AA(A)
n
AA(A)
n
Chu kỳ I của PCR
Chu kỳ I của PCR
Chu kỳ I của PCR
AA(A)
n
AA(A)
n
AA(A)
n
Primer xuôi
Primer xuôi
Primer xuôi
AA(A)
n
AA(A)
n
AA(A)
n
Chu kỳ II của PCR
Chu kỳ II của PCR
Chu kỳ II của PCR
Primer ngược
Primer xuôi
Tiếp tục chu kỳ nhiệt
Sơ đồ 2.1. Quá trình hoạt động của các primer trong phiên mã ngược(13)
19

công ty sản xuất primer: Proligo Primers and Probe. Đây là primer đặc hiệu cho virus
PRRS, chúng có khả năng khuếch đại đặc hiệu một đoạn có kích thước khoảng 400bp.
Cặp primer P1, P2 theo tác giả Meritxel Donadeu, 1999 được thiết kế có khả
năng khuếch đại đoạn có kích thước 271bp đối với chủng PRRSV Châu Âu và 280bp
đối với chúng PRRSV Châu Mỹ. Trình tự các cặp primer này như sau:
20

Bảng 3.1. Các cặp primer sử dụng trong phản ứng
Tên
Trình tự nucleotide (5’ đến 3’)
Vị trí trên genome
P1
CCA GCC AGT CAA TAC RCT GTG
14647 đến 14667 (Lelystad)
2948 đến 2968 (VR2332)
P2
GCG AAT CAG GCG CAC WGT ATG
14938 đến 14918 (Lelystad)
3248 đến 3228 (VR2332)
Rovira 1
CCT CGT CAA GTA TGG CCG GTA
Độ dài đoạn gene nhân lên:
400bp
Rovira 2
GAC TGT CAA ATT AGC TTG CAC CC

3.3.3. Vật liệu và hóa chất cho chiết tách RNA
- RNA thu được từ mẫu ly trích
- AMV reverse transcriptase (Promega)
- MgCl
2
(Promega)
- Recombinant RNasin
®
Ribonuclease Inhibitor (Promega)
- Reverse transcription 10X buffer (Promega)

3.3.6. Vật liệu và hoá chất cho điện di sản phẩm RT - PCR
- Agarose (Biorad)
- TBE 0.5X (Tris HCl, acid boric, Na
2
EDTA, Nước cất hai lần khử ion đã hấp
khử trùng)
- Loading dye (Bromophenol blue, sucrose, TE)
- Ladder 100bp
- Ethidium bromide

3.4. Thiết bị và dụng cụ
- Tủ cấy vô trùng
- Máy ly tâm (Mikro Z2K/ Sigma 3K30C)
- Tủ -70
0
C ( Sanyo Ultra Low)
- Tủ - 20
0

trích.

3.5.3. Phƣơng pháp tách chiết RNA virus từ huyết thanh và từ dịch nuôi cấy
tế bào theo TRIzol
Bước 1: Đồng nhất mẫu, phá vỡ tế bào
- Cho 100 l huyết thanh/dịch nuôi cấy tế bào vào ống eppendorf, sau đó cho
thêm 1 ml chất phản ứng TRIzol vào ống.
- Vortex để trộn đều, sau đó để ổn định trong 5 phút ở điều kiện nhiệt độ phòng.
Bước 2: Phân tách và tinh sạch RNA
- Thêm 0.2 ml chloroform và vortex để trộn đều. Để ổn định trong 10 phút ở
nhiệt độ phòng.
- Ly tâm với tốc độ 10000 vòng/phút trong 15 giây ở 4
0
C để phân tách thành
các phần khác nhau.
Bước 3: Kết tủa RNA
- Thu lấy phần dịch không màu bên trên và cho vào một eppendorf mới. Thêm
0.5ml isopropanol và 1µl glycerol vào eppendorf có chứa dịch thu được.
- Vortex để trộn đều, sau đó để ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. Ly tâm với tốc
độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở 4
0
C. Loại bỏ phần dịch nổi và thu lấy phần tủa có
chứa RNA.
Bước 4: Rửa RNA
- Cho 500μl ethanol 75 % vào phần tủa, tiến hành đảo nhẹ và đều khắp ống. Ly
tâm với tốc độ 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4
0
C.
- Loại bỏ phần dịch bên trên, cố gắng loại bỏ hết ethanol. Làm khô khối RNA
trong không khí trong 5 đến 10 phút sao cho bốc hơi hết ethanol .

FA gel buffer và 360μl formaldehyde 37 – 40 %, lắc đều. Sau đó tiến hành đổ gel vào
giá nằm ngang có sẵn lược. Chờ gel đông đặc trong khoảng 45 phút, rút lược ra khỏi
gel và cho vào dung dịch điện di sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
Tiến hành điện di Cho 5 l dịch mẫu thu nhận được sau quá trình ly trích vào 5 l dung dịch buffer
biến tính 2X. Ủ hỗn hợp trên trong 5 phút ở 65
0
C
Cho nhanh hỗn hợp dung dịch trên vào nước đá trong khoảng 1 phút.
Cho 0,5 l ethidium bromide 10 mg/ml vào hỗn hợp trên và để ổn định trong
khoảng 1 phút.
Đặt mẫu vào gel biến tính đã được cho sẵn vào dung dịch điện di trong 15 phút.

Tiến hành quá trình điện di với hiệu điện thế 30 volt cho đến khi buffer đặt mẫu di
chuyển khoảng 3/4 gel.
Quan sát kết quả điện di dưới tia UV nhờ phần mềm Quantity one của công ty

Reverse transcriptase buffer
Primer Rovira 1
Primer Rovira 2
Nước không chứa RNase
RNA mẫu
1,25 U/viên
25 mM
10 mM
20 U/µl
50 U/µl
10 X
5 µM
5 µM

1 viên
2,5 µl
0,75 µl
0,5 µl
0,25 µl
2,5 µl
0.2 µl
0,2 µl
13,1 µl
5.0 µl
1,25 U/viên
2,5 mM
0,3 mM
10 U
12,5 U
1 X

30 phút
2
Tiền biến tính
95
0
C

10 phút
3
Biến tính
95
0
C
15 giây
4
Bắt cặp và kéo dài
60
0
C

2 phút
5
lặp lại bước 3 và 4 trong 40 chu kỳ
6
Hoàn thành
72
0
C

7 phút

dung dịch TBE sẵn sàng cho việc đặt mẫu.
26 Tiến hành điện di
Trộn dung dịch gồm 10µl mẫu và 2µl loading dye 6X. Cho dung dịch này vào giếng
trên gel. Điện di trong 30 phút với cường độ dòng điện là 250mA và hiệu điện thế 100V.
Nhuộm mẫu
Sau khi điện di, gel được lấy ra khỏi buồng điện di và ngâm vào dung dịch
ethidium bromide trong khoảng 30 phút.
Quan sát kết quả điện di
Kết quả điện di được quan sát dưới tia UV nhờ vào máy chụp ảnh DNA, được
quan sát nhờ phần mềm Quantity one của công ty Biorad 27