BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

CHU LÝ HẢI ANH
KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI KHUẨN
METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ
QUAN Ở CÂY LÚA (Ozyra sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO Luận văn kỹ sƣ
Chuyên Ngành: Công nghệ sinh học

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2006
MINISTRY OF EDUCATION AND TRAINING
NONG LAM UNIVERSITY, HCMC
DEPARTMENT OF BIOTECHNOLOGY
STUDYING EFFECT OF METHYLOBACTERIUM SP. ON
MORPHOGENESIS OF IN VITRO RICE (Ozyra sativa L)
Engineer Thesis
Major: Biotechnology

Research adviser Researcher
BÙI VĂN LỆ, PROF, PhD CHU LÝ HẢI ANH

2.3.1 Sự tái sinh mẫu cấy (sự tạo cơ quan)…………………………… 10
2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ cơ quan………………………………………….11
2.3.3 Ảnh hƣởng của một số môi trƣờng và điều kiện nuôi cấy trên sự
nuôi cấy tế bào…………………………………………………………….13
2.3.3.1 Môi trƣờng nuôi cấy………………………………………13
2.3.3.2 Các nhân tố vật lý…………………………………………13
2.3.3.3 Ảnh hƣởng của chất điều hòa tăng trƣởng thực vật……14
2.4 Ảnh hƣởng của vi sinh vật lên sự phát triển thực vật………………….14
2.5 Đặc điểm của chi Methylobacterium…………………………………… 15
2.5.1 Lịch sử phát hiện và phân loại…………………………………….15
2.5.2 Đặc điểm sinh thái………………………………………………….17
2.5.3 Đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa…………………………… 18

v

2.5.4 Các ứng dụng của vi khuẩn Methylobacterium sp……………… 19
2.5.4.1 Tƣơng tác với thực vật…………………………………… 19
2.5.4.2 Sinh tổng hợp auxin và cytokinin………………………….23
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP……………………………………………24
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu……………………………………….24
3.2 Vật liệu nghiên cứu……………………………………………………….24
3.2.1 Đối tƣợng nghiên cứu………………………………………………24
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ dùng trong nghiên cứu………………………27
3.2.3 Mẫu cấy và điều kiện nuôi cấy………………………………… 27
3.3.4 Nhân sinh khối và giữ giống vi khuẩn………………………… 27
3.3.5 Môi trƣờng nuôi cấy……………………………………………… 28
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu…………………………………………………28
3.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu (mô sẹo)…………………………………… 28
3.3.2 Nhân sinh khối vi khuẩn…………………………………………….30
3.3.3 Nội dung thí nghiệm…………………………………………………30

4.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh chồi từ
mô sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………….50
4.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tái sinh rễ từ mô
sẹo của giống lúa VĐ20…………………………………………………………53
4.8 Thí nghiệm 8: Ảnh hƣởng của chủng 1019 lên khả năng tăng sinh mô sẹo
của giống lúa VĐ20…………………………………………………………… 55
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ…………………………………………………… 58
5.1 Kết luận…………………………………………………………………… 58
5.2 Đề nghị……………………………………………………………………….59
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

vii

CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D : Dichlorophenoxy-acetic acid
Aux : Auxin
BAP : 6-Benzylamino-purin
Cs : Cộng sự
Cyt : Cytokinin
MS : Murashige-Skoog
MMS : Methanol mineral salts
NAA : α-naphthalene acetic acid

viii

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 4.1: Ảnh hƣởng của nồng độ 2,4-D đến kích thƣớc mô sẹo (cm) sau 4 tuần
nuôi cấy……………………………………………………………………… 36
Bảng 4.2: Ảnh hƣởng của nồng độ BAP và NAA đến tỷ lệ tái sinh chồi từ mô

Hình 4.2: Các mô sẹo ở thí nghiệm 1 sau 5 tuần nuôi cấy…………………….38
Hình 4.3: Mô sẹo tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP và 1mg/l
NAA sau 5 tuần nuôi cấy………………………………………………………42
Hình 4.4: Các mẫu mô tái sinh chồi ở thí nghiệm 2 sau 5 tuần nuôi cấy………42
Hình 4.5: Mô sẹo tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA sau 5 tuần
nuôi cấy…………………………………………………………………………44
Hình 4.6: Các mẫu mô tái sinh rễ ở thí nghiệm 3 sau 5 tuần nuôi cấy…………45
Hình 4.7: Sự tạo mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l 2,4-D: (a) có bổ sung
1ml dung dịch khuẩn, (b) không có bổ sung khuẩn sau 2 tuần nuôi cấy……….47
Hình 4.8: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP và 0,5mg/l
NAA: (a) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (b) không bổ sung khuẩn sau 4 tuần
nuôi cấy…………………………………………………………………………49

x

Hình 4.9: Sự tăng sinh mô sẹo trên môi trƣờng MS bổ sung 1mg/l BAP, 0,5mg/l
NAA và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (5.4)…………………49
Hình 4.10: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA
và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.2)……………………… 52
Hình 4.11: Sự tái sinh chồi trên môi trƣờng MS bổ sung 2mg/l BAP, 1mg/l NAA
và 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (6.4)……………………… 52
Hình 4.12: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 0,5ml dung
dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.2)……………………………………… 54
Hình 4.13: Sự tái sinh rễ trên môi trƣờng MS bổ sung 1,5mg/l NAA và 1,5ml dung
dịch vi khuẩn sau 4 tuần nuôi cấy (7.4)……………………………………… 55
Hình 4.14: Sự tăng sinh mô sẹo ở thí nghiệm 8 trên môi trƣờng MS không bổ sung
hormone: (a) không có bổ sung khuẩn, (b) bổ sung 0,5ml dung dịch vi khuẩn, (c)
bổ sung 1ml dung dịch vi khuẩn, (d) bổ sung 1,5ml dung dịch vi khuẩn sau 4 tuần
nuôi cấy……………………………………………………………………… 57


Đề tài đƣợc thực hiện tại trại thực nghiệm – khoa Sinh học - trƣờng Đại học
Khoa học Tự nhiên trên đối tƣợng là giống lúa VĐ20 và chủng vi khuẩn
Methylobacterium sp. 1019. Tiến hành nhân sẹo, tạo chồi, tạo rễ từ mô sẹo của
giống lúa VĐ20 bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro, sau đó khảo sát ảnh hƣởng
của chủng 1019 lên khả năng phát sinh cơ quan của mô sẹo bằng cách bổ sung
những nồng độ khuẩn khác nhau vào môi trƣờng nuôi cấy với 34 nghiệm thức,
mỗi nghiệm thức 3 lần lặp lại với các chỉ tiêu nhƣ tỷ lệ tái sinh, số chồi trên mẫu,
số rễ trên mẫu, đƣờng kính mô sẹo.
Những kết quả thu đƣợc:
- Chủng 1019 có tác dụng kích thích sự phát triển rễ, ức chế khả năng tái
sinh chồi và thay đổi trạng thái, cấu trúc của mô sẹo. Chứng tỏ chủng
khuẩn có tác động đến quá trình trao đổi chất, sinh lý, sinh hóa của tế bào
mô sẹo, ảnh hƣởng đến sự phát sinh hình thái của sẹo.
- Chủng 1019 có ảnh hƣởng đến quá trình phát sinh hình thái của giống lúa
VĐ20, chiều hƣớng phát sinh cơ quan tuỳ thuộc vào bản chất của mô cấy
và loài thực vật.
- Nồng độ khuẩn cao sẽ ức chế hoàn toàn mô sẹo, không thấy đƣợc sự phát
sinh cơ quan từ mô sẹo.

xiii Em xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Phó Giáo sư- Tiến sĩ Bùi Văn Lệ. Ngƣời đã gợi ý đề tài, luôn giúp đỡ và tận

Nụng Lõm TPHCM. Nhng ngi ó ging dy v truyn t cho em nhng kin
thc quý giỏ trong thi gian hc tp ti trng.

Ton th quớ thy cụ trong b mụn Sinh hc. Trng i hc Khoa hc T
nhiờn - i hc Quc gia TPHCM. Nhng ngi ó to iu kin thun li v
úng gúp nhiu ý kin trong sut quỏ trỡnh thc hin khúa lun ny.

Tp th cỏc bn sinh viờn khúa DH02SH, Trng i hc Nụng Lõm
TPHCM, v cỏc bn thõn ó giỳp v ng viờn tụi trong sut quỏ trỡnh hc tp
cng nh thc hin khoỏ lun ny.

Cỏc anh, ch v cỏc bn sinh viờn khoa Cụng ngh sinh hc, Trng i hc
Khoa hc T nhiờn - i hc Quc gia TPHCM, ó giỳp v ng viờn em
trong thi gian thc hin khúa lun.

Con xin t lũng thnh kớnh v bit n Ba, M. Ngi ó sinh thnh v
dng dc con.

Con xin t lũng thnh kớnh v bit n B ngoi, B ni. Ngi ó ht lũng
thng yờu, dy d con cú c ngy hụm nay.

Con xin t lũng bit n Cụ, Dỡ, Dng ó thng yờu v ng viờn con. 1 GIỚI THIỆU
…Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ẢNH HƢỞNG CỦA VI
KHUẨN METHYLOBACTERIUM SP. LÊN SỰ PHÁT SINH CƠ QUAN Ở
CÂY LÚA (Oryza sativa L) NUÔI CẤY IN VITRO”.

Mục đích
Tìm hiểu ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên sự phát sinh
cơ quan cây lúa: mô sẹo, chồi, rễ.
Yêu cầu
Xác định nồng độ kích thích tố thích hợp đến khả năng tạo mô sẹo, nhân
sẹo, tạo chồi, nhân chồi, tạo rễ ở cây lúa bằng phƣơng pháp nuôi cấy in vitro.
Khảo sát ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. lên khả năng tạo
mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ ở cây lúa.
So sánh ảnh hƣởng của vi khuẩn Methylobacterium sp. với ảnh hƣởng của
các kích thích tố lên sự phát sinh cơ quan.

3 TỔNG QUAN
2.1. Giới thiệu về cây lúa
Lúa là cây lƣơng thực chính cho nhiều ngƣời và đồng thời lúa gạo cũng
tham gia vào các hoạt động kinh tế quan trọng nhất trên thế giới. Châu Á là nơi
sản xuất 90% tổng sản lƣợng và cũng là nơi tiêu thụ lúa gạo nhiều nhất. Khoảng
85% sản lƣợng gạo, 72% lúa mì và 19% ngô đƣợc con ngƣời tiêu thụ trực tiếp
[38]. Lúa gạo cung cấp 21% năng lƣợng và 15% protein cho loài ngƣời [30].
Từ 1989 trở lại đây, Việt Nam trở thành một trong những nƣớc xuất khẩu
gạo hàng đầu trên thế giới. Năm 2001 các nƣớc xuất khẩu gạo chính (tính theo

Cây lúa đƣợc canh tác từ vĩ tuyến 40
0
phía nam bán cầu đến vĩ tuyến 53
0

của bắc bán cầu, và đƣợc trồng từ mặt đất thấp hơn mặt nƣớc biển cho đến độ cao
2000m trên mặt biển. Trên thế giới có 20 loài lúa hoang và 2 loài canh tác. Cây lúa
hiện đƣợc canh tác đại trà để cung cấp lƣơng thực cho con ngƣời trên thế giới là
Oryza sativa L. ở châu Á, có năng suất cao và đƣợc ƣa chuộng. Loài lúa Oryza
glaberrima Steud. đƣợc canh tác ít hơn ở Tây châu Phi, có năng suất và chỉ số thu
hoạch thấp hơn O.sativa.
Các cuộc nghiên cứu trên đất gạch bằng trấu trong các thành phố danh tiếng
đổ nát ở Ấn Độ và trong vùng sông Cửu Long nhƣ Myanma, Thái Lan, Lào,
Campuchia và Việt Nam phát hiện rằng cây lúa trồng ở Đông Dƣơng do phát triển
theo 2 ngả: từ Lào theo sông Cửu Long đi xuống phƣơng nam có đặc tính cây lúa
Japonica nhiệt đới, một ngả khác từ Ấn Độ qua vịnh Bengal đến bờ biển Đông
Dƣơng, với đặc tính của cây lúa Indica. Vì vậy, Việt Nam với khí hậu nhiệt đới
nằm trong vùng đa dạng sinh thái của thảo mộc gồm cả cây lúa Indica và Japonica
nhiệt đới [7].
5
2.1.3 Đặc điểm hình thái
O. sativa là cây thân thảo, hệ thống rễ chùm, sống hằng năm, có thời gian
sinh trƣởng thay đổi tùy theo giống lúa, vụ trồng, nơi trồng vá các điều kiện sinh
thái và kéo dài trong khoảng từ 75-250 ngày.
Cây mọc thẳng đứng hay mọc nghiêng rồi bò dài (lúa nổi), lúa sống ở cạn, đất
cao hay nƣớc ngập chân hoặc một phần thân hay trong nƣớc sâu 2-4m.
Thân cao từ 70-150cm, một số giống lúa nổi có thân cao 2-3m, hay 5-6m (lúa

Hình 2.1: Oryza sativa L.

2.1.4 Đặc điểm hạt lúa
Cơ cấu hạt lúa là quả dĩnh nhỏ gồm có:
 Vỏ trấu gồm trấu trên và trấu dƣới.
 Cám gồm biểu bì, quả bì và chủng bì (nucellus). Màu sắc hạt gạo do lớp
chủng bì.
 Phôi nhũ gồm có lớp aleuron và phôi nhũ tích tụ tinh bột.
 Mầm cây gồm có phôi (mầm) lá, phôi rễ và trụ phôi giữa ở phần dƣới
của hạt.
Hạt lúa là noãn sào thụ tinh đã chín, có hai mày trấu nhỏ trên và dƣới, hai
vỏ trấu trên và dƣới, cuống trấu ở phần dƣới của hạt và đuôi ở chót hạt (ngắn hoặc
dài). Một hạt lúa có trọng lƣợng từ 12 – 44 mg ở 0% ẩm độ.

7
Hình 2.2: Cấu trúc hạt lúa
Theo IRRI, hạt gạo đƣợc phân loại theo chiều dài của hạt gạo nhƣ sau: rất
dài: > 7,50 mm, dài: 6,61 – 7,50 mm, trung bình: 5,51 – 6,60 mm, và ngắn: < 5,50
mm. Theo Ủy ban thực phẩm Codex (1990), sự xếp hạng gạo theo tỉ lệ bề dài –
đối với – bề rộng nhƣ sau: hạt dài: 3,1, hạt trung bình: 2,1 – 3,0, và hạt ngắn:
2,0 [38].

mô tế bào
Tính chất biến dị này đã đƣợc biết với các đột biến nhƣ đặc tính kháng bệnh,
kháng mặn, kháng độ độc nhôm, đặc tính chiều cao và thời gian sinh trƣởng. Trên
lúa, Oono (1981, 1983) đã ghi nhận sự biến dị của một số đặc tính con lai trong
nuôi cấy mô, quan sát dòng R2 có 52% biểu hiện dạng hình mới [51], [52], [58] .
Schaeffer và cs (1984) đã tìm thấy biến dị đối với đặc tính dạng hạt, hàm lƣợng
protein, chiều cao, số chồi khi nuôi cấy túi phấn của giống Calrose 76 [56]. Nguồn
biến dị đƣợc kích thích bởi kỹ thuật nuôi cấy mô của con lai cần đƣợc nhấn mạnh
9 đặc biệt về cách du nhập các gen trong những genome khác nhau mà trong đó
không có tính chất tƣơng đồng của nhiễm thể.
* Khai thác biến dị phôi (somatic embryogenesis)
Nuôi cấy tế bào phôi đang trở nên quan trọng đối với việc tạo ra một tần suất
cao của sự tái sinh từ tế bào, từ hạt phấn, từ tế bào trần cũng nhƣ các tế bào
chuyển nạp. Ngƣời ta tạo ra hạt tổng hợp (synthetic seeds) bằng cách nuôi cấy tế
bào phôi, sau đó bảo quản phôi trƣởng thành trong túi (encapsulation) để làm vật
liểu giống cây trồng. Đối với lúa nghiên cứu hạt tổng hợp vẫn còn rất mới mẻ, cần
nghiên cứu sâu hơn invitro để phát triển các phôi somatic có thể nảy mầm thành
cây. Kỹ thuật hạt giống tổng hợp trên cây lúa có tiềm năng rất lớn để khai thác ƣu
thế lai, vì nó giúp cho việc nhân giống, cũng nhƣ phát triển các cây lai có ƣu thế
mạnh đƣợc sớm đƣa ra sản xuất rộng rãi [2].
* Kỹ thuật chuyển nạp gen và sản xuất cây lúa transgenic
Các tiến bộ gần đây trong nuôi cấy mô và sinh học phân tử đã mở ra những
hƣớng mới trong thu nhập các gen lạ vào cây trồng. Gen lạ đƣợc lắp ghép thành
công ở nhiều loài cây trồng thông qua vi khuẩn Agrobacterium cũng nhƣ phƣơng
pháp chuyển nạp DNA trực tiếp [61].
Có 2 cách để đƣa vật liệu di truyền ngoại lai ở dạng từng gen riêng biệt vào
tế bào thực vật:

Sự phát sinh cơ quan từ mô sẹo tƣơng tự nhƣ sự phát sinh cơ quan trực tiếp
từ mẫu cấy. Khi thay đổi thành phần và nồng độ các chất điều hòa sinh trƣởng
thực vật thì tế bào mô sẹo lại đƣợc cảm ứng để phân hóa tạo cơ quan [13].
Tái sinh cây từ mô sẹo lúa: khi đƣờng kính mô sẹo đạt 0,5-1mm, mô sẹo
sẽ đƣợc cấy chuyền sang môi trƣờng tái sinh. Nếu các mô sẹo còn non (0,5mm
hay nhỏ hơn) mà đã cấy chuyền sang môi trƣờng tái sinh thì sẽ bị chết nhiều và
cho số chồi xanh ít. Mô sẹo càng già thì khả năng tái sinh càng kém. Vì vậy nên
chọn những mô sẹo trung bình và đang tăng trƣởng tốt để cấy chuyền. Kích thƣớc
mô sẹo tăng khá nhanh, sau vài tuần, trên một số mô sẹo xuất hiện những điểm
xanh, từ những điểm xanh này sẽ hình thành chồi và phát triển thành cây [13]. 11
2.3.2 Sự tạo mô sẹo từ mô hay cơ quan
Kỹ thuật tạo mô sẹo đƣợc tiến hành lần đầu tiên vào cuối những năm 1920,
đầu những năm 1930, và là một trong những phƣơng pháp đầu tiên của kỹ thuật
nuôi cấy mô trong nhiều năm [59]. Trong phƣơng pháp này, mô sẹo ở những điều
kiện môi trƣờng thích hợp có thể tái sinh cơ quan theo chiều hƣớng mà ta mong
muốn, tạo ra những vật liệu sử dụng trong các phƣơng pháp sinh học khác nhƣ:
chuyển gen, chọn lọc dòng soma, tạo giống cây sạch bệnh…
Mô sẹo (callus) là một khối tế bào không có tổ chức, có đặc tính phân chia
mạnh, hình thành từ các mô hoặc cơ quan đã phân hóa dƣới các điều kiện đặc biệt:
có vết thƣơng, xử lý các chất điều hòa tăng trƣởng nhƣ 2,4- D trong tối… Các tế
bào thuộc các mô hoặc các cơ quan này, trừ tế bào của mô phân sinh, phải chịu
một sự phản phân hóa trƣớc lần đầu tiên. Sự phản phân hóa có vai trò rất quan
trọng, nó cho phép một tế bào đã trƣởng thành trở lại trạng thái trẻ (trẻ hóa). Sự trẻ
hóa giúp tế bào tái lập khả năng phân chia và tạo phôi soma trong điều kiện thích