BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI

NGUYỄN QUANG TÙNG NGHIÊN CỨU ỨNG DỤNG VÀ HOÀN THIỆN
QUY TRÌNH THU GOM, XỬ LÝ, BẢO QUẢN
TẾ BÀO GỐC TẠO MÁU
DÙNG CHO GHÉP ĐỒNG LOẠI

LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC



Chuyên ngành: Huyết học
Mã số :
62.72.25.01
Hướng dẫn khoa học:
GS. TSKH. Đỗ Trung Phấn
Hà Nội - 201
1Luận án là sản phẩm đào tạo của Đề tài nghiên cứu khoa học cấp
Bộ Y tế “Nghiên cứu ứng dụng quy trình thu gom, xử lý và bảo
quản tế bào gốc tạo máu sử dụng cho ghép tủy đồng loại” do
GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn làm chủ nhiệm.

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan những số liệu trong luận án này là công trình
nghiên cứu của tôi, thuộc đề tài cấp Bộ Y tế.
Các số liệu được trình bày trong luận án là trung thực và chưa

chị em trong các khoa Miễn dịch-Di truyền, Thu gom, Sản xuất, Sàng lọc,
Tế bào, Đông máu và các khoa Lâm sàng đã tạo mọi điều kiện thuận lợi để
tôi thực hiện tốt các quy trình kỹ thuật của nghiên cứu.
Tập thể khoa Huyết học, khoa Truyền máu bệnh viện trung ương
quân đội 108 đã tạo điều kiện và trực tiếp hướng dẫn tôi thực hiện nhiều
quy trình kỹ thuật sử dụng trong nghiên cứu.
Tập thể khoa Sản-bệnh viện Bạch Mai, bệnh viện Phụ sản Hà Nội, đã
tạo điều kiện thuận lợi trong việc thu gom các mẫu máu dây rốn.

Tôi xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất đến GS.TSKH. Đỗ Trung Phấn,
người Thày kính mến đã dìu dắt tôi từ những ngày đầu học tập theo chuyên
ngành Huyết học-Truyền máu, đã dành cho tôi những tình cảm tốt đẹp,
những kinh nghiệm quý báu trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu.
PGS.TS. Phạm Quang Vinh, PGS.TS. Nguyễn Anh Trí – những
người Thày, người Anh đã luôn tạo điều kiện thuận lợi nhất, khuyến khích
và chỉ bảo cho tôi trong công việc, học tập và nghiên cứu.
Xin cám ơn các Thày, Cô, các anh chị em đã dành cho tôi những
đóng góp quý báu trong quá trình thực hiện nghiên cứu và hoàn thiện luận
án này.
Cám ơn gia đình, Cha Mẹ, vợ con thân yêu, anh em ruột thịt, đã luôn
tin tưởng, hy sinh và hỗ trợ không mệt mỏi để tôi có thể tập trung và cố
gắng hoàn thành tốt công việc và nghiên cứu khoa học.
Một lần nữa, xin gửi lời cám ơn sâu sắc nhất tới những người bạn đã
tình nguyện tham gia nghiên cứu, vượt qua cảm giác đau đớn để hiến các
mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, hiến những mẫu dịch tủy quý giá. Xin cảm
ơn các bà mẹ đã tình nguyện hiến những mẫu máu rốn của đứa con mình
với hy vọng sẽ góp phần nhỏ bé để nâng cao chất lượng điều trị cho người
bệnh.
Xin chân thành cảm ơn!


1.3.2. Tế bào gốc tạo máu từ tủy xương 24
1.3.3. Tế bào gốc tạo máu từ máu dây rốn 25
1.3.4. Ứng dụng và lựa chọn các nguồn tế bào gốc tạo máu 26
1.4. Xử lý và bảo quản tế bào gốc tạo máu 28
1.4.1. Xử lý tế bào gốc tạo máu sau thu gom 29
1.4.2. Bảo quản tế bào gốc tạo máu 32
1.4.3. Đánh giá và kiểm tra chất lượng chế phẩm tế bào gốc 34
1.4.4. Ngân hàng tế bào gốc tạo máu 35
1.5. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc tại Việt Nam 36

Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Đối tượng nghiên cứu 39
2.1.1. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu ngoại vi 39
2.1.2. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ tủy xương 40
2.1.3. Các mẫu tế bào gốc thu gom từ máu dây rốn 41
2.2. Phương pháp nghiên cứu 43
2.2.1. Vật liệu nghiên cứu và trang thiết bị, sinh phẩm 43
2.2.2. Tiến hành nghiên cứu 47
2.2.3. Các biến số nghiên cứu 53
2.3. Địa điểm tiến hành nghiên cứu 54
2.4. Xử lý số liệu 54
2.5. Khía cạnh đạo đức của nghiên cứu 55

Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3
.1. Kết quả thu gom tế bào gốc tạo máu từ các nguồn khác nhau 56
3.1.1. Kết quả thu gom từ máu ngoại vi 56
3.1.2. Kết quả thu gom từ dịch hút tủy xương 71
3.1.3. Kết quả thu gom từ máu dây rốn 74
3.2. Kết quả xử lý các mẫu sản phẩm tế bào gốc tạo máu 80

4.4.1. Một số đặc điểm tế bào máu của các mẫu tế bào gốc 126
4.4.2. Một số đặc điểm tế bào miễn dịch của các mẫu tế bào gốc 128
4.4.3. Tế bào gốc và khả năng tạo máu của các mẫu tế bào gốc 131
KẾT LUẬN 136
KIẾN NGHỊ 138
ĐÓNG GÓP CỦA LUẬN ÁN
Danh mục các bài báo và công trình nghiên cứu
Tài liệu tham khảo
Phụ lục

CHỮ VIẾT TẮT ACD
Adenosin citrate dextrose
Activated partial thromboplastin time (thời gian hoạt hóa thromboplastin
từng phần)
APTT
ASC
adult stem cells (tế bào gốc người trưởng thành)
BCRP
breast cancer-resistance protein (protein chống ung thư phế quản)
BFU-E
Burst forming unit-erythrocyte (đơn vị tạo ồ ạt hồng cầu)

embryonic stem cell (tế bào gốc
phôi)
FSC
fetal stem cells (tế bào gốc bào thai)
G-CSF
Granulocyte-colony stimulating factor
(yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt)
GM-CFU
Granulocyte, Monocyte-colony forming unit
(đơn vị tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono)
GM-CSF
Granulocyte, Monocyte-colony stimulating factor
(yếu tố kích thích tạo cụm dòng bạch cầu hạt và bạch cầu mono)
GMP
granulocyte-monocyte precursors (tế bào đầu dòng hạt-mono).
GVHD
Graft versus host disease (bệnh ghép chống chủ)
HGF
hepatocyte growth factor (yếu tố kích thích tế bào gan)

HLA
Human Leukocyte Antigen (kháng nguyên bạch cầu người)
HPC
Hematopoietic proliferation cell (tế bào gốc tăng sinh tạo máu)
HPPCFC
high proliferation potential colony-forming cells
(kỹ thuật tạo cụm các tế bào có khả năng tăng sinh cao)
HSC
hematopoietic stem cells (tế bào gốc tạo máu)
iPS

TBG
Tế bào gốc
TPO
Thrombopoietin
TT
Thrombin time (thời gian thrombin)
UCSC
Umbilical cord stem cells (tế bào gốc dây rốn)
USSC
Unrestricted somatic stem cell (tế bào gốc đệm biệt hóa không giới hạn) DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 3.1.
Thể tích và các chỉ số CD34 của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
56
Bảng 3.2.
Một số chỉ số huyết học của các mẫu thu gom từ máu ngoại vi
không huy động
57
Bảng 3.3.
Một số chỉ số tế bào miễn dịch của các mẫu thu gom từ máu
ngoại vi không huy động
58
Bảng 3.4.
Các chỉ số tế bào máu trước và sau tách không huy động
59
Bảng 3.5.

Bảng 3.14.
Các chỉ số hóa sinh trước và sau khi tách tế bào (n = 10)
71
Bảng 3.15.
Số
lượng tế bào có nhân và CD34 của mẫu tế bào thu gom từ tuỷ
xương
72
72
Bảng 3.16.
Một số chỉ số tế bào máu của mẫu thu gom từ tuỷ xương.
Bảng 3.17.
Số lượng và tỷ lệ % TB MD của mẫu thu gom từ tuỷ xương
73
Bảng 3.18.
Thể tích và các chỉ số tế bào máu của máu dây rốn
74
Bảng 3.19.
Phân bố thể tích mẫu máu dây rốn sau thu gom
75
Bảng 3.20.
Số lượng bạch cầu đơn nhân và CD34 của mẫu máu dây rốn.
75

76
Bảng 3.21.
Một số chỉ số tế bào máu của mẫu máu dây rốn
Bảng 3.22.
Một số chỉ số tế bào miễn dịch của mẫu máu dây rốn
77

85
Bảng 3.32.
Kết quả thu hồi tế bào CD34 sau xử lý MDR có sử dụng HES
85
Bảng 3.33.
Tổng hợp kết quả thu hồi CD34 sau quá trình xử lý
85
Bảng 3.34.
Tỷ lệ tế bào sống của các đơn vị tế bào gốc sau bảo quản.
87
Bảng 3.35.
Đặc điểm tế bào máu từ các nguồn cung cấp tế bào gốc
89
Bảng 3.36.
Thành phần bạch cầu của chế phẩm từ các nguồn cung cấp
90
Bảng 3.37.
Các dưới nhóm lympho từ các nguồn cung cấp
91
Bảng 3.38.
Các chỉ số CD34 từ các nguồn cung cấp
92
Bảng 3.39.
Số lượng và loại cụm tế bào
92
Bảng 3.40.
Khả năng tạo cụm của tế bào gốc từ các nguồn cung cấp
94
Bảng 4.1.
So sánh thể tích thu gom máu dây rốn

Thay đổi số lượng tiểu cầu khi tách không huy động 60
Đồ thị 3.3.
Thay đổi SLCD34 máu ngoại vi khi huy động bằng G-CSF 61
Đồ thị 3.4.
Thay đổi số lượng bạch cầu ở máu ngoại vi trong quá trình huy
động bằng G-SCF và tách tế bào gốc
67
Đồ thị 3.5.
Thay đổi số lượng tiểu cầu ở máu ngoại vi trong quá trình huy
động bằng G-SCF và tách tế bào gốc
67
Đồ thị 3.6.
Mối tương quan giữa tế bào CD34 với số lượng bạch cầu và bạch
cầu trung gian dòng hạt.
69
Đồ thị 3.7.
Mối tương quan giữa cân nặng trẻ sơ sinh và thể tích máu dây
rốn thu đựoc
79
Đồ thị 4.1.
Mối tương quan giữa số lượng CD34 ở máu ngoại vi và trong
sản phẩm sau thu gom
101
Đồ thị 4.2.
Tỷ lệ tế bào chết theo thời gian bảo quản 123
Đồ thị 4.3.
Tỷ lệ tế bào sống sau khi phá đông ở các điều kiện nhiệt độ 124Biểu đồ 3.1.

dịch này sẽ “nhận diện” các tế bào ung thư của người bệnh và gây đáp ứng
miễn dịch nhằm “diệt” các tế bào này. Kết quả của phản ứng ghép chống ung
thư sẽ giúp kéo dài thời gian sống thêm không bệnh của người nhận ghép.
Từ những nguồn cung cấp chủ yếu, quá trình thu gom, xử lý và bảo
quản các tế bào gốc đòi hỏi những quy trình kỹ thuật khác nhau. Hiệu quả thu
được những chế phẩm tế bào gốc mang những đặc điểm sinh học cũng khác
nhau không những về mặt thành phần, số lượng tế bào gốc tạo máu mà còn 2
Hiện tại ở Việt Nam, phương pháp ghép tế bào gốc tạo máu đã được
triển khai từ nhiều năm tại một số trung tâm trong cả nước, tuy nhiên các
công trình nghiên cứu công bố về quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài
hạn các mẫu tế bào gốc tạo máu từ các nguồn cung cấp chủ yếu còn ít và
chưa hệ thống. Xuất phát từ thực tế này, đề tài “Nghiên cứu ứng dụng và
hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý, bảo quản tế bào gốc tạo máu dùng
cho ghép đồng loại” được tiến hành với các mục tiêu:

1.
Ứng dụng và hoàn thiện quy trình thu gom, xử lý và bảo quản dài
ngày tế bào gốc tạo máu từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và máu dây
rốn.
2.
Đánh giá khả năng tạo cụm của tế bào gốc tạo máu và đặc điểm tế bào
miễn dịch của các mẫu tế bào gốc từ máu ngoại vi, dịch tủy xương và
máu dây rốn
3

4
Tế bào gốc phôi (ES) được nghiên cứu từ vài chục năm trở lại đây
[63],[168]. Trong môi trường nuôi cấy in vitro, các tế bào này phân chia
không ngừng nhưng vẫn bảo tồn được khả năng biệt hoá in vitro và in
vivo. Được thu thập từ giai đoạn rất sớm trong quá trình hình thành cá thể,
các tế bào này có khả năng biến đổi thành mọi dòng tế bào của cả ba lá
phôi, đặc biệt các tế bào có khả năng ứng dụng quan trọng trên lâm sàng
là các neuron thần kinh và các tế bào beta ở tiểu đảo Langerhans tiết
insuline của tuyến tuỵ nội tiết.
−
Tế bào gốc bào thai (FSC) có thể được thu thập từ chính bào thai hay các
thành phần phụ của bào thai (bánh rau, dây rốn ). Đây là nguồn cung
cấp tế bào gốc rất phong phú và thực sự mang nhiều hứa hẹn cho ngành y
học tái tạo [1],[96],[100]. Được nghiên cứu đầu tiên và nhiều nhất trong
nhóm này chính là các tế bào gốc tạo máu thu gom từ máu rốn. Các tế bào
này thể hiện khả năng biệt hoá dài hạn thành tế bào trưởng thành của tất
cả các dòng tế bào máu và trường hợp ghép tế bào gốc máu rốn đầu tiên
đã được tiến hành thành công vào năm 1988 [62]. Đặc biệt trong khoảng
10 năm trở lại đây, hướng nghiên cứu tập trung vào việc xác định, phân
lập và nuôi cấy biệt hoá các tế bào gốc từ các thành phần phụ của bào thai
như dây rốn, bánh rau, màng ối và dịch ối (Hình 1.1). Các tế bào gốc thu
thập từ những cấu trúc này có khả năng biệt hóa đa dạng thành những tế
bào của cả ba lá phôi là tế bào mỡ, tế bào xương, sụn, tế bào cơ, cơ tim và
các neuron thần kinh trong điều kiện nuôi cấy có bổ sung những yếu tố
kích thích thích hợp. Từ những vị trí khác nhau có thể thu được những
quần thể tế bào gốc sau:
−

Màng ối


các tế bào mô mỡ, các tế bào thần kinh (cả neuron và tế bào thần kinh
đệm) và tế bào tạo máu cũng đã được xác định trên thực nghiệm
[22],[41],[112].
+ Tế bào gốc thu gom từ các cấu trúc khác: Gan phôi, bánh rau, màng ối
và dịch ối [107],[166]
6
Vùng ngoại mạch
Máu rốn
Nội mô tĩnh mạch
Màng lót
Vùng gian mạch
Dưới màng lót
Hình 1.2. Các vị trí thu gom tế bào gốc từ dây rốn [100]

− Tế bào gốc trưởng thành (ASC) được thu thập từ cá thể trưởng thành.
Nhóm tế bào gốc này lại được xếp loại dựa vào nguồn cung cấp.
− Tế bào gốc trưởng thành (ASC) được thu thập từ cá thể trưởng thành.
Nhóm tế bào gốc này lại được xếp loại dựa vào nguồn cung cấp.

lại chương trình biệt hoá (reprogramming) của tế bào sinh dưỡng
bằng cách đưa vào nhân tế bào đó các gen thích hợp (Oct3/4, Sox2,
Klf4 và c-Myc). Đây là thành tựu mới nhất trong nghiên cứu và ứng
dụng tế bào gốc hiện nay. Các tế bào gốc cảm ứng iPS mang những
đặc điểm về hình thái, biểu hiện các dấu ấn màng, dữ liệu gen (gene
expression profile), khả năng tăng sinh và biệt hoá không giới hạn
tương tự như các tế bào gốc phôi. Các nghiên cứu được công bố từ
năm 2007 đã thu được kết quả tạo tế bào gốc vạn tiềm năng từ
nguyên bào xơ, nguyên bào nội mạc [152],[170].
1.1.2.3. Xếp loại theo mô đích và chức năng biệt hoá
Dựa vào khả năng phân lập được từ mô cụ thể, cũng như khả năng
định hướng biệt hoá đến các tế bào trưởng thành của mô đích đặc trưng để
xếp loại và định danh các tế bào gốc đặc hiệu mô (tissue-specific stem cells).
Các công trình nghiên cứu về tế bào gốc sớm nhất được công bố là các tế bào
gốc tạo máu. Về lý thuyết của sự phát triển, cơ thể của mọi cá thể luôn luôn
đổi mới. Trong những điều kiện sinh lý bình thường và cả trong các điều kiện
bệnh lý. Trong điều kiện sinh lý, quá trình tái tạo và đổi mới mô đích là nhờ

8
+ Tế bào gốc đệm từ tuỷ xương (Bone marrow-derived stroma stem
cells) có đa tiềm năng biệt hoá [26],[73].
+ Tế bào gốc đệm khác: Thu gom từ máu ngoại vi huy động, từ máu
dây rốn [75],[126].
+ Tế bào gốc biệt hoá từ mô mỡ (Adipose tissue-derived stem cells):
có khả năng biệt hoá thành các tế bào xương, sụn, tế bào gan hay các
neuron thần kinh [175].
+ Tế bào gốc biệt hoá từ da (Skin-derived precursor stem cells): có
khả năng biệt hoá thành các neuron thần kinh và các tế bào Schawnn
[173].
Trong từng mô, những quần thể tế bào mang đặc điểm đặc trưng của

chương trình.
a.
Khả năng tự tái tạo
Bằng chứng rõ ràng về khả năng tự tái tạo của các tế bào gốc là việc
cung cấp liên tục các tế bào máu trong suốt cuộc đời của một cá thể. Khả
năng này liên quan chặt chẽ với hoạt tính của enzym tổng hợp chuỗi có khả
năng tổng hợp của chuỗi DNA mới bằng cách rút ngắn độ dài chuỗi DNA
trong quá trình phân chia tế bào (telomerase). Ở người, thời gian tổng hợp
chuỗi DNA rất ngắn trong quá trình phân bào của tế bào gốc, đặc biệt khi bị
tác động mạnh (stress) như trong quá trình ghép [50],[110].
b.
Khả năng biệt hoá đa dòng
Tế bào gốc tạo máu có khả năng biệt hoá thành tất cả các dòng tế bào
máu, ban đầu tạo ra các tế bào định hướng dòng: dòng tuỷ và dòng lympho.
Các tế bào định hướng dòng lympho sẽ phân chia và biệt hoá thành các dòng
lympho T, B và NK. Các tế bào gốc định hướng dòng tuỷ sẽ phân chia và biệt

10
Các nghiên cứu gần đây nhất lại cho thấy các tế bào định hướng dòng
dưới sự kích thích đặc hiệu của các cytokine có thể chuyển đổi lẫn nhau từ
dòng tuỷ sang dòng lympho và ngược lại [138], [141].
c.
Khả năng phục hồi mô tạo máu
Các y văn sớm nhất đã công bố về khả năng phục hồi mô tạo máu của
tế bào gốc dựa trên nghiên cứu thực nghiệm ghép trên chuột sau chiếu xạ liều
chí tử. Tương tự như vậy, các tế bào gốc ở người cũng đặc trưng bởi đặc tính
có thể quay trở lại tuỷ xương và tái tạo mô tạo máu trong mô hình ghép dị
loài thực nghiệm. Sau khi trở lại cư trú tại tuỷ xương (homing), các tế bào
gốc tạo máu tăng sinh và biệt hoá, đáp ứng những tín hiệu kích thích từ môi
trường đệm gian bào (extracellular matrix) [43].

T lympho

B lympho

NK

1.2.3. Các phương pháp xác định tế bào gốc tạo máu
Các nghiên cứu về tế bào gốc tạo máu thường gặp phải khó khăn vì
chúng phân bố rất rải rác trong các mô tạo máu và không có các dấu ấn đặc
trưng hay các kỹ thuật đặc hiệu hoàn toàn để xác định chính xác tế bào gốc
tạo máu. Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng một tập hợp nhiều phương
pháp để xác định và phân lập tế bào gốc, bao gồm: xác định dấu ấn màng tế
bào, nhuộm loại trừ, nuôi cấy in vitro, đếm tế bào gốc trong ghép và phương
pháp thực nghiệm trên linh trưởng.
a. Phương pháp xác định dấu ấn màng tế bào
Cho đến nay, chưa có một dấu ấn nào được cho là đặc trưng để xác
định chính xác tế bào gốc tạo máu ở người. Các tế bào gốc tạo máu là những
tế bào mang dấu ấn CD34