21

PHẦN 3. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
3.1.1. Thời gian
Thời gian tiến hành từ ngày 14/04/2005 đến ngày 15/09/2005
3.1.2. Địa điểm
Thí nghiệm đƣợc tiến hành tại phòng thí nghiệm vi sinh, khoa Chăn nuôi Thú y
và Trung tâm phân tích Hóa Sinh trƣờng Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng nghiên cứu
Vi khuẩn có khả năng tạo acid lactic
3.2.2. Vật liệu nghiên cứu
- Chế phẩm Biolactyl của Pháp
- Chế phẩm Antibio của Hàn Quốc
- Đại mạch của trƣờng Cao đẳng Công nghiệp Thực Phẩm Tp. HCM
3.2.3. Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Thiết bị: tủ cấy vô trùng, tủ ấm, tủ sấy, kính hiển vi, cân điện tử, máy đo pH,
máy li tâm, máy đo OD, nồi hấp áp suất, tủ lạnh, máy cất nƣớc và bếp điện.
- Dụng cụ: ống eppendorf, erlen, cốc, bình định mức, ống đong, đĩa petri, ống
nghiệm, buret, phễu chiết, pipet và pipetman.
3.2.4. Môi trường nuôi cấy
- Môi trƣờng MRS broth (de Man, Rogosa and Sharpe broth) [36]
- Môi trƣờng MRS agar (de Man, Rogosa and Sharpe agar)

sẽ bị tan khi tác dụng với acid tạo nên vòng trong suốt quanh
khuẩn lạc.
+ Thực hiện
* Pha loãng mẫu trong nƣớc cất vô trùng với các độ pha loãng khác nhau.
* Trãi đều 0,1 ml mẫu ở các nồng độ pha loãng lên môi trƣờng MRS agar. Nuôi
cấy ở nhiệt độ 37
o
C và theo dõi sự phát triển khuẩn lạc sau 48 giờ.
* Chọn những khuẩn lạc mọc riêng lẻ, cấy ria trên môi trƣờng YGC agar. Nuôi cấy
ở nhiệt độ 37
o
C. Sau 48 giờ, chọn các khuẩn lạc sinh acid nhờ vào vòng trong suốt xuất
hiện quanh khuẩn lạc. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều.
- Môi trƣờng MRS broth
Cấy vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS dịch thể. Nuôi cấy
tĩnh ở nhiệt độ 37
o
C. Ghi nhận các đặc điểm sinh trƣởng trong 24 giờ.
3.3.1.2. Quan sát vi thể
Hình thái: Nhuộm Gram để quan sát hình thái tế bào ở vật kính x100 [5] (Xem ở
mục 3.2 phần phụ lục).
3.3.2. Chọn giống có khả năng sinh acid lactic [6], [11], [31]
- Thực hiện
+ Cấy vi khuẩn đã phân lập đƣợc vào ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng MRS
dịch thể. Nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ 37
o
C trong 24 giờ.
+ Li tâm thu dịch trong.
45
o
C, 50
o
C. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có 10 % mật rỉ và 0,5 % nấm
men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dich nuôi cấy tƣơng ứng.
- Ảnh hƣởng tỉ lệ mật rỉ
Chọn đƣợc pH, nhiệt độ thích hợp cho các khuẩn lạc. Khảo sát tỉ lệ mật rỉ: 5 %,
10 %, 15 %, 20 %. Lấy 10 % giống cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ nhƣ
trên và 0,5 % nấm men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch
nuôi cấy tƣơng ứng.
- Ảnh hƣởng tỉ lệ giống
Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ. Khảo sát tỉ lệ giống: 5 %, 10 %, 15 %, 20 %. Lấy
tỉ lệ giống nhƣ trên cho vào 10 ml môi trƣờng (gồm có tỉ lệ mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm
men). Sau 24 giờ, xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch nuôi cấy tƣơng ứng.
- Ảnh hƣởng thời gian
Chọn đƣợc pH, nhiệt độ, tỉ lệ mật rỉ, tỉ lệ giống. Lấy tỉ lệ giống đã chọn cho vào
10 ml môi trƣờng (gồm có mật rỉ đã chọn và 0,5 % nấm men). Đem khảo sát ở các thời
24

điểm 12 giờ, 24 giờ, 36 giờ, 48 giờ. Xác định lƣợng acid tổng tích lũy đƣợc trong dịch
nuôi cấy tƣơng ứng.
3.3.4.2. Đặc điểm sinh hóa
- Thử phản ứng catalase
25

+ Nguyên tắc của máy đo mật độ quang: vi sinh vật trong môi trƣờng nuôi cấy có
thể vừa hấp thu hoặc vừa phân tán ánh sáng làm cho ánh sáng truyền suốt bị giảm.
Nhƣ vậy, số lƣợng ánh sáng đƣợc hấp thu hoặc phân tán có quan hệ tỉ lệ thuận với số
lƣợng vi sinh vật trong dịch nuôi cấy.
+ Tƣơng quan giữa mật độ tế bào và OD 610 nm : Để hạn chế thao tác đếm số tế
bào mỗi khi lấy mẫu, mật độ tế bào sẽ đƣợc suy ra từ độ đục của dịch nuôi cấy bằng
cách dựa vào đồ thị tƣơng quan giữa mật độ tế bào và độ đục của dịch huyền phù ở các
OD khác nhau khi đo ở bƣớc sóng 610 nm.
+ Thực hiện
* Pha loãng dịch nuôi cấy vi khuẩn sau 24 giờ sao cho thu đƣợc dịch huyền phù
có các giá trị OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5.
* Đếm số lƣợng tế bào bằng phƣơng pháp đếm khuẩn lạc tƣơng ứng với 5 giá trị
OD = 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; 0,5. Suy ra mật độ tế bào trong 1 ml dịch huyền phù.
* Dựng đồ thị tƣơng quan tuyến tính giữa log mật độ tế bào (trục y) và độ đục
của dịch huyền phù ở các OD khác nhau (trục x).
3.3.6.3. Qui trình sản xuất 26

- Chuẩn bị môi trƣờng lên men
Trƣớc tiên phải xử lý mật rỉ: Mật rỉ đem pha loãng tỉ lệ 1 : 3, cho H
2
SO
4
vào với
tỉ lệ 3,5 ml H
2
SO
4
trong 1000 ml mật rỉ. Khuấy liên tục trong 1giờ, sau đó để lắng thu
đƣợc phần dịch và pha loãng dung dịch xuống phù hợp với tỉ lệ mật rỉ đã chọn, cho 0,5
% cao nấm men vào (điều chỉnh pH sau khi khử trùng bằng pH tối ƣu của khuẩn lạc
đem sản xuất acid lactic).
- Giai đoạn lên men
+ Chuẩn bị giống để lên men
* Giống cấp 1
Với các điều kiện đã khảo sát nhƣ pH, nhiệt độ tối ƣu cho từng khuẩn lạc. Cho 10
% giống vào 10 ml môi trƣờng MRS (môi trƣờng cấp 1) đem ủ ở các điều kiện thích
hợp của chúng, trong 24 giờ.
* Giống cấp 2
Cho 10 % giống từ môi trƣờng cấp 1 vào 50 ml môi trƣờng gồm 5 ml mật rỉ và


PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1. Phân lập và sơ chọn giống
4.1.1. Quan sát đại thể
4.1.1.1. Môi trường MRS agar và YGC agar
Từ các nguồn: Biolactyl, Antibio, Đại mạch, quá trình phân lập và làm thuần đƣợc
3 dạng khuẩn lạc sinh acid. Ký hiệu A, B, D. Khuẩn lạc A phân lập từ Antibio, khuẩn
lạc B từ Biolactyl và khuẩn lạc D từ Đại mạch.
Các khuẩn lạc trên đƣợc phân biệt dựa vào sự khác nhau về hình dạng và kích
thƣớc của khuẩn lạc.
- Trên môi trƣờng MRS agar
+ Khuẩn lạc A: Đƣợc ủ 48 giờ ở 37
o
C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: màu trắng
sữa, bóng ƣớt, bề mặt phẳng, hơi nhô lên, đƣờng kính khuẩn lạc 1,1 mm.

Hình 4. 1: Hình dạng khuẩn lạc A
+ Khuẩn lạc B: Đƣợc ủ 48 giờ ở 50
o
C đặc điểm khuẩn lạc nhƣ sau: tròn, bề mặt
khuẩn lạc hơi lồi, láng bóng, vun tròn và mép khuẩn lạc có bề phẳng và nhẵn bóng,
đƣờng kính khuẩn lạc 1,4 mm.

Hình 4. 2: Hình dạng khuẩn lạc B
28 Từ hình 4.4, 4.5 và 4.6 chúng tôi thấy khuẩn lạc A có vòng trong suốt rộng nhất,
kế đến khuẩn lạc D, cuối cùng khuẩn lạc B. Do khuẩn lạc A, B và D có khả năng
chuyển hóa đƣờng thành acid nên phân giải CaCO
3
trong môi trƣờng tạo nên vòng
trong suốt. Vòng trong suốt càng lớn chứng tỏ lƣợng acid sinh ra càng nhiều.
4.1.1.2. Môi trường MRS broth
Sau khi nuôi vi khuẩn trên môi trƣờng MRS dịch thể chúng tôi thu đƣợc kết quả
sau:

Hình 4. 7: Khả năng phát triển trong môi trƣờng MRS dịch thể của các khuẩn lạc A,
B và D.
Từ hình 4.7 chúng tôi thấy:
Khuẩn lạc A: Làm đục môi trƣờng, lắng nhiều sinh khối ở đáy, không tạo váng.
Khuẩn lạc B: Làm đục môi trƣờng, lắng ít sinh khối ở đáy, không tạo váng.
Khuẩn lạc D: Làm đục môi trƣờng, lắng rất ít sinh khối ở đáy, không tạo váng.
Do khuẩn lạc A thích nghi nhanh trên môi trƣờng MRS, phát triển tốt cho nên tạo
sinh khối nhiều hơn khuẩn lạc B và D.
4.1.2. Quan sát vi thể
Sau khi tiến hành nhuộm Gram của các khuẩn lạc A, B và D chúng tôi thu đƣợc
kết quả sau:

Hình 4. 8: Nhuộm Gram của khuẩn lạc A, xem ở vật kính x 100