2.2.3. Phƣơng pháp phát hiện kháng thể trong huyết thanh (serology)
Phản ứng kháng thể hùynh quang trực tiếp (IFA); SNV (serum virus
neutralization); IMPA (immunoperoxidase monolayer assay) và ELISA (enzyme –
linked immunosorbent assay) tất cả đều có thể được sử dụng cho việc phát hiện kháng
thể đặc hiệu với virus PRRS.
Phản ứng IFA, SNV và ELISA được sử dụng thường xuyên trong hầu hết các
phòng thí nghiệm ở miền nam nước Mỹ trong khi đó, IMPA được sử dụng nhiều hơn ở
Châu Âu.
Yoon và cộng sự trong một nghiên cứu đã cho thấy IFA có độ đặc hiệu cao đến
99,5 %. Theo Frey, Yoon và cộng sự, IFA cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát
hiện kháng thể đặc hiệu đến ba tháng sau nhiễm (19).
Theo Drew, trong một thử nghiệm so sánh của mình, ông cho rằng IMPA có độ
nhạy cao hơn so với ELISA (16). IMPA thường được sử dụng nhằm phát hiện việc
nhiễm virus PRRS từ ngày 7 đến ngày 15 sau khi nhiễm (19). Tuy nhiên, IMPA cũng
cho kết quả đáng tin cậy đối với việc phát hiện kháng thể đặc hiệu sau hai đến ba tháng
nhiễm bệnh.
Theo Albina; và cộng sự, ELISA cho kết quả có độ đặc hiệu và độ nhạy cao đối
với việc phát hiện kháng thể virus PRRS trong huyết thanh. Điều bất lợi của thử nghiệm
này là hay cho kết quả dương tính giả (19).
Nhiều dạng ELISA đã được mô tả: ELISA trực tiếp sử dụng tỉ số S/P
(sample/positive); ELISA trực tiếp sử dụng giá trị OD trực tiếp, ELISA ngăn trở.
Trong một bộ ELISA kit thương mại (HerdChek® PRRS ELISA, IDEXX Laboratories
Inc., Westbrook, Maine), tỉ số S/P ≥ 0,4 thì kết quả là dương tính. Sử dụng tỉ số S/P ≥
0,4 như là một giá trị giới hạn, kháng thể đặc hiệu đối với virus PRRS được phát hiện
đối với những heo nhỏ từ 10 đến 14 ngày sau nhiễm trong những điều kiện thí nghiệm
và cao nhất là 2 đến 3 tháng sau nhiễm (Yoon et al., 1995a). Độ đặc hiệu của
HerdCheck® PRRS ELISA nằm trong khoảng 99,3 % đến 99,5 % (19).

miễn dịch. Vì kháng thể thường không kéo dài trong suốt thời gian sống của thú và vì
sự liên kết trong thời gian ngắn của kháng thể IFA và ELISA, điều khuyên nhủ đầu
tiên là heo nhỏ và tốt hơn hết là đàn heo giống cần được kiểm tra để phát hiện tình
trạng nhiễm virus PRRS của đàn.

2.2.4. Kỹ thuật PCR để phát hiện PRRSV
Kỹ thuật PCR được phát triển để phát hiện RNA của virus PRRS trong các mẫu
bệnh phẩm. Vì không cần phải phân lập virus trong môi trường nuôi cấy tế bào nên
PCR sẽ ít tốn thời gian để phát hiện hơn so với phương pháp nuôi cấy tế bào. PCR còn
được xem là một phương pháp có độ nhạy và độ đặc hiệu cao.
11

Nhiều dạng khác nhau của PCR được sử dụng, hầu hết chúng được sử dụng để
phát hiện các vùng ORF7, ORF6 hay ORF1b và có thể sử dụng một cách trực tiếp
trong việc phân tích các mẫu bệnh phẩm.
Fun In Wang (1994) đã sử dụng kỹ thuật RT-PCR trực tiếp để phát hiện sự tồn
tại của virus PRRS trong xác heo thương phẩm và trong tinh dịch con đực. Trong thí
nghiệm này với tỉ lệ huyết thanh dương tính là 85,4 % (205/240), nhưng chỉ có 11/140
mẫu máu chứa lượng virus có thể phát hiện được bằng RT-PCR. Ông kết luận kết quả
phản ứng RT-PCR phụ thuộc rất nhiều vào mẫu phân tích (7).Wagstrom và cộng sự
trong nghiên cứu của mình đã chứng minh kỹ thuật RT-PCR trực tiếp có khả năng
phát hiện RNA virus PRRS với độ đặc hiệu cao (99,4 %) (14).
Christopher-Hennings và cộng sự đã phát hiện ra sự hiện diện RNA của PRRS
virus trong cả hai loại mẫu: dịch tinh thanh và phần chứa tế bào (7).
Kết quả của phản ứng PCR giữa các phòng thí nghiệm khác nhau có thể sẽ khác
nhau, phụ thuộc vào các điều kiện về mẫu; qui trình thu nhận và trữ mẫu; qui trình
chiết tách, tinh sạch; trang thiết bị phòng thí nghiệm; kỹ năng và kinh nghiệm của

– 70
0
C trong 30 – 60 giây tùy thuộc vào primer sử
dụng cho phản ứng. Ở nhiệt độ này, primer sẽ tiến hành gắn kết với DNA mẫu. Việc
xác định nhiệt độ lai ở giai đoạn này là rất quan trọng, nó quyết định đến độ nhạy và
độ đặc hiệu của phản ứng PCR. Nếu nhiệt độ lai trong giai đoạn này quá thấp sẽ dẫn
đến sự bắt cặp không đặc hiệu dẫn đến kết quả khuếch đại sản phẩm bị sai. Nếu nhiệt
độ lai quá cao sẽ dẫn đến độ nhạy của phản ứng kém vì primer sẽ không bắt cặp được.
Cách tính nhiệt độ lai (5)
Nhiệt độ này có thể được tính thông qua Tm. Tm là nhiệt độ mà ở đó việc lai
bắt cặp đúng phân ly. Thông thường nhiệt độ lai thường sử dụng ở điều kiện nhiệt độ
thấp hơn 1 – 2
0
C so với Tm.
Tm có thể được xác định bằng thí nghiệm nhưng thường được tính theo công
thức sau :
Tm = 4 * (G + C) + 2 * (A + T)
Trong đó:
G+C là số nucleotide G và C trong trình tự primer
A+T là số nucleotide A và T trong trình tự primer
Giai đoạn 3: Đây là giai đoạn kéo dài (elongation). Giai đoạn này thường được tiến
hành ở nhiệt độ 72
0
C

– 74
0
C trong 30 giây đến vài phút tùy thuộc vào chiều dài đoạn
DNA cần tổng hợp. Điều kiện nhiệt độ này sẽ giúp cho Taq polymerase hoạt động và
tiến hành tổng hợp sợi DNA mới.

các DNA polymerase có chung đặc điểm là chịu nhiệt, không bị biến tính hay bị huỷ ở
nhiệt độ biến tính DNA.
Dung dịch đệm cho phản ứng PCR
Dung dịch đệm bao gồm các thành phần sau: Tris HCl (pH 8.3), KCl, MgCl
2
,
gelatin. Thành phần và nồng độ dung dịch đệm sử dụng tùy thuộc vào loại DNA
polymerase. Trong thành phần dung dịch đệm cho phản ứng PCR đôi khi người ta bổ
sung MgCl
2
ở nồng độ 0.5 – 5.0 mM. Dung dịch đệm có vai trò trong việc tạo sự kết
hợp giữa các dNTP, kích hoạt DNA polymerase. Dung dịch đệm có ảnh hưởng mạnh
đến tính đặc hiệu và hiệu suất của phản ứng PCR.

2.3.3. Các yếu tố ảnh hƣởng đến phản ứng PCR
DNA mẫu
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch. Nhiều kỹ thuật chẩn
đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch chiết tế bào.
Lượng DNA mẫu sử dụng cũng có xu hướng giảm (1µg xuống còn 100ng) với việc sử
dụng các DNA polymerase có hiệu quả cao.
14

Enzyme
Taq polymerase chịu nhiệt được tách chiết từ vi khuẩn Thermus aquaticus, sống
ở các suối nước nóng. Enzyme này không bị phá hủy ở nhiệt độ biến tính. Ngày nay,
nhiều polymerase chịu nhiệt khác được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên
biệt và hoàn thiện hơn. Tth polymerase, một enzyme tách chiết từ Thermus

15

2.3.4. Thiết bị và dụng cụ cho phản ứng PCR
Thiết bị quan trọng nhất dùng cho phương pháp PCR là máy luân nhiệt. Yêu
cầu quan trọng nhất của thiết bị này là việc thay đổi nhiệt độ phải diễn ra nhanh và
chính xác. Ngoài ra, các eppendorf dùng cho phản ứng phải cùng một kiểu.

2.4. Phƣơng pháp RT - PCR
RT-PCR ( reverse transcriptase polymerase chain reaction) là một phương pháp
dùng để khuếch đại cDNA được tạo ra từ RNA dựa vào đặc tính phiên mã ngược. RT-
PCR thường được sử dụng để tạo ra thư viện cDNA lớn từ một lượng rất nhỏ mRNA;
sử dụng trong việc nhận biết các đột biến và đa hình dựa vào những trình tự phiên mã
ngược và sử dụng trong việc định lượng mức độ biểu hiện của gene. Ngoài ra, RT-
PCR còn có một ứng dụng quan trọng nữa đó là chúng được sử dụng trong việc chẩn
đoán các bệnh do virus RNA.

2.4.1 Nguyên tắc của phản ứng RT-PCR
Về nguyên tắc, bước đầu tiên của phản ứng RT-PCR là quá trình phiên mã
ngược từ khuôn mẫu mRNA để tạo ra sợi đơn cDNA. Một primer
oligodeoxynucleotide sẽ gắn vào mRNA và sau đó chúng sẽ được kéo dài nhờ một
enzyme phiên mã ngược có hoạt tính polymerase để tạo thành bản sao cDNA, bản sao
này sau đó sẽ được khuếch đại nhờ vào phản ứng PCR ở bước thứ hai. Tùy thuộc vào
mục đích của xét nghiệm, primer sử dụng để tạo cDNA đầu tiên có thể được thiết kế
đặc hiệu để lai vào một vị trí xác định trên mRNA hay có thể được thiết kế để gắn kết
vào nhiều vị trí trên mRNA

2.4.2. Các enzyme sử dụng cho phiên mã ngƣợc

hoang dại ( dẫn liệu từ Gerard và cộng sự. 1988). Thêm vào đó, chúng có thể hoạt động
ở nhiệt độ cao (trên 50
0
C), điều này sẽ thuận lợi khi RNA có nhiều cấu trúc bậc hai.
Tth DNA polymerase chịu nhiệt: Loại enzyme này được mã hóa bởi vi khuẩn chịu
nhiệt Thermus thermophilus. Chúng thực hiện phản ứng phiên mã ngược khi có sự
hiện diện của Mn
2+
(Myers và Gelfand, 1991. dẫn liệu). Đặc điểm thuận lợi của loại
enzyme này là ta có thể thực hiện cả hai quá trình của RT-PCR trong cùng một tube
phản ứng . Tuy nhiên loại enzyme này chỉ tổng hợp cDNA có kích thước khoảng từ 1-
2 kb, thêm vào đó việc sử dụng Mn
2+
trong phản ứng sẽ làm cho quá trình tổng hợp
cDNA có độ đặc hiệu thấp. Enzyme Tth không thể cùng sử dụng với primer oligo dT
và random hexamer vì quá trình bắt cặp không thể xảy ra ở điều kiện nhiệt độ mà tại
đó enzyme phiên mã ngược hoạt động. 17

2.4.3 Các primer trong phiên mã ngƣợc
Có ba loại primer thường được sử dụng cho quá trình phiên mã ngược của phản
ứng RT-PCR.
Oligo T (dT): Đây là loại primer được thiết kế dựa vào đặc tính của mRNA là
thường tồn tại đuôi poly A tận cùng ở đầu 3’. Khi thực hiện phản ứng phiên mã ngược,
primer oligo T sẽ gắn kết vào đuôi poly A của mRNA theo nguyên tắc bổ sung. Mồi