1
CHƢƠNG 1
LỜI MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây lúa (Oryza sativa L.) là một trong những loại cây lƣơng thực chính nuôi
sống hơn 50% dân số thế giới. Trƣớc đây, với điều kiện vật chất còn thiếu thốn,
lƣơng thực không đủ ăn ngƣời ta chỉ có nhu cầu đƣợc ăn no. Nhƣng ngày nay mức
sống ngƣời dân ngày càng đƣợc nâng cao thì nhu cầu ăn no đã đƣợc thay đổi, việc
ăn ngon, có dinh dƣỡng cao đã dần trở nên là nhu cầu quan trọng đối với mọi
ngƣời. Trong đó, sự cân bằng dinh dƣỡng trong khẩu phần ăn là vấn đề lớn của
dân số thế giới. Ở các nƣớc đang phát triển sự thiếu dinh dƣỡng khoáng chƣa đƣợc
quan tâm nhƣ: Sắt (Fe), kẽm (Zn)..Các chất này đóng vai trò quan trọng trong cơ
thể con ngƣời, sắt là kim loại tham gia vào thành phần hóa học của hồng cầu.
Thiếu sắt sẽ dẫn đến tình trạng thiếu máu và ảnh hƣởng phần lớn đến trẻ em và
phụ nữ trong giai đoạn mang thai. Trong khi đó, kẽm cũng rất cần thiết cho cơ thể,
thiếu kẽm làm cho cơ thể suy yếu, bệnh tật, gây tử vong và gây ảnh hƣởng đến sự
sinh trƣởng và phát triển của cơ thể. Ở trẻ em, phụ nữ mang thai và phụ nữ đang
trong giai đoạn cho con bú sữa thì có nguy cơ thiếu kẽm cao vì lúc này cơ thể có
nhu cầu kẽm cao hơn cho sự phát triển, sinh sản và đề kháng với những bệnh
nhiễm trùng. Brown và Wuehler (2000) đã ƣớc tính là khoảng 95,4% (+/- 2,1) dân
số ở Nam Á và khoảng 71,2% (+/- 14,2) dân số ở Đông Nam Á đang đứng trƣớc
nguy cơ thiếu kẽm. Trong khi đó tỷ lệ này ở Mỹ và Canada chỉ chiếm khoảng 0,9
% (+/- 0,2 ).
Hạt ngũ cốc và cây họ đậu là nguồn thực phẩm tiêu thụ chính của dân số thế
giới. Nguồn thực phẩm này rất giàu axit phytic (myo-inositol-1,2,3,4,5,6-
hexakisphotphate), là thành phần dự trữ photpho trong hạt. Axit phytic, phytate và
photpho đã đƣợc tìm thấy một lƣợng đáng kể trong các loại quả và hạt của cây
trồng (John N.A. Lott và ctv, 2000). Axit phytic tồn tại trong hạt thƣờng ở dạng
3
CHƢƠNG II
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Axit phytic.
Axit phytic là este photphate của inositol, có công thức phân tử là myo-
inositol 1,2,3,4,5,6 hexakisphotphat ( IP
6
) là thành phần chính của phopho ( P )
trong thực vật, đƣợc tích lũy trong hạt và túi phấn. Hình 2.1.Cấu trúc của inositol . D là ký hiệu vị trí của cacbon
Inositol hay còn gọi là hexahydroxyclohexan, có 9 dạng đồng phân lập thể
giống với cấu trúc của glucose. Inositol là thành phần của nhiều photphoglycerid
tế bào. Vì inositol có mặt trong mô cơ nên còn đƣợc gọi là Meso- hay my-
oinositol, là một đồng phân quan trọng. Myo-inositol là tiền chất trong chu trình
photphatidylinositol. Inositol và dạng photphat của nó ổn định với những enzym
phân hủy ở trong cơ thể.
4
Hình 2.2 Cấu tạo lập thể của axit Phytic
Axit phytic tạo phức với những ion kim loại nhƣ : Canxi (Ca), Kẽm (Zn),
Sắt (Fe), Magie (Mg) hay tạo phức với protein thành hợp chất gọi là Phytin hay
1
2
3
4
5
6 5
vài trƣờng hợp nó chiếm khoảng 50-80% lƣợng photpho tổng của hạt (Lott,1984).
Không có hạt trƣởng thành nào mà không có phytate mặc dù nó có thể không có ở
một số mô hạt nhất định nào đó nhƣ nội nhũ chứa tinh bột của những hạt ngũ cốc.
Phytate cũng có ở hạt phấn (Jackson và ctv.,1982; Helsper và ctv., 1984), bào tử
túi (DeMaggio và Stetler, 1985) và mô sinh dƣỡng nhƣ rễ, cuống và lá (Roberts và
Loewus, 1968; Brearly và Hanke, 1996 ).
Bảng 2.1. Sự phân bố của Phytate ở hạt của một số cây trồng
Ở lúa và lúa mì Ngô Đậu castor Đậu hà lan
Mầm: 10%
Aleurone: 90%
Nội nhũ: rất ít
Mầm: 90%
Aleurone: 10%
Nội nhũ: rất ít
Phôi: 3%
Nội nhũ: 97%
Lá mầm: 89%
Mầm: 2,5%
Vỏ hạt: 0,1%
Axit phytic là nguồn dự trữ Photpho chính trong cơ thể thực vật. Axit
phytic có thể kết hợp với các cation tạo thành dạng muối, gọi là phytate hay
phytin. Phytate có một số vai trò nhất định trong hạt và cây mầm, trong đó 2 vai
trò sau đây có ý nghĩa nhất.Vai trò rõ nhất của phytate là nguồn dự trữ inositol,
photphate, K, Mg, Ca, Mn, Fe và Zn cho mầm cây (Batten và Lott, 1986 ; Lott và
Buttrose, 1978a, 1978b ;Chen và Lott, 1992; Wada và Lott, 1997). Những hợp
chất dự trữ này đƣợc giải phóng cho cây mầm đang phát triển bởi hoạt động của
những phytase (Chen và Pan, 1977). Vai trò thứ hai là nó điều khiển lƣợng
photphate vô cơ cả ở hạt đang phát triển và cây mầm ( Strother, 1980 ). Hiện nay
các nhà khoa học trong nông nghiệp đang chọn tạo giống cây trồng có hàm lƣợng
axit phytic thấp, đặc biệt là ở những cây tạo ra hạt dùng làm lƣơng thực thực
phẩm. Tuy nhiên vấn đề đƣợc đặt ra là liệu phát triển những cá thể cây trồng có
hàm lƣợng axit phytic thấp có ảnh hƣởng đến những tính trạng nông học của cây
không nhƣ: năng suất cây trồng, khả năng sinh trƣởng và phát triển của cây
trồng…, đặc biệt là ở những vùng mà đất đai có hàm lƣợng photpho thấp
(Graham và welch ,1996). Tuy nhiên những nghiên cứu cho thấy những cây trồng
có tính trạng axit phytic thấp thì lƣợng photpho tổng của chúng vẫn ở mức bình
thƣờng, không ảnh hƣởng đến khả năng hấp thụ P từ đất và năng suất cây trồng
(Raboy, 1996). Ngoài ra những dạng đột biến axit phytic thấp này còn có khả năng
ngăn không cho hạt tổng hợp P thành axit phytic. 7
2.2.2. Axit phytic với con ngƣời, vật nuôi và môi trƣờng
2.2.2.1. Ảnh hƣởng của axit phytic đối với con ngƣời
Axit phytic có trong những thực phẩm đƣợc làm từ những nguyên liệu
nhƣ ngũ cốc, gạo, cây họ đậu làm ngăn cản sự hấp thu ion kim loại nhƣ sắt (Fe
3+
),
Magie (Mg
8
cung cấp thêm P vô cơ, lƣợng photpho mà heo không sử dụng (liên kết trong hợp
chất phytate) đƣợc thải vào môi trƣờng và nếu không đƣợc quản lý tốt sẽ có thể
gây nên những thiệt hại tiềm tàng cho môi trƣờng.
(Nguồn: Vũ Văn Vụ và ctv.,2000. Sinh lý học thực vật.)
Hình 2.4. Sơ đồ chu trình photpho trong tự nhiên
Ở gà cũng nhƣ những động vật dạ dày đơn khác (trong đó có cả heo) không thể
tiêu hóa đƣợc axit phytic khi đƣợc cho ăn với khẩu phần có chứa ngô và đậu nành.
Kết quả là chúng bài thải axit phytic ra khỏi cơ thể chúng ở dạng phân có chứa P.
Nếu nhƣ đậu nành, ngô, gạo chứa lƣợng axit phytic thấp thì chúng sẽ thải ra lƣợng
P ít hơn trong phân. Hiện nay các nhà công nghệ sinh học đã tạo ra giống ngô, đậu
nành, gạo có hàm lƣợng axit phytic thấp nhằm làm giảm sự ô nhiễm do P có trong
phân.
Ngoài mục tiêu tạo ra những hạt có hàm lƣợng axit phytic thấp, ngành
công nghệ sinh học cũng sản xuất đƣợc enzym phytase có nguồn gốc vi sinh vật
Các đá
trầm tích
Photphat
Thủy Nguyên
Sự kết cấu
lai hóa đá
Granit
ĐẤT
trƣờng do lƣợng phân thải ra trong chăn nuôi.
2.3 Công nghệ sinh học phân tử trên cây lúa.
Ứng dụng công nghệ sinh học phân tử trên thực vật không chỉ giải quyết những
vấn đề khó khăn trong cải tiến giống cây trồng, an toàn lƣơng thực thực phẩm,
phát triển kinh tế mà còn bảo đảm sự bảo tồn, đa dạng hóa nguồn gen và sự bền 10
vững. Công nghệ sinh học đang đóng vai trò nhƣ là công cụ sẵn sàng phục vụ cho
các nhà chọn giống thực vật, nhằm ứng dụng và tạo ra nhiều định hƣớng để gia
tăng sản lƣợng, đa dạng hóa cây trồng và sử dụng sản phẩm nguồn gen trong nông
nghiệp ngày càng phát triển bền vững (IAEA, Wienna, 2002). Sự phát triển không
ngừng với nhiều kỹ thuật hiện đại và ngày càng đƣợc cải tiến, đƣợc các nhà chọn
giống và các nhà sinh học phân tử ứng dụng. Các ứng dụng bắt đầu từ việc chọn
vật liệu để tạo ra các các tổ hợp lai, thiết lập hay liên kết bản đồ gen trên các tính
trạng quan trọng có ý nghĩa kinh tế qua di truyền số lƣợng (QTL). Thiết lập bản đồ
QTL và sự liên kết các gen dựa trên sự chọn lọc nhờ vào các đánh dấu phân tử
(MAS) ứng dụng trên quần thể hồi giao, quan hệ phả hệ và quần thể cận giao.
Thông qua sự so sánh của các hệ thống gen trên sinh vật, phƣơng pháp đánh dấu
phân tử cho phép khám phá và tìm ra sự đa dạng sinh học và tiến hóa của sinh vật
(IAEA, Wienna, 2002).
Chiến lƣợc chọn giống nhờ vào đánh dấu phân tử là phƣơng pháp tác động
mạnh đến hiệu quả chọn giống. Các đánh dấu có kết quả kỹ thuật cao trên cơ sở
PCR (Polymerase Chain Reaction) nhằm đánh giá kiểu gen của tính trạng mục tiêu
đƣợc thế giới ủng hộ từ năm 1995. Chọn giống trên cơ sở đánh dấu phân tử từ
nguyên lý cơ bản là chứng minh, đánh dấu liên kết với gen nằm đúng vị trí (locus)
trên nhiễm sắc thể và vị trí này phản ánh đƣợc đặc tính mong muốn. Các đánh dấu
đƣợc chia thành hai nhóm: đánh dấu trên cơ sở PCR và đánh dấu thăm dò và lai
DNA ( Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Các kỹ thuật đánh dấu phân tử
(lpa) làm giảm hàm lƣợng axit phytic bằng phƣơng pháp gây đột biến bằng hoá
chất và phân lập gen này ở trên cây bắp và cây lúa mạch. Các gen này làm thay
đổi rất lớn giữa các thành phần chứa photpho trong hạt nhƣ axit phytic, các
inositol photphate khác và photphate tự do.Trong đó gen đột biến lpa1 làm giảm
hàm lƣợng axit phytic bằng cách tự cân bằng sinh học trong phân tử với photphat
tự do (tức là làm tăng hàm lƣợng photphat tự do). Gen này đƣợc xác định nằm trên
chromosome 1S của cây bắp và trên chromosome 2H của cây lúa mạch. Tƣơng tự
đối với gen lpa2 thì axit phytic giảm cùng với các dạng inositol photphate khác và
làm tăng lên photphate tự do. Gen đột biến lpa2 đƣợc xác định nằm trên
chromosome 1S của cây bắp và chromosome 2H của cây lúa. Nhƣ vậy cho đến 12
nay tất cả các gen đột biến cho hàm lƣợng axit phytic thấp đều làm tăng lƣợng
photphate tự do. Đây chính là chỉ thị trong việc chọn lọc các dòng lúa đột biến có
hàm lƣợng axit phytic thấp.
Đột biến axit phytic thấp đƣợc tạo ra do các tác nhân đột biến trên các loài cây
trồng nhƣ bắp, lúa gạo, lúa mạch và đậu nành ( Ras-mussen và Hatzack, 1998;
Larson và ctv., 2000; Raboy và ctv., 2000; Wilcox và ctv., 2000) và đƣợc ứng
dụng trong nghiên cứu chọn giống di truyền (Raboy và ctv., 2001). Có hai loại đột
biến ảnh hƣởng đến axit phytic thấp trên bắp là đột biến lpa1 làm giảm lƣợng axit
phytic nhƣng không tích lũy inositol polyphotphate và đột biến lpa2 cũng làm
giảm lƣợng axit phytic nhƣng hạt đột biến này tích lũy InsP
3
, InsP
4
và InsP
5
(Raboy và ctv., 2000). Dạng đột biến lpa2 ở ngô (Zea mays) xảy ra do sự đột biến
ở gen inositol phosphate kinase. Gen inositol phosphate kinase ở ngô (ZmIpk)
protein MIPS của các cây khác vào khoảng 77 đến 88% (Yoshida và ctv..1999,
Hageman và ctv.. 2001). Protein MIPS có trọng lƣợng 56.13 kD. Phân tích bằng
phƣơng pháp Northern blot cho thấy gen MIPS biểu hiện cao trong suốt giai đoạn
đầu trƣởng thành của hạt và giảm hoạt động ở cuối giai đoạn trƣởng thành. Nồng
độ axit phytic cũng tăng từ từ cùng với sự trƣởng thành của hạt. RNA của gen
MIPS ít đƣợc phát hiện thấy ở hoa và không phát hiện đƣợc ở thân và lá. Nồng độ
RNA MIPS cao nhất đƣợc phát hiện ở những hạt giai đoạn chƣa trƣởng thành của
hạt và giảm từ từ theo quá trình phát triển của hạt.
Hình 2.5. Phân tích bằng phƣơng pháp Northern-blot ở cây yến mạch.
A: biểu hiện của gen MIPS ở hạt chƣa trƣởng thành (1), lá (2) và thân (3) sau
5 ngày trổ hoa. B: Biểu hiện gen MIPS ở hạt đang phát triển lúc 0, 5, 10, 15
và 25 ngày sau khi trổ hoa.
(Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm) 14
Hình 2.6. Sự thay đổi nồng độ P tổng, axit phytic và và P vô cơ sau khi trổ
hoa ở cây yến mạch.
(Nguồn:www.cropscience.org.au/icsc2004/poster/3/2/1/724_saneoka.htm)
Phân tích hàm lƣợng P tổng số, axit phytic cho thấy nồng độ P tổng số ở hoa là
3,51 mg/g trọng lƣợng khô (DW), và tăng từ từ với sự trƣởng thành của hạt (Hình
2.6). Nồng độ P tổng số ở hạt trƣởng thành đạt 10,15 mg/g trọng lƣợng khô lúc 65
ngày sau khi ra hoa (giai đoạn trƣởng thành đầy đủ ). Axit phytic bắt đầu tăng ở
giai đoạn đầu và tăng nhanh cùng sự trƣởng thành của hạt với nồng độ 5,97 mg/g
trọng lƣợng khô. Nồng độ P vô cơ là 1,58 mg/g trọng lƣợng khô ở hoa và tăng đến
3,3 mg/g trọng lƣợng khô sau 30 ngày trổ hoa, sau đó giảm nhanh cùng với sự
agarose hay gel acrylamide.
SSR hữu ích trong việc thiết lập bản đồ di truyền, bản đồ vật lý và bản đồ chuỗi
mã cơ bản (Sequence-based) trên cây lúa. Ngoài ra SSR còn cung cấp cho nhà
chọn giống và nhà di truyền công cụ đáng tin cậy và hiệu quả để liên kết sự khác
biệt giữa kiểu gen và kiểu hình .
2.6. Quá trình sinh tổng hợp axit phytic
Con đƣờng sinh tổng hợp axit phytic có thể tóm tắt gồm 2 phần sau: sự cung
cấp Ins và sự tổng hợp Ins polyphotphat sau đó. Nguồn tổng hợp vòng Ins duy
nhất là enzym Ins(3) P
1
synthase (MIPS). Enzym này chuyển Glc-6-P thành Ins(3)
P
1
(Loewus và Murthy, 2000). Hoạt tính enzym Ins(3) P
1
synthase ở những hạt
đang phát triển cung cấp Ins cũng nhƣ Ins(3)P
1
(Yoshida và ctv., 1999) mà sau đó
sẽ đƣợc chuyển thành axit phytic qua sự photphoryl hóa của hai hay nhiều enzym
kinase (Biswas và ctv., 1978; Stephens và Irvine, 1990 ). Bƣớc photphoryl hóa
Inositol đầu tiên đƣợc xúc tác bởi enzym Inositol kinase. Enzym này cũng xúc tác
tạo ra Ins(3)P
1
(English
và ctv., 1966; Loewus và ctv., 1982). Con đƣờng tổng hợp
axit phytic khởi đầu bằng cơ chất ban đầu là Ins, hoạt động của enzym Ins kinase
và trải qua nhiều giai đoạn photphoryl hóa thông qua những hợp chất trung gian đã
2
, Ins(3,4,6) P
3
, Ins(3,4,5,6) P
4
, và
Ins(1,3,4,5,6)
P
5
. Những con đƣờng này có điểm chung ở những hợp chất trung
gian đầu và cuối. Những Ins photphat này vẫn chƣa đƣợc biết với vai trò là những
chất truyền tín hiệu thứ cấp.
Sự tổng hợp axit phytic cũng có thể tiến hành một phần qua những con đƣờng
liên quan đến những chất truyền tín hiệu bao gồm photphatidylinositol (PtdIns),
những photphat trung gian và Ins(1,4,5)P
3
(Bƣớc 6 và 7; Van der kayy và ctv.,
1995; York và ctv., 1999). Ins photphat bị photphoryl hóa ở mức độ cao hơn axit
phytic nhƣ là InsP
7
và InsP
8
, là những hợp chất đƣợc ghi nhận là xảy ra phổ biến ở
tế bào eukaryotic (steps 12 và 13; Mayr
và ctv., 1992; Menniti và ctv., 1993;
Stephens và ctv., 1993; Brearley
và Hanke, 1996c; Safrany và ctv., 1999)
5-kinase; (12),
pyrophosphate-forming Ins P
6
kinases; (13), pyrophosphate-containing Ins
PolyP-ADP -phosphotransferases.
Nguồn: 18
CHƢƠNG 3
VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện từ ngày 1 tháng 3 năm 2005 đến ngày 1 thánh 8 năm
2005 tại phòng phân tích sinh hóa và phòng thí nghiệm sinh học phân tử thuộc Bộ
Môn Di Truyền và Chọn Giống của Viện Lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, quận
Ô Môn, TP. Cần Thơ.
3.2. Vật liệu
Tên của các giống lúa trong thí nghiệm
Bảng 3.1. Tên các giống lúa đƣợc phân tích
Số thứ tự Tên giống
1
2
3
4
5
6
OM 1490 dạng bố mẹ
và M
4
....
AS996 đƣợc phát triển từ phƣơng pháp lai xa và cứu sống phôi mầm IR 64/
O. Rufipogon và đƣợc phóng xạ bằng tia gamma với 3Kr
Nàng thơm Chợ Đào -5 đƣợc đột biến bằng tế bào soma và tiếp tục đƣợc
đột biến với tia phóng xạ gamma với cƣờng độ 5 Kr .
Qui trình phát triển dòng đột biến OM 1490 và OMCS 2000 ( Lang
2004) OM O OM 606 x IR44592 – 62 – 1 – 3 – 3
OM 1490
M
0
Tia Gamma với 5 Kr
Copyright: Tài liệu đại học ©