41
Sau đó, sấy giấy lọc có chứa cặn ở 105
0
C đến khối lượng không đổi rồi đốt
cháy, Để nguội trong bình hút ẩm, đem cân và tính kết quả.
Tính kết quả
Hàm lượng xơ thô trong nguyên liệu được tính theo công thức:
% xơ thô = (m
1
– m
2
) x 100/ m
Trong đó:
m
1
: Khối lượng mẫu và bì trước khi nung (g)
m
2
: Khối lượng mẫu và bì sau khi nung (g)
m : Khối lượng mẫu (g)
3.2.1.7 Định lƣợng đạm tổng số [10]
Định lượng nitơ tổng số theo phương pháp Kjeldahl.
Nguyên tắc
Nitơ có trong thành phần của chất hữu cơ, dưới tác dụng của H
2
SO
4
đậm đặc ở
nhiệt độ cao sẽ biến đổi thành amoniac (NH
3
), định lượng NH

+ 2NaOH = Na
2
SO
4
+ 2NH
3
+ 2H
2
O
Phản ứng xảy ra trong bình hứng
NH
3
+ HBO
2
NH
4
+
+ BO
2
-
Bước 3: Chuẩn độ lượng BO
2
-
sinh ra trong bình hứng bằng HCl 0,25 N.
R – CH - COOH
NH
2
H
2
SO

- Cân phân tích có độ chính xác ± 0,002g
- Bình tam giác
+ Hóa chất
- Hỗn hợp xúc tác K
2
SO
4
/CuSO
4
(9:1)
- H
3
BO
3
4%
- NaOH N/100
- Thuốc thử Methyl đỏ và Bromocresol xanh.
Cách thực hiện
+ Vô cơ hóa mẫu
Cân chính xác 100 mg bột mẫu đã được sấy khô đến trọng lượng không đổi,
cho vào bình tam giác. Sau đó thêm 1g chất xúc tác + 5 ml acid H
2
SO
4
đậm đặc vào
mỗi bình, lắc nhẹ, để yên 30 phút. sau đó đem vô cơ hóa mẫu.
Vô cơ hóa mẫu được tiến hành trong tủ hốt để tránh khí độc SO
2
, CO
2

bị kiềm đẩy khỏi (NH)
2
SO
4
theo hệ thống ống sinh hàn vào
bình hứng. Trong bình hứng, NH
3
phản ứng với HBO
2
như sau:
NH
4
OH + HBO
2
NH
4
+
+ BO
2
-
+ H
2
O
BO
2
-
là một bazơ mạnh, nên dung dịch của bình hứng chuyển từ màu xanh sang
vàng. Quá trình kết thúc khi dịch hứng ở đầu ra có pH = 7,0.
Lượng BO
2

H
2
SO
4
. Sự chính xác của kết quả phụ thuộc vào:
- Độ sạch của dụng cụ
- Độ tinh khiết của thuốc thử, nhất là H
2
SO
4

- Nhiệt độ phải cố định trong suốt thời gian đun
Để tạo phản ứng màu, có thể dùng nhiều loại thuốc thử khác nhau như: Phenol,
antron hay orcinol.
Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng thuốc thử là Phenol.
44
Thiết bị, dụng cụ và hóa chất
+ Thiết bị và dụng cụ
- Bình định mức 50 ml, 100 ml, 500 ml
- Cốc hay bình tam giác 50 ml, 100 ml
- Pipet, giấy lọc, phiểu lọc
- Ống nghiệm
- Máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến (UV – Vis).
+ Hóa chất
- Cồn 80
0
, 96
0

- H

dùng để xác định hàm lượng đường, có thể pha loãng dung dịch 5 – 10 lần tùy theo
nồng độ đường có trong dung dịch nhiều hay ít.
+ Bước 2: Thực hiện phản ứng màu bằng cách sử dụng thuốc thử là phenol
Hút 1 ml dung dịch đường cần định lượng cho vào ống nghiệm rồi cho thêm
vào 1 ml dung dịch phenol 5%. Sau đó, cho chính xác 5 ml acid H
2
SO
4
đậm đặc vào
45
ống nghiệm (không để dính acid vào thành ống nghiệm). Để 10 phút rồi lắc, giữ trên
nồi cách thủy 10 – 20 phút ở 25 – 30
0
C để hiện màu.
+ Xây dựng đồ thị chuẩn
Lấy 7 bình định mức 100 ml cho vào đó theo thứ tự 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ml dung
dịch saccharose 0,1%, cho thêm nước đến vạch mức. Từ mỗi bình lấy ra 1 ml đã pha
loãng cho vào ống nghiệm rồi nhuộm màu bằng phenol và H
2
SO
4
như đã nói ở trên.
Trong mỗi ống nghiệm sẽ chứa tương ứng là 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70 g saccharose.
Phải làm ống thử không với 1 ml nước cất thay thế dung dịch đường.
Màu bền vững trong vài giờ. Xác định cường độ màu bằng máy so màu ở bước
sóng 490 nm.
Tính kết quả
Trị số mật độ quang của những ống mẫu phải trừ đi trị số mật độ quang của ống
thử không. Từ đó ta xây dựng một đường cong chuẩn. Mặt khác, trị số mật độ quang
của dung dịch đường cần định lượng cũng phải trừ đi trị số mật độ quang của ống thử


Hình 3.1: Qui trình chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ nhân hạt xoan chịu hạn
Hạt xoan chịu hạn
Nhân hạt
Tách vỏ
Ép lạnh
Bánh dầu
Dầu
Chiết bánh
dầu với êtanol
Dịch chiết
Bỏ bã

+ Phân tích HPLC: Xác định hàm lượng azadirachtin, salanin và mimbin trong
dịch chiết từ nhân hạt xoan chịu hạn trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC) Hewlett
Packard 1090, series 1 – liquid chromatography với các thông số sau (Hình 3.5):
o Cột phân tích: Bondapak C
18
, 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 300 mm.
o Cột bảo vệ: Bondapak TM C
18
, 125 Å, 10 m, 3,9 mm x 20 mm
o Detector DAD: = 220 nm
o Lượng mẫu bơm vào cột: 5 l
o Tốc độ rửa cột: 0,5 ml/ phút
o Dung môi rửa cột: Axêtonitril / H
2
O, (tỷ lệ 55 / 45)
o Chất chuẩn: mimbin, salanin của hãng Trifolio – GmbH (Đức) và
azadirachtin của hãng Sigma
3.2.4 Phƣơng pháp nuôi sâu xanh (H. armigera) trong phòng thí nghiệm
Sâu xanh (Heliothis armigera) được nuôi trên môi trường nhân tạo ở điều kiện
nhiệt độ phòng và độ ẩm là 75 – 85%. Bướm sâu xanh được nuôi trong lồng để kiểm
tra khả năng đẻ trứng. Nắp lồng được bịt bằng một lớp vải màn để cho bướm sâu xanh
đẻ trứng. Hằng ngày tiến hành thu trứng và thay thức ăn cho bướm.
Một hoặc hai ngày sau khi đẻ, trứng đổi thành màu nâu sẫm. Lúc này vải màn
chứa trứng được cắt và xếp vào đĩa petri có sẵn thức ăn cho sâu non. Sâu tuổi 1 và đầu
tuổi 2 được nuôi tập thể trong đĩa petri. Ở tuổi 2 sâu được tách ra nuôi cá thể. Thức ăn
cần thay thường xuyên để đảm bảo sâu đủ khả năng vào nhộng [1].