đối lạnh, ly tâm 13000 vòng/phút ở 4
0
C
 thu tủa.
 Ly tâm 13000 vòng/phút trong 30 phút ở 4
0
C để thu tủa DNA.
 Rửa tủa bằng 250 l cồn 70
0
.
 Phơi mẫu cho khô cồn.
 Hòa tan tủa trong 20 l dung dịch TE 0,1X.
 Bổ sung 20 l dung dịch RNase (1mg/ml), ủ 37
0
trong 60 phút.
 Giữ ở 4
0
C
Sản phẩm DNA bộ gen đã ly trích được đánh giá tính nguyên vẹn khi điện di trên gel
agarose 1% và độ tinh sạch được đánh giá thông qua tỷ số OD
260nm
/OD
280nm
.
Sản phẩm DNA bộ gen ly trích bao gồm bốn chủng vi khuẩn Methylobacterium sp. đã
phân nhóm và DNA chủng đối chứng là vi khuẩn E.coli.

Hình 3.2: Chu trình nhiệt cho phản ứng với mồi 2F với 2R.
- Khuếch đại trình tự rDNA 16S nguyên vẹn của vi khuẩn Methylobacterium
phân lập được bằng cặp mồi FPGS6 và FPGS1509 và phối hợp sử dụng chung
cặp mồi 2R và 2F. Với kích thước đoạn DNA tạo ra là khoảng 500base và
1200base. Với chu trình nhiệt như sau:

Hình 3.3: Chu trình nhiệt cho phản ứng với cặp mồi FPGS6 với 2R và
FPGS1509 với 2F
3.3.3.3. Điện di và xem kết quả.
Sản phẩm sau khi khuếch đại bằng PCR được điện di trên gel agarose 2% ở
điện thế 50V trong 40 phút.
Sản phẩm điện di được ghi nhận bằng cách nhuộm ethidiumbromide và chiếu
dưới đèn UV(ultra-violet).
3.3.4. Giải trình tự.
Nhằm định danh chính xác và chi tiết hơn các chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. đã phân lập được, nên chúng tôi tiến hành giải trình tự để so
sánh với trình tự trên ngân hàng gen của NCBI (Mỹ).
Trình tự DNA của sản phẩm PCR của vi khuẩn được đọc bằng phương pháp
PCR trực tiếp tại Hàn Quốc.
Trình tự DNA được đọc theo hai chiều xuôi và ngược. 39
Sản phẩm PCR của các chủng vi khuẩn có kích thước khoảng 500base và 1200
base được pha loãng với nước cất khử ion sau đó tiến hành phản ứng PCR cho mẫu
pha loãng này nếu kết quả dương tính thì gởi mẫu pha loãng này để giải trình tự.
3.3.5. Xử lý kết quả giải trình tự.
Kết quả giải trình tự được xử lý độ chính xác bằng phần mềm fastPCR, so sánh
với trình tự trên ngân hàng gen bằng phần mềm BLAST, so sánh độ tương đồng của
trình tự của các chủng so với các chủng đã công bố bằng phần mềm CluxtalX và dựng

Mục tiêu: Theo công trình nghiên cứu của J. U. Ackermann và ctv (1995), Trâm
(2006), cho rằng một số chủng Methylobacterium sp. có khả năng sinh tổng hợp nhựa
sinh học (PHB) nên chúng tôi tiến hành thí nghiệm định tính khả năng sinh tổng hợp
PHB của các chủng đã phân lập nhằm sàng lọc sơ bộ các chủng có khả năng tổng hợp
PHB.
Vi khuẩn thí nghiệm: Bốn chủng vi khuẩn đã định danh trong thí nghiệm sinh
hóa, sinh ly ở trên. 40
Phương pháp tiến hành: Lấy 1 – 2 giọt huyền phù sinh khối vi khuẩn (có OD
600

khoảng 0,1) đặt lên tấm lam sạch. Hơ qua ngọn lửa đèn cồn nhiều lần để cố định tế bào
trên lam. Nhuộm tế bào đã được cố định bằng một giọt phẩm nhuộm Nile Blue A
trong 10 phút ở 55
0
C. Sau khi nhuộm xong, phẩm thừa được rửa sạch bằng nước máy
với bình xịt tia mạnh và sau đó rửa lại lần nữa với dung dịch acid acetic 8% trong 1
phút, dùng giấy thấm lau khô mẫu, cho một giọt nước lên lam đậy lamen lại.
Mẫu sau khi xử lý được quan sát dưới kính hiển vi huỳnh quang ở bước sóng 460nm.
Ở bước sóng ánh sáng này, các hạt PHB trong tế bào được nhuộm sẽ có màu cam sáng
trên nền tế bào màu đen.