39

39

- Qui trình 3: Phương pháp biến đổi.
Bảng 3.2: Các quy trình ly trích
Quy
trình
Bƣớc
1
2
3
1. Phá
vỡ
màng
tế bào,
màng
nhân.
- Đồng nhất mẫu.
- Bổ sung 1,2 ml đệm
trích 1.

- Ủ 45 phút ở 65
o
C.
- Ly tâm 5000 vòng/phút
trong 30 phút, thu dịch
nổi.
- Đồng nhất mẫu.
- Bổ sung 300 µl nước
cất và 500 µl đệm trích

phenol/chloroform, đảo
nhẹ.
- Ly tâm 5000 vòng/phút
trong 15 phút, thu dịch
nổi.
- Bổ sung 500 µl
chloroform, đảo nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 500 µl
chloroform, đảo nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 1 lần thể tích
phenol/chloroform, đảo
nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
3.Tủa
DNA
- Bổ sung 0,1 lần thể tích
dung dịch potassium
acetate 3M và 2,5 lần
thể tích ethanol tuyệt
đối.
- Bổ sung 2 lần dung
dịch CTAB tủa.

vòng/phút trong 10
phút, thu tủa.
- Bổ sung 0,6 lần thể
tích isopropanol.
- Ủ 30 phút hay qua đêm
ở - 20
o
C.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu tủa.
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Hòa tan tủa trong 350
µl NaCl 1,2M.
- Bổ sung 350 µl
phenol/chloroform, đảo
nhẹ.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút, thu dịch nổi.
- Bổ sung 0,6 lần thể
tích isopropanol.
- Ủ 30 phút hay qua đêm
ở - 20
o
C.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 10
phút ở 4

thu tủa.
- Để khô DNA.
- Hòa tan tủa bằng 30 µl
nước cất siêu sạch.
- Bổ sung 2 µl RNase, ủ
1 giờ ở 37
o
C
- Bảo quản DNA ở
-20
o
C
- Bổ sung 500 µl dung
dịch ethanol 70%.
- Ly tâm 16000
vòng/phút trong 15
phút ở nhiệt độ 4
o
C,
thu tủa.
- Để khô DNA.
- Hòa tan bằng 30 µl
nước cất siêu sạch.
- Bổ sung 2 µl RNase, ủ
1 giờ ở 37
o
C
- Bảo quản DNA ở
-20
o

bảng điện di xuất hiện một vạch sáng rõ với kích thước lớn.
Kết quả thí nghiệm là chúng tôi xác định được một quy trình ly trích tốt nhất
phục vụ cho ly trích DNA các mẫu thí nghiệm.

6. Thí nghiệm 2: Sàng lọc sản phẩm biến đổi gen
Mục tiêu
Phát hiện được mẫu sản phẩm biến đổi gen thông qua promoter 35S (123 bp)
bằng 2 phương pháp: PCR thông thường (đang được sử dụng) và phương pháp Real-
Time PCR (đề nghị). Đánh giá khả năng sử dụng phương pháp Real-Time PCR ở giai
đoạn sàng lọc mẫu so với phương pháp thông thường.

Nguyên tắc
Vùng promoter 35S được khuếch đại với cặp mồi đặc hiệu p35S-cf3/cr4 [33] .
Sau đó, sản phẩm khuếch đại sẽ được phát hiện và phân tích.
Sản phẩm khuếch đại vùng promoter 35S sẽ có đặc điểm như sau [33]:
- Kích thước: 123 bp
- Nhiệt độ nóng chảy: 86,5
o
C
Thí nghiệm được tiến hành theo 2 phương pháp:
- Phương pháp 1: PCR truyền thống (đang được sử dụng rộng rãi). Sản phẩm
được kiểm tra bằng phương pháp điện di trên gel agarose.
42

42

- Phương pháp 2: Real-Time PCR với thuốc nhuộm SYBR Green I (đề nghị).
Sản phẩm được kiểm tra bằng phân tích Melt curve.

Bảng 3.3: Đặc điểm cặp mồi p35S-cf3/cr4 (Công ty Proligo) [31]

- Máy luân nhiệt TECHNE
TC-312.
- Bộ điện di
- Máy chiếu tia UV
- Hệ thống Real-Time PCR iCycler MyiQ
TM

(Bio-Rad)
- Máy vi tính
- Phần mềm điều khiển MyiQ (Bio-Rad)
43

43

Phƣơng pháp thực hiện
Thành phần phản ứng PCR và Real-Time PCR
Thành phần một phản ứng PCR trong ống eppendorf 0,2 ml như sau

Bảng 3.5: Thành phần một phản ứng PCR trong thí nghiệm 2
Phƣơng pháp 1
Phƣơng pháp 2
Thành phần
Nồng độ
cuối
Thành phần
Nồng độ
cuối
0,5 µM
0,5 µM 10 - 50 ng

Tổng thể tích
25 μl
Tổng thể tích
25 μl

Chƣơng trình nhiệt cho phản ứng khuếch đại

Bảng 3.6: Chƣơng trình nhiệt khuếch đại của thí nghiệm 2
Giai đoạn
Nhiệt độ
Thời gian
Biến tính ban đầu
95
o
C
3 phút
Biến tính
Bắt cặp
Kéo dài
Số chu kỳ
95
o

Điện di trên gel agarose 2% với thang
100 bp Molecular Ruler (Bio-Rad)
Nguyên tắc: Khác biệt kích thước sản
phẩm khuếch đại
Phân tích Melt curve

Nguyên tắc: Khác biệt nhiệt độ nóng
chảy sản phẩm khuếch đại

Phương pháp 1: Điện di trên gel agarose
- Chuẩn bị gel agarose 2%.
- Bơm sản phẩm PCR vào giếng với đối chứng dương, âm và thang 100 bp
Molecular Ruler.
- Điện di 100V trong 25 phút.
- Ngâm bản gel trong dung dịch TAE 1X có chứa ethidium bromide (nồng độ
0,01 mg/ml) trong 15 phút.
- Soi dưới đèn UV và đọc kết quả bằng mắt thường.
Phương pháp 2: Phân tích Melt curve
Bước này được thiết lập trên máy vi tính cùng với chương trình chạy PCR và tự
động thực hiện ngay sau khi phản ứng khuếch đại DNA hoàn tất. Sản phẩm khuếch đại
được nung biến tính từ từ. Tín hiệu huỳnh quang thu nhận sẽ được máy tính phân tích.
Chương trình nhiệt được thiết lập như sau:

Bảng 3.8: Chƣơng trình nhiệt phân tích Melt curve
Nhiệt độ
ban đầu
Nhiệt độ
cuối
Nhiệt độ tăng
mỗi chu kỳ

tiêu phân tích gồm có:
Phân tích các đỉnh nhiệt độ nóng chảy trên biểu đồ –dF/dT so với
nhiệt độ (-dF/dT vs Temperature)
Xác định sự hiện diện của đỉnh nhiệt độ nóng chảy ở 86,5
o
C tương
ứng với đoạn khuếch đại đặc hiệu vùng promoter 35S. Hình 3.1: Màn hình Melt Curve

Kết quả thí nghiệm 2 giúp chúng tôi so sánh hiệu quả của 2 phương pháp sáng
lọc sản phẩm biến đổi gen hiện nay, đó là phương pháp PCR truyền thống và phương
pháp Real-Time PCR và đề nghị một phương pháp cho quy trình sàng lọc các sản
phẩm biến đổi gen
46

46

7. Thí nghiệm 3: Xác định phƣơng pháp định lƣợng sản phẩm biến đổi gen
Mục tiêu
So sánh phương pháp định lượng promoter 35S bằng kỹ thuật Real-time PCR
với thuốc nhuộm SYBR Green I và với mẫu dò Taqman. Xác định độ chính xác của 2
phương pháp ở các lần lặp lại và nồng độ pha loãng khác nhau. Xác định khả năng ứng
dụng của 2 phương pháp này.

Nguyên tắc
Vùng promoter 35S của mẫu thí nghiệm được khuếch đại đặc hiệu. Tín hiệu
huỳnh quang của mẫu (từ thuốc nhuộm SYBR Green I hay mẫu dò Taqman) sẽ được
máy thu nhận và phân tích.

- Các thí nghiệm với mẫu.
Nhằm so sánh 2 phương pháp định lượng, chúng tôi quyết định thí nghiệm các
vấn đề sau:

Xây dựng đƣờng chuẩn định lƣợng p35S
Đường chuẩn định lượng có vai trò quuyết định trong việc định lượng DNA.
Nó được xây dựng dựa trên các mẫu chuẩn đã biết trước. Từ kết quả thí nghiệm nhận
được, các mẫu chưa biết sẽ được so với đường chuẩn để tính toán ra kết quả định
lượng. Vì vậy trong thí nghiệm này, chúng tôi thử nghiệm khả năng xây dựng đường
chuẩn của phương pháp Real-Time PCR với 2 loại hóa chất định lượng khác nhau
(SYBR Green I và mẫu dò đặc hiệu Taqman). Các chuẩn là chuẩn 35S của công ty
GeneScan. Do điều kiện thí nghiệm, chúng tôi sử dụng 3 chuẩn của công ty GeneScan
như sau

Bảng 3.9: Chuẩn 35S [29]
Chuẩn
Lƣợng lý thuyết
(số lƣợng phân tử) (copy)
Chuẩn 1
Chuẩn 2
Chuẩn 3
5120
640
80

Kết quả thí nghiệm sẽ được so sánh trên hệ số tương quan (Correlation
coefficient), hiệu quả PCR (PCR Efficiency), chu kỳ phát hiện các mẫu chuẩn, sự xuất
hiện các sản phẩm không đặc hiệu. Phương pháp tốt sẽ phải có hệ số tương quan
(Correlation coefficient) >0,98 , hiệu quả PCR (PCR Efficiency) từ 90-120 %, chu kỳ
phát hiện các mẫu chuẩn phải tỷ lệ với nhau và không xuất hiện các sản phẩm không

Thành phần
Nồng độ
cuối
- SYBR Green
Supermix Sample 2X
(Bio-rad)
- Mồi xuôi
- Mồi ngược
- DNA mẫu
- Nước cất siêu sạch
1X
0,5 µM
0,5 µM
50 ng
- 35S master mix (GMO
Quant 35S Screen
Corn Kit) (GeneScan) - DNA mẫu
- Nước cất siêu sạch
1X

50 ng

Nhiệt độ
Thời
gian
Đọc tín
hiệu
huỳnh
quang
Nhiệt độ
Thời
gian
Đọc tín
hiệu
huỳnh
quang
Giai đoạn 1
95
o
C
3 phút

95
o
C
10 phút

Giai đoạn 2
- Bƣớc 1
- Bƣớc 2
- Bƣớc 3
Số chu kỳ

15 giây
1 phút
x
Giai đoạn 3
72
o
C
4
o
C
7 phút

4
o
C
50

50

Cài đặt phần mềm điều khiển
Phần mềm điều khiển được cung cấp bởi công ty Bio-Rad. Sau khi cài đặt, ta có
thể khởi động chương trình và điều khiển sự hoạt động của máy từ máy vi tính. Các
bước tiến hành thiết lập một chương trình hoạt động như sau:
- Khởi động máy và đèn đọc tín hiệu. Máy cần được làm nóng khoảng 30