11
nhiễm sắc thể và có chiều dài tổng cộng 1389cM từ cặp lai IR34538 (Indica) và
Bulu Dalam (Mc couch và ctv, 1998).
Trong những thập niên qua, di truyền Menden đã và đang bƣớc vào thời đại
mới, đƣợc gọi là hệ gen (Genomics), nghiên cứu về cấu trúc và chức năng của các
gen. Những thông tin về chuỗi mã DNA đã đƣợc giải mã trên một số loài điển
hình nhƣ lúa và Arapidopsis, nhƣng chức năng của các gen tìm thấy chƣa đƣợc
biết nhiều. Việc tạo ra đột biến trên cây trồng kết hợp với đánh dấu phân tử đang
đóng một vai trò quan trọng để giải quyết vấn đề trên, khi tác nhân gây đột biến
làm thay đổi các tính trạng mang gen mục tiêu. Các đánh dấu ứng dụng hiện nay
đƣợc xem nhƣ có hiệu quả đáng tin cậy là đánh dấu “siêu vệ tinh” hay còn gọi là
SSR (simple sequence repeats) và đang đƣa vào ứng dụng rộng đánh dấu “các thể
đa hình nucleotide đơn” hay SNP (Single nucleotid polymorphism) để xác định
đột biến.

2.4. Nghiên cứu di truyền gen axit phytic thấp
Kiểu gen và môi trƣờng là những nhân tố chính làm thay đổi tổng lƣợng
photpho trong hạt.Trong tự nhiên các kiểu gen điều khiển sự thay đổi lƣợng
photpho trong hạt chủ yếu là tăng hay giảm hàm lƣợng axit phytic mà các thành
phần chứa photpho khác không thay đổi. Ngƣời ta đã tạo đƣợc một số gen lặn
(lpa) làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng phƣơng pháp gây đột biến bằng hoá
chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch. Các gen này làm thay
đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt nhƣ axit phytic, các
inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm
hàm lƣợng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat
tự do (tức là làm tăng hàm lƣợng photphat tự do). Gen này đƣợc xác định nằm trên
chromosome 1S của cây bắp và trên chromosome 2H của cây lúa mạch. Tƣơng tự
đối với gen lpa2 thì axit phytic giảm cùng với các dạng inositol photphate khác và
làm tăng lên photphate tự do. Gen đột biến lpa2 đƣợc xác định nằm trên

tổng hợp axit phytic trong giai đoạn phát triển của hạt. Sinh tổng hợp axit phytic
thấp trong hạt và sự xác định gen thông qua con đƣờng phân lập các nhân bản
cDNA trên bắp. Các nhân bản này có chuỗi mã di truyền giống với nhiều inositol
photphat kinase từ động vật và nấm men. Ứng dụng kỹ thuật bất hoạt chèn đoạn
mã đột biến (Mutator insertion knockout) để điều tra chức năng của gen. Sau khi
bất hoạt những gen này, hàm lƣợng axit phytic trong hạt sẽ giảm, hạt sẽ tích lũy
myo-inositol, inositol photphat và photphat tự do.
Trong sự phát triển của hạt, axit phytic đƣợc tổng hợp từ quá trình đƣờng phân
(Gluco-6-P). Enzym Ins(3) P
1
synthase (MIPS) xúc tác quá trình Glucose-6-
photphate để tạo ra Ins(3) P
1
. 13
Phân tích clone MIPS ở cây yến mạch (Avena sativa) cho thấy clone này chứa
1936 bp (accession no. AB059557) mã hóa cho polypeptid có số lƣợng amino axit
là 510 và có tính tƣơng đồng cao với nhiều loại cây trồng khác. Theo Yoshida và
ctv. cho thấy độ tƣơng đồng amino axit giữa protein MIPS ở cây yến mạch với
protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv 1999,
Hageman và ctv 2001). Protein MIPS có trọng lƣợng 56.13 kD. Phân tích bằng
phƣơng pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn
đầu trƣởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trƣởng thành. Nồng
độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trƣởng thành của hạt. RNA của gen
MIPS ít đƣợc phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện đƣợc ở thân và lá. Nồng độ
RNA MIPS cao nhất đƣợc phát hiện ở những hạt giai đoạn chƣa trƣởng thành của
hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt.


phytic trong suốt quá trình phát triển của hạt. 15
2.5. Đánh dấu siêu vệ tinh (Microsatellite)
Đánh dấu siêu vệ tinh hay SSR đƣợc ứng dụng thành công từ năm 1995 (Mc
couch và ctv., 1996). Đó là tập hợp các đoạn chuỗi mã rất ngắn từ 2-10bp. Các
đoạn này xuất hiện trên chuỗi mã DNA đƣợc lặp đi lặp lại nhất định, sắp xếp ngẫu
nhiên, rất khác nhau đƣợc phân tán khắp nơi trên bộ gen động vật thực vật và con
ngƣời (Gunter Kahl, 2001). Những chuỗi mã ngắn này có thể ở dạng lặp lại của
hai, ba hay bốn nucleotid và đƣợc xắp xếp ngẫu nhiên trên một dãy của 5-50 bản
sao (copy) chẳng hạn nhƣ (AT)
29
, (CAC)
16
hay (GACA)
32
. SSR xuất hiện rất nhiều
trên bộ gen thực vật và có mặt trung bình sau mỗi 6-7kb (Cardle và ctv., 2000).
Các đoạn này đƣợc khuyếch đại trong phản ứng PCR nhờ vào mồi xuôi và mồi
ngƣợc. Sản phẩm PCR chứa các alen SSR đƣợc tách rời thông qua điện di trên gel
agarose hay gel acrylamide.
SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi
mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa. Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà
chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác
biệt giữa kiểu gen và kiểu hình .

2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic
Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung
cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó. Nguồn tổng hợp vòng Ins duy

Spirodela polyrhiza (Brearley và Hanke, 1996, 1996b. Con
đƣờng sinh tổng hợp ở D. Discoideum tiến hành thông qua những hợp chất trung
gian Ins(3)

P
1
, Ins(3,6) P
2
, Ins(3,4,6) P
3
, Ins(1,3,4,6) P
4
, và Ins(1,3,4,5,6)

P
5
. Con
đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở S. Polyrhiza tiến hành thông qua những hợp
chất trung gian Ins(3) P
1
, Ins(3,4) P
2
, Ins(3,4,6) P
3
, Ins(3,4,5,6) P
4
, và
Ins(1,3,4,5,6)

P

Hình 2.7. Sơ đồ con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic ở trong tế bào
eukaryo: (1), D-Ins(3)-P
1
(or L-Ins[1]-P
1
) synthase; (2), D-Ins 3-phosphatase
(or L-Ins 1-phosphatase); (3), D-Ins 3-kinase (or L-Ins 1-kinase); (4), Ins P- or
polyP kinases; (5), Ins (1,3,4,5,6) P
5
2-kinase hay phytic acid-ADP
phosphotransferase; (6), PtdIns synthase; (7), PtdIns và PtdIns P kinases,
theo sau bởi PtdIns P-specific phospholipase C, và Ins P kinases; (8), D-
Ins(1,2,3,4,5,6) P
6
3-phosphatase; (9) D-Ins(1,2,4,5,6) P
5
3-kinase; (10), D-
Ins(1,2,3,4,5,6) P
6
5-phosphatase; (11), D-Ins(1,2,3,4,6) P
5
5-kinase; (12),
pyrophosphate-forming Ins P
6
kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins
PolyP-ADP -phosphotransferases.

Nguồn:
3.3. Nguồn gốc vật liệu
Các quần thể lúa đột biến, lúa mùa và lúa cải tiến trên đƣợc lấy tại ngân
hàng lúa của viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long. Trong đó:
OMCS 2000, OM 1490, AS996, NTCĐ-5 đƣợc Bộ môn di truyền Viện
Lúa Đồng Bằng sông Cửu Long phát triển bằng phƣơng pháp lai tạo và tạo biến dị
soma. 19
OM CS2000 đƣợc phát triển từ cặp lai OM1738/MRC19399 và OM 1490
đƣợc phát triển từ cặp lai OM606/IR44592-62-1-3-3 . Đây là hai giống đƣợc chọn
số dòng nhiều để đánh giá và phân tích hàm lƣợng axit phytic .
Quần thể lúa đột biến OM1490 và OMCS2000 đƣợc tạo ra bằng việc gây
đột biến bằng tia gamma với 5 Kr và phát triển thông qua chọn lọc ở các thế hệ
M
0
M
1
, M
2
, M
3
và M
4

AS996 đƣợc phát triển từ phƣơng pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/
O. Rufipogon và đƣợc phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr
Nàng thơm Chợ Đào -5 đƣợc đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục đƣợc
đột biến với tia phóng xạ gamma với cƣờng độ 5 Kr .
Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang

3

M
4

Tia Gamma với 5 Kr
OM 1738 x MRC 19399
OMCS 2000
M
0

M
1

M
2

M
3

M
4

Tia Gamma với 5 Kr 20
3.4. Dụng cụ và hóa chất
3.4.1. Dụng cụ
Cối nghiền gạo

Isopropanol, Etanol 100% và 70%, Dung dịch đệm ly trích DNA (xem phụ lục),
SDS, CTAB, NaCl, TE thuộc hãng Merck của Đức
Các hóa chất trong chạy điện di: Agarose (Mỹ), Dung dịch TAX 50X và TBE
10X.
Các hóa chất chạy PCR : Dung dịch stock của dNTPs (5mM), dung dịch
stock của PCR buffer (10X)