31
H
3
BO
3
HClO
3
Lactose
Na
2
HPO
4
CaCl
2
CuSO
4
Na
2
CO
3

3.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.5.1 Phương pháp thiết kế thí nghiệm

3.5.1.1 Tuyển chọn giống Asp. niger thích hợp nhất cho quá trình lên
men
Nuôi cấy hai giống Asp. niger nghiên cứu trên hai môi trường có cùng điều kiện.
Giống Asp. niger được cấy truyền trên môi trường thạch malt. Sau đó hai giống Asp.
niger nghiên cứu được nhân giống trên môi trường bán rắn có thành phần 75 % cám

mẫu mẫu lên men có độ ẩm thay đổi lần lượt: 50 %, 55 %, 60 %, 65 %. Thời gian lên
men là 5 ngày.
3.5.1.5 Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian lên men đến độ hòa tan và
cường độ màu
Sử dụng các kết quả nghiên cứu trên chúng tôi cố định các yếu tố sau: giống vi
sinh vật, tỷ lệ chế phẩm lên men, lượng chế phẩm lên men sử dụng và độ ẩm của chế
phẩm. Bố trí thí nghiệm lên men các mẫu cacao kết thúc ở các thời điểm: 3 ngày, 4
ngày, 5 ngày, 6 ngày và 7 ngày.
3.5.1.6 So sánh độ hòa tan và cường độ màu của bột ca cao từ phương
pháp lên men truyền thống và bột ca cao từ phương pháp lên
men có bổ sung vi sinh vật
Ứng dụng những kết quả đã đạt được ở các thí nghiệm trên trong việc lên men
Mẫu ca cao lên men không bổ sung vi sinh vật được lấy từ hộ nông dân Nguyễn
Văn Lập tại huyện Châu Thành, tỉnh Bến Tre.
Tiến hành qui trình sản xuất bột ca cao trong cùng điều kiện cho cả hai mẫu hạt
ca cao nói trên

3.5.2 Phương pháp vi sinh vật

3.5.2.1 Phương pháp cấy truyền và giữ giống
Môi trường PGA pha chế và bỏ vào 1/3 ống nghiệm, thanh trùng ở 121
o
C trong
15 phút, lấy ra và để nghiêng 45
o
cho đến khi thạch đông cứng lại. Sử dụng que cấy
móc đã thanh trùng cấy truyền sang môi trường PGA. Giống sau khi cấy được nuôi ở
nhiệt độ phòng thí nghiệm trong 3 ngày sau đó được bảo quản ở 4
o
C. Sau 2 tháng

)) x 100/10
Trong đó:
W: độ ẩm của mẫu (%)
10: khối lượng mẫu ban đầu (g)
m
1
: khối lượng đĩa petri (g)
m
2
: khối lượng đĩa petri và mẫu sau khi sấy (g)
m
2
– m
1
: khối lượng mẫu sau khi sấy
3.5.3.2 Phương pháp xác định độ hòa tan và cường độ màu của dung
dịch ca cao
Độ hòa tan trong luận văn này được định nghĩa là lượng chất tan (tính bằng g) có
trong 10 g bột ca cao, chỉ tiêu này được xác định bằng khúc xạ kế
Cân 10 g bột ca cao cho vào một becher, bổ sung 30 ml nước sôi, lọc lấy dịch giữ
lại cặn, thêm 20 ml nước sôi vào cặn trên, lọc lấy dịch. Dung dịch này được đem đi
xác định độ hòa tan bằng cách dùng khúc xạ kế.

34
Cũng dung dịch trên được đem đi xác định cường độ màu bằng máy đo độ hấp
thụ ánh sáng ở bước sóng thích hợp
3.5.3.3 Phương pháp xác định bước sóng mà dung dịch ca cao hấp thu
mạnh nhất
Thu dung dịch ca cao như trên. Tiến hành pha loãng lần lượt dung dịch trên thành
6 nồng độ khác nhau: pha loãng 1 lần, 2 lần. 3 lần. 4 lần. 5 lần. 6 lần. Đem đo độ hấp


iii. Phương pháp xác định N tổng số của hạt cacao
Tổng hữu cơ (%) = 100 % - Tổng tro hữu cơ (%)
N tổng số = N protein + N phi protein
Trước tiên ta phải vô cơ hóa mẫu để biến đổi tất cả các loại đạm nằm dưới dạng
nào đều trở thành dạng hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH
4
)SO
4
Vô cơ hóa
Nguyên tắc

35
Sự vô cớ hóa chất đạm là sự biến đổi tất cả các chất đạm dù dưới dạng nào (hữu
cơ, protein, vô cơ) thành hợp chất vô cơ là amonium sulfate (NH
4
)SO
4
bằng cách đun
sôi với H
2
SO
4
đậm đặc và chất xúc tác
Thực hành :
Cân chính xác 1 g nguyên liệu đã nghiền nhuyễn cho vào một bình cổ cao có
dung tích 60 ml đến 100 ml (bình Kieldahl). Thêm vào đó 5 ml H
2
SO
4

4
. Từ đây
cho phép ta xác định được lượng amoniac phóng thích ra, có nghĩa xác định được
lượng đạm có trong mẫu nguyên liệu.
Tiến hành
Đun sôi bình nước của máy Parnas – Warner. Đặt bình tam giác có chứa 20ml
H
2
SO
4
N/100 và vài giọt methyl vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng
chìm vào dung dịch. Hút 10 ml dung dịch vô cơ hóa cho vào máy Parnas – Wargner,
thêm vào đó 10 ml NaOH đậm đặc. Tiếp tục đun sôi bình nước và để cho hơi nước lôi
cuốn amoniac sang bình tam giác trong 3 phút, hạ bình tam giác xuống và tiếp tục đun
thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất, tất cả đều cho chảy vào
bình tam giác đựng H
2
SO
4
N/100. Lấy bình tam giác ra và định phân H
2
SO
4
thừa bằng
dung dịch NaOH N/100 cho đến khi dung dịch đổi màu.
Tính toán
Hàm lượng nitơ có trong mẫu được xác định theo công thức
12
( ).1,42. .100
(%)

định lượng nitơ tương ứng với 1 ml H
2
SO
4
1,42: số mg nitơ
iv. Phương pháp xác định đường tổng số hòa tan
Nguyên tắc
Sự định lượng này căn bản dựa trên phản ứng màu đặc trưng cho bởi đường và
nhiều chất hữu cơ với sự hiện diện của H
2
SO
4
. Để tạo phản ứng màu có thể dùng thuốc
thử khác nhau như phenol, antron hay orcinol
Sự chính xác của kết quả này phụ thuộc:
¾ Độ sạch dụng cụ
¾ Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H
2
SO
4

¾ Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun
Tiến hành
Nguyên liệu: lấy 1-2 g nguyên liệu tươi đã nghiền nhỏ chứa khoảng 5 – 50 mg
đường
Cho vào cốc thủy tinh 50 ml và thêm 10 ml cồn 90 % V vào.
Đun sôi trên nồi cách thủy 3 lần
Sau khi để nguội lọc qua lọc không tro
Sau đó thêm 10 ml cồn 80 % V vào cốc đựng bã, khuấy đều, đun hai lần tới sôi
trên nồi cách thủy. Để nguội lại tiếp tục lọc. Chiết rút như vậy khoảng 2 lần, xong đưa

acid mạnh và kiềm mạnh, không bị phân hủy dưới tác dụng của acid yếu còn các chất
khác thường đi kèm theo với cellulose như hemicellulose, lignin… ít bền hơn đối với
tác dụng của acid và kiềm, nên bị oxy hóa phân giải và tan vào dung dịch khi xử lý
nguyên liệu và dung dịch kiềm hoặc bằng hỗn hợp acid nitrit với acid acetic
Tiến hành
Cân 2 g hạt cacao đã nghiền nhỏ (sấy khô đến trọng lượng không đổi ở 100 – 105
o
C), cho vào bình tam giác dung tích 250 ml
Thêm vào bình 16.5 ml hỗn hợp gồm 1.5 ml acid nitric đậm đặc và 15 ml acid
acetic đặc. Lắp ống làm lạnh hồi lưu vào bình và đun sôi hỗn hợp 30 phút. Để nguội,
pha loãng hỗn hợp bằng nước nóng. Lọc qua giấy lọc đã biết trước trọng lượng
Rửa kết tủa cellulose 3 lần bằng nước cất nóng (mỗi lần từ 10 – 15 ml)
Rửa bằng rượu ethylic 96 % 1 – 2 lần, mỗi lần 10 – 15 ml
Rửa bằng ete ethylic
Sấy giấy lọc có chứa cellulose ở nhiệt độ 100 – 105
o
C đến trọng lượng không
đổi (2 – 3 giờ). Tùy theo nồng độ của thuốc thử đem dùng, cùng với cellulose thường
còn lại một hàm lượng nhỏ hemicellulose chủ yếu là pentosan và lignin. Do đó
cellulose xác định gọi là cellulose thô
Tính kết quả
Hàm lượng cellulose tính bằng công thức sau

38
.100a
X
w
=

Trong đó

.0,92.100w
P
B
=

Trong đó
w: trọng lượng kết tủa canxi pectat (g)

39
B: lượng pectin lấy đem xà phòng hóa khoảng 0.15 (g)
0.92: Hệ số chuyển đã trừ hàm lượng canxi trong kết tủa (nghĩa là pectin chiếm
92 % trọng lượng canxi pectat)
100: hệ số chuyển để biểu thị kết quả theo %.
3.5.4.2 Các phương pháp xác định hoạt tính enzyme của Asp. niger
i. Phương pháp trích ly enzyme từ môi trường nuôi cấy Asp. niger
Cân chính xác 1g môi trường nhân giống Asp. niger. Nghiền mẫu cùng bột thủy
tinh trong môi trường lạnh 4
o
C để tránh mất hoạt tính enzyme. Thêm 100 ml nước
muối 0,3 %, khuấy đều rồi đem lọc qua giấy lọc thu dung dịch enzyme 1%. Giữ lạnh
dung dịch và sử dụng trong vòng 2 ngày.
ii. Xác định hoạt tính CMCase
Nguyên tắc
Phương pháp này dựa trên sự thủy giải CMC (sodium carboxymetyl-cellulose)
bằng enzyme ở pH 5.0 và 40
o
C. Sau phản ứng thủy phân sẽ tạo ra một lượng đường
khử, đường khử sẽ phản ứng với 3,5-dinitrosalicylic acid và được xác định bằng máy
đo mật độ quang ở bước sóng 540 nm.
Cách thực hiện

nước lạnh.
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Dùng nước cất làm đối chứng (A
B
)
Phản ứng của các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm
Hút lần lượt 1 ml các dung dịch đường glucose chuẩn vào các ống nghiệm
Thêm vào 1 ml dung dịch cơ chất và lắc đều
Thêm vào 4 ml dung dịch lactose – DNS. Lắc đều
Dán nilon hay parafilm lên miệng ố nghiệm, đặt vào nồi nước sôi trong 15 phút.
Đưa về nhiệt độ phòng bằng nồi nước lạnh
Đo độ hấp thụ OD 540 nm. Sử dụng nước cất làm đối chứng (A
G
)
Đối với nước cất: làm tương tự như trên. Thay dung dịch glucose chuẩn bằng
nước cất. Đo OD 540 nm (A
W
)
Tính toán
Tính hệ số glucose
Hệ số glucose được tính bằng công thức
(/
G
GW
Cmgml
F
AA
=
−
)