Chương 6

1
Chương 6: CLONING VECTOR CHO E.COLI

Ngày nay, những thí nghiệm cơ bản liên quan đến việc tạo cloning gene
được quan tâm. Trong chương 3,4 và 5 chúng ta đề cập đến vấn đề làm thế nào
để có thể tinh sạch DNA từ phần chiết của tế bào? Làm thế nào để phân tử
DNA tái tổ hợp có thể được tạo ra trong ống nghiệm? Làm thế nào để phân tử
DNA có thể được chuyển vào trong tế bào sống? Làm thế nào recombinant
clones được đặt lên hàng đầu?
Ở chương này chúng ta sẽ tìm hiểu những cloning vector được các nhà SH phân
tử thường dùng, tìm hiểu về tính chất, cách sử dụng của các loại cloning vector.
Sự đa dạng lớn các lọai vector tồn tại cùng với việc sử dụng E.Coli như là sinh
vật chủ. Điều này không có gì ngạc
nhiên bởi vì vai trò chính của vi khuẩn đã được phát hiện trong nghiên cứu cơ
bản hơn 50 năm qua. Nguồn thông tin phong phú về vi sinh, sinh học di truyền
về E.Coli đã đóng góp vào hầu hết các nghiên cứu chủ yếu về cấu trúc và chức
năng của gene, đã được đưa vào vi khuẩn này như là sinh vật thực nghiệm.
Những năm gần đây, việc nghiên cứu tạo dòng gene và sinh học phân tử có mối
quan hệ lẫn nhau – trở thành 1 thành tựu quan trọng trong tạo dòng gen, đã tác
động kích thích nghiên cứu. Nhu cầu của việc nghiên cứu thôi thúc việc phát
triển nhiều cloning vector ngày càng tinh vi và phức tạp hơn.
Chương này chủ yếu đề cập đến những loại cloning vector E.Coli quan trọng
và công dụng đặc biệt của chúng.

6.1) Những vector tạo dòng dựa vào plasmid của E.Coli:
Những vector tạo dòng đơn giản nhất và được sử dụng rộng rãi nhất trong
việc tạo dòng gene là những plasmid của vi khuẩn nhỏ. Một số lượng lớn vector
plasmid khá nhau có thể được sử dụng với E.Coli, có từ những nhà cung cấp
thương mại. Chúng là sự kết hợp của việc dễ dàng tinh sạch và đặc tính mong

DNA bò gãy trong suốt quá trình tinh sạch. PBR322 có kích thước là 4363bp,
điều đó có nghóa là nó không chỉ có thể được tinh sạch 1 cách dễ dàng mà nó
còn có thể xây dựng được phân tử DNA tái tổ hợp. Ngay cả khi thêm đoạn DNA
6kb thì phân tử PBR322 tái tổ hợp vẫn có kích thước phù hợp.
Chương 6

3
Đặc trưng thứ hai của PBR322 được đề cập trong chương 5, nó có mang 2 vò
trí gen kháng kháng sinh,kháng ampiciline hoặc tetracyline, có thể được sử dụng
như là 1 maker chọn lọc cho những tế bào chứa plasmid. Và mỗi gen maker có
1vò trí cắt duy nhất dùng cho thí nghiệm cloning. Việc chèn vào DNA mới trong
PBR322 được cắt bởi PstI, PvuI hay Scal sẽ bất hoạt gen amp
R
và sử dụng 1
trong 8 loại enzyme endonuclease giới hạn (đáng chú ý là BamHI và HindIII)
bất hoạt gen kháng Tetracyline. Các vò trí cắt đa dạng này có thể được sử dụng
cho việc bất hoạt do xen đoạn, điều đó có nghóa là l PBR322 có thể sử dụng để
clone những đoạn phân tử DNA có kiểu đầu sole.
Thuận lợi thứ ba của PBR322 là khả năng sao chép cao, thông thường thì có
khoảng 15phân tử tồn tại sau khi biến nạp tế bào E.Coli nhưng số lượng này có
thể tăng lên (khoảng 1000-3000) bằng sự khuyếch đại plasmid khi có, sự hiện
diện của chất ức chế sự tổng hợp protein chẳng hạn như là Chloramphenicol.
Việc nuôi cấy E.Coli sẽ cung cấp 1 lượng lớn phân tử PBR322 tái tổ hợp có
triển vọng.
6.1.3) Các dòng PBR322:
Điểm thuận lợi đáng chú ý của PBR322 khi là cloning vector không
phải ngẫu nhiên. Trong thực tế plasmid được thiết kế để cấu trúc cuối cùng sẽ
có tính chất mà ta mong muốn. tưởng vế cấu trúc của PBR322 đã được chỉ ra
ở (H 6.2a).
Chương 6

plasmid ứng dụng trong kỹ thuật di truyền ngày nay.
a) PBR327 – Một plasmid có số lượng sao chép cao:(h 6.3a)
PBR327 được xây dựng bằng việc loại bỏ 1 đoạn DNA có kích thước 1089bp
từ PBR322. Sự loại bỏ này không ảnh hưởng đến amp
R
và tet
R
nhưng khả năng
Chương 6

5
sao chép và tiếp hợp của pasmid này thì bò thay đổi và kết quả là PBR327 sẽ có
2 điểm quan trọng khác với PBR322.

H6.3 2 plasmid cloning vector Ecoli

1) PBR327 có 1 số lượng sao chép cao hơn PBR322, có khoảng 30-45 phân
tử cho mỗi tế bào E.Coli. Điều này không liên quan nhiều đến việc tăng
số lượng plasmid mà ta quan tâm, khi mà cả 2 plasmid này có thể
khuyếch đại số lượng bản sao lớn hơn 1000. Tuy nhiên khả năng sao
chép cao của PBR327 trong tế bào bình thường thì làm cho vector này
phù hợp hơn nếu mục đích của các cuộc thí nghiệm là nghiên cứu chức
năng của gen được clone. Trong những trường hợp này lượng gen đóng
vai trò quan trọng, vì gen được clone có nhiều bản sao hơn, việc tìm ra
hiệu quả của gen trong tế bào chủ dể phát hiện hơn, PBR327 với khả
năng copy cao vì thế đó là sự lựa chọn tốt hơn PBR322 trong việc cloning
này.
2) Việc loại cũng như phá huỷ khả năng tiếp hợp của PBR322 làm cho
PBR327 là 1 plasmid không có khả năng tiếp hợp nên không thể trực tiếp
chuyển nó vào trong nhiều tế bào E.Coli khác, điều này thì quan trọng

khoảng 500-700 bản sao. Điều này là hiệu quả có ý nghóa đối với sản lượng sản
lượng DNA clone có thể đạt được từ việc chuyển đổi vào tế bào E.Coli với
những plasmid pUC8 tái tổ hợp.
Thuận lợi thứ hai :Ta có thể xác đònh phân tử tái tổ hợp có thể thành công
bằng 1 tiến trình đơn giản nhờ vào môi trường agar chứa ampiciline và X-gal
(Tr 98).
Đối với PBR322 và PBR327 , sự chọn lọc tái tổ hợp là 1 kỹ thuật gồm nhiều
bước đòi hỏi cấy từ môi trường kháng kháng sinh này sang môi trường kháng
kháng sinh khác(Tr 96). Vì vậy thí nghiệm về cloning với pUC8 chỉ cần một nữa
thời gian so với PBR322 hay PBR327.
Thuận lợi thứ ba của pUC8 là việc tập hợp những vò trí cắt giới hạn, điều đó cho
phép 1 đoạn DNA có 2 đầu sole (Stich end) (1vò trí cuối EcoRI và BamHI ở vò
trí khác) để clone mà không cần có sự tham gia các đoạn linker(linker là chuỗi
mã DNA nhân tạo, bổ sung vào các đoạn phân tử DNA mục tiêu nhằm tạo ra
1vò trí phân cắt hạn chế của E cắt giới hạn). (H6.4a).
Chương 6

7

H6.4 plasmid pCU
(a) nhóm các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pCU8
(b) nhóm các vị trí cắt trong gene LacZ’ của pCU18
(c) chuyển một đọan DNA từ pCU8 đến M13mp8

Những vector pUC khác có thể kết hợp những vò trí cắt khác nhau và tạo nên
tính linh động cho việc clone các đoạn DNA (H.6.4b). Hơn thế nữa, nhóm vò trí
cắt trong những vector này tương tự như những nhóm trong M13mp (Tr119).
DNA được clone vào là 1 thành phần của nhóm pUC8 có thể được chuyển trực
tiếp vào M13mp. Bằng kỹ thuật giải trình tự DNA hay sự phát sinh đột biến
Invitro có thể xác định cấu truc của nó(H 6.4c) (xem trang 193-223 để miêu tả


9
các gene của phage. Chúng được chọn để phiên mã invitro vì đó là những
enzyme có hoạt tính cao (Lưu ý là toàn bộ quá trình xâm nhập phân giải chỉ mất
20 phút) có thể tổng hợp 1-2 g RNA mỗi phút, tạo ra nhiều hơn so với dùng
E.Coli chuẩn.

6.2) Cloning vector đưa vào bacteriophage M13:
Colning vector có1 yếu tố thiết yếu là nó phải có phương tiện sao chép
trong tế bào chủ, với yêu cầu này thì vector plasmid phải dễ đáp ứng ngay cả
khitrình tự DNA ngắn có thể hoạt động như là điểm khởi đầu sao chép plasmid.
Phần lớn những enzyme cần cho sao chép được cung cấp bởi tế bào chủ. Những
thao tác phức tạp chẳng hạn như là việc tạo ra PBR322 rất lâu (H.6.2a) sao cho
cấu trúc cuối cùng của nó có chứa điểm khởi đầu sao chép không bò ảnh hưởng
với bacteriophage như M13 có liên quan đến sự tái tạo thì phức tạp hơn nhiều.
Thông thường các phân tử DNA phage có mang nhiều gen, cần thiết cho sự sai
chép bao gồm những gen được ghi mã cho lớp vỏ protein phage vànhững
enzyme sao chép chuyên biệt của phage. Sự thay đổi hay là sự loại bỏ 1 trong
những gen nay sẽ làm hư hại hay phá hủy khả ngăng sao chép của phage, vì vậy
phân tử DNA phage ít có cơ hội thay đổi. Nói chung cloning vector phage không
có sự khác biệt đáng kể so với những phân tử bố mẹ.
Vấn đề trong thiết kế cloning vector phage được trình bày khi xem xét
M13. Bộ gen M13 thông thường là 6,4kb, hầu hết bộ gen người thường chứa 10
gen được gắn kết nhau (H.6.6).

H6.6 vị trí gene 1-10 của M13

Mỗi gene thì cần thiết cho sự sao chép của phage, đây là trình tự đơn có 507
nucleotide mà ta có thể gắn thêm vào mà không làm đứt gãy các gene này.
Chương 6

hạn vào gen lac Z’. Việc làm này thành công khi tổng hợp 1 đoạn
oligonucleotide ngắn trong ống nghiệm gọi là polylinker(điểm đa tách dòng).
Đoạn này gồm những vò trí cắt và có những đầu Sticky end được cắt bởi EcoRI
(H.6.8a), đoạn polylinker này gắn vào vò trí EcoRI của M13mp2 tạo ra M13mp7
(H6.8b) là 1 vector phức tạp hơn với 4 vò trí clone (EcoRI, BamHI, SalI, pstI).

H6.8 cấutrúc của M13mp7
(a0 đọan polylinker
(b) đọan chèn vào vị trí EcoRI của M13mp2 chú ý rằng vị trí cắt SalI cũng đuợc nhân biết
giống AccI và HinCII

Đoạn polylinker được thiết kế để nó không làm đứt gãy hoàn toàn gen lac Z’,
việc đọc thứ tự của gen được duy trì suốt đoạn polylinker. Mặc dù vector này
thay đổi chức năng nhưng enzyne B- galactosidase vẫn được tạo ra. Khi
M13mp7 được bò phân cắt với cả EcoRI, BamHI, Sal, 1phần hay tất cả các đoạn
polylinker thì được cắt bỏ (H6.9a)
Chương 6

12

H6.9 tạo dòng M13mp7( bảng chi tiết )

Trong quá trình này nó sẽ tạo 1 đoạn DNA mới, 1 trong 3 vấn đề có thể xuất
hiện:
1) Đoạn DNA mới được gắn vào.
2) Đoạn polylinker tự nối lại.
3) Vector đó tự động gắn lại mà không có sự chèn thêm đoạn DNA mới.
Lúc nào cũng vậy, việc gắn đoạn DNA mới hầu như sẽ ngăn chặn quá trình
tổng hợp ra enzyme B-galactosidase vì thế nhiều vết tan tái tổ hợp không màu
lên môi trường agar X-gal (H.6.9c). Thông thường nếu như đoạn polylinker gắn

M13mp18/19 cũng giống như M13mp8/9, chỉ khác về polylinker và điều đó dẫn
đến vò trí cắt cũng khác.
6.2.4) Vector lai plasmid-M13:
1) Mặc dù M13 thì rất hữu dụng cho việc tao ra các phiên bản đoạn DNA
của gen được clone, nhưng có 1 giới hạn về kích thước của đoạn DNA
này. Thông thường thì nó chỉ chứa tối đa 1500bp, mặc dù thỉnh thoảng
Chương 6

14
cũng clone những đọan có kích cỡ là khoảng 3kb. Để giải quyết vấn đề
này 1 lượng vector-phagemid đã được phát triển từ sự kết hợp của bộ
gen M13 với DNA plasmid. Vd: pEMB18 (H.6.12a) được tạo bằng việc
chuyển vào trong pUC8 1 đoạn 1300bp của bộ gen M13, đoạn DNA của
M13 chứa 1 trình tự nhận biết enzyme. Điều đó làm biến đổi phân tử
M13 mạch đôi bình thường thành DNA mạch đơn và cuối cùng tạo ra
phân tử phage mới, dấu hiệu này vẫn có chức năng thậm chí được tách ra
từ phần không hoạt động của genone M13 vì thế mà phân tử pEMB18
cũng biến đổi thành DNA mạch đơn đưa ra ngoài dưới dạng phân tử
phage chưa hoàn thiện (H.6.12b).
2) H6.12 pEMBL8 là một vector plasmid lai có thể bị biến đổi thành DNA sợi đơn
2. Tất cả điều đó là cần thiết để sử dụng E.Coli làm tế bào chủ trong thí
nghiệm cloning pEMB18, với sự xâm nhiễm của M13 bình thường hoạt
động như 1 helper phage(phage bò bỏ)(1 loại phage được đưa vào trong
tế bào bằng cách tiếp hợp với 1cloning có liên quan để cung cấp các
enzyme.)cung cấp các enzyme sao chép cần thiết và vỏ protein phage
pEMB18 được lấy từ pUC8 có những vò trí cloning polylinker trong gen
lac Z’ vì thế các vết tan tái tổ hợp có thể được nhận biết bằng phương


16
thước 5-25kb và kích thước này thì quá lớn đối với vector plasmid hay
M13.
6.3.1) Những đoạn DNA của bộ gen có thể được loại bỏ mà không làm
giảm khả năng sống của nó:
Phương thức hướng đến việc phát triển những cloning vector bằng việc
khám phá ra những đoạn lớn vùng trung tâm của phân tử DNA có thể bò di
chuyển mà không ảnh hưởng đến khả năng xâm nhiễm của phage vào tế bào
E.Coli. Việc di chuyển tất cả hay 1 phần của vùng không cần thiết ở giữa 2 vò trí
20 và 35 trên bản đồ gen được minh hoạ (H2.9). Kết quả là dẫn đến việc làm
giảm kích thước phân tử xuống còn 15kb. Điều này có nghóa là những đoạn
DNA mới cỡ 18kb có thể được thêm vào trước vò trí cắt để hoàn thành việc đóng
gói thì đã được tìm hiểu (H.6.14) H.6.14 sơ đồ di truyền của lamda từ các vùng khơng cần thiết có thể bị bỏ đi mà khơng
ảnh hưởng chu kì sinh tan của phage

Vùng “không cần thiết” trên thực tế thì chứa nhiều gen cho sự xâm nhập của
prophage vào chromosome E.Coli và thoát ra ngoài. 1 bộ gen bò loại bỏ thì
không có chu kì tiềm tan và có thể có chu kì xâm nhiễm sinh tan. Điều này là 1
phương tiện không cần thiết trong chính bản thân cloning vector trước khi các
vết tan được hình thành.
6.3.2) Sự chọn lọc tự nhiên có thể được sử dụng để phân lập biến đổi và
bỏ vò trí cắt không mong muốn:
Mặc dù bộ gen bò loại bỏ vùng không cần thiết và có nhiều vò trí nhận
dạng cho hầu hết enzyme cắt Endonuclease. Đây là 1 vấn đề thường gặp khi
1vector mới được phát triển nếu chỉ 1 hoặc 2 vò trí cần cho việc loại bỏ thì kỹ
thuật phát sinh đột biến in vitro có thể được sử dụng (Tr221). Vd: Vò trí

Với 1 Insertion vector (H.6.16a) 1 đoạn lớn của nhiều vùng không cần thiết sẽ
được loại bỏ và 2 đoạn cần dùng sẽ nối lại với nhau. Một insertion vector sở hữu
ít nhất 1 vò trí cắt để cho DNA mới có thể gắn vào, kích thước của đoạn DNA
mà vector có thể mang nó dó nhiên là phụ thuộc vào giới hạn của vùng không
cần thiết đã bò loại bo.û 2 vector insertion phổ biến là:
gt10 (H.6.16b) nó có thể mang 1 đoạn DNA mới lên đến 8kb chèn vào
vò EcoRI duy nhất nằm bên trong gen cI (gen ức chế ), sự bất hoạt do xen đoạn
của gen này là cơ sở để nhận ra sự tái tổ hợp rõ ràng hơn là các vết tan đục mờ.
zapII (H.6.16c) có thể chèn thêm 1 đoạn DNA mới kích thước khoảng
10kb vào 1trong 6 vò trí cắt thuộc vùng polylinker bất hoạt của gen lac Z’ được
mang bởi vector, sự tái tổ hợp thì rõ hơn những vết tan màu xanh trên môi
trường agar X-agal.
H6.16 vector xen đọan lamda chèn một đọan polylinker vài gene LacZ’ ở lamda ZAPII
chứa vị trí căt duy nhất.

b) Replacement vector:
Một vector thay thế có 2 vò trí nhận biết cho enzyme cắt Endonuclease được sử
dụng trong cloning, những vò trí khung của vector có thể thay thế bởi DNA được
clone (H.6.17a) thường thì nhiều đoạn có thể thay thế (hay là đoạn mồi trong
thuật ngữ cloning). Mang thêm nhiều vò trí cắt để có thể cắt thành nhiều đoạn
nhỏ vì thế mà nó rất dễ dàng tự gắn vào trong suốt thử nghiệm cloning. Những
vector thay thế thông thường được thiết kế để mang những đoạn DNA lớn hơn là
Chương 6

19
những vector xen đoạn. Sự chọn lọc tái tổ hợp thì thường dựa vào kích thước,
với những vector không tái tổ hợp thì quá nhỏ để bao gói đầu của phage, 2
vector thay thế phổ biến là:
WES B’ (H.6.17b) trong nó có 2 vò trí EcoRI trên đoạn được thay thế
và sự chọn lọc tái tổ hợp dựa trên kích thước.

6.3.5) 1 đoạn DNA lớn , cá thể được clone sử dụng cod mid:
Dạng tinh vi nhất và sau cùng của vector dựa trên là codmid .Nó là dạng lai
giữa 1 phân tử DNA phage và plasmid vi khuẩn , và nó được thiết kế xung
quanh là các enzyme đã biết để đóng gói phân tử DNA phage và trong lớp vỏ
Chương 6

21
prophage (Tr24) sự phản ứng lại với việc đóng gói in vitro không chỉ với bộ gen
của mà còn với nhiều phân tử mang vò trí cos được tách bởi đoạn DNA của
kích thước 32-62kb
1 cosmid về cơ bản là 1 plasmid có mang vò trí cos (H.19a) nó cũng cần 1 maker
chọn lọc như là gen kháng amp
R
và điểm khởi đầu sao chép. Khi cosmid thiếu
tất cả các gen thì nó sẽ không tạo ra các vết tan thay vào đó các khuẩn lạc sẽ
được tạo thành trên môi trường chọn lọc như là 1 vector plasmid.
Thử nghiệm cloning được đề cập với cosmid (H.6.19b), cosmid được mở tại 1vò trí
cắt duy nhất và đoạn DNA mới gắn vào, những đoạn này được tạo ra thường xuyên nhờ
1 enzyme cắt endonuclease. Kết quả là lúc nào cũng có 1đoạn DNA quá nhỏ để mà
clone với cosmid. Sau khi nối thì có nhiều đoạn lặp lại cung cấp1 đoạn DNA xen vào có
kích thước phù hợp, việc đóng góp invitro sẽ tách vò trí cos và đặt cosmid tái hợp trong
vỏ phân tử phage trưởng thành. Những phage này được sử dụng để xâm nhiễm nuôi cấy
E.Coli dó nhiên những vết tan sẽ không hình thành. Thay vào đó, những tế bào xâm
nhiễm sẽ sống sót trong môi trường chọn lọc nên những khuẩn lạc kháng kháng sinh sẽ
phát triển. Tất cả các khuẩn lạc đã tái tổ hợp và các phân tử không tái tổ hợp thì quá nhỏ
để đóng góp vào trong đầu của phage. Chương 6


1

có nhiều thuận lợi hơn ,là nén 1 đoạn DNA 10kb vào trong cấu trúc vỏ của nó,
nhiều loại vector cosmid dựa trên P
1
được thiết kế và sử dụng để clone những
đoạn DNA có kích thước 75-100kb.
Việc làm giảm số lượng clone cần cho thực vật gen này từ 257.000 cho
1cosmid đến 900.000 cho clone vector P
1
, các loại khác của những vector
mới dựa trên plasmid F (Tr17) gọi là PAC (vector dựa trên NST nhân tạo của vi
khuẩn) cho sức chứa cao và có thể chèn đoạn DNA có kích thước lớn đến
300kb, thậm chí xa hơn nữa là việc xây dựng thư viện gen người chỉ dùng
30.000 clone.
Chương 6

23

6.5) Vector vi khuẩn khác:
Những cloning vector được phát triển trong 1số loài khác của vi khuẩn như
là Streptomyces, Bacillus, Seldomonas. Một vài những vector này dựa trên
plasmid đặc biệt đối với 1 sinh vật chủ dựa trên broad host range plasmid, có
thể tái bản trong tế bào chủ vi khuẩn đa dạng. 1 vài thì có nguồn gốc từ
bacteriophage đặc hiệu cho cơ thể sinh vật này. Vd: Những vector cloning
vector dựa trên phage tương tự được gọi là C31. Hầu hết những vector này rất
giống phương pháp sử dụng E.Coli để đáp ứng cho những yêu cầu và mục đích
sử dụng mà không đề cập trong cuốn sách này.