Chương 7 : Những vector cloning dành cho các loại
tế bào chủ trừ E.coli

Hầu hết những thí nghiệm cloning được dùng E.coli làm tế bào chủ và nhiều
loại vector phù hợp với vi khuẩn này. E.coli được sử dụng phổ biến khi thí nghiệm
cloning nghiên cứu về những đặc điểm của sinh học phân tử như cấu trúc, chức
năng gen. Tuy nhiên trong những trường hợp đặc biệt thì ta có thể sử dụng những tế
bào chủ khác. Điều này có thể không giúp nghiên cứu gen nhưng ta có thể điều
khiển hay cải thiện sự tổng hợp sản phẩm trao đổi chất (ví dụ như hormone insulin)
hay thay đổi đặc tính của sinh vật (ví dụ như việc đưa gen kháng thuốc diệt cỏ vào
cây trồng). Do đó chúng ta cần quan tâm đến những vector cloning dành cho những
tế bào chủ khác ngoài E.coli.

7.1 Vector dành cho nấm men và những loài nấm khác
Nấm men Saccharomyces cerevisiae là loài sinh vật quan trọng trong công
nghệ sinh học. Nấm men có vai trò trong sản xuất bia, bánh mì. Ngoài ra, nó còn
được sử dụng như vật chủ trong sản xuất các loại dược phẩm từ những gen được
clone. Việc khám phá ra một loại plasmid tồn tại trong hầu hết các chủng nấm men
S.cerevisiae đã thúc đẩy mạnh mẽ sự phát triển của những dòng vector cloning dành
cho nấm men (hình 7.1). Plasmid là một vòng có kích thước 2 µm, là một trong
những plasmid có số lượng giới hạn chỉ tìm thấy trong tế bào eukaryote.
Hình 7.1 : Plasmid 2 µm của nấm men, REP1 và REP2 phải có trong bản sao của
plasmid và FLP mã hóa protein mà có thể biến đổi từ dạng A sang dạng B của
plasmid. Tại FLP, trình tự gen được sắp xếp lại bằng sự tái tổ hợp nội phân tử.
Chức năng của vùng D chưa được biết chính xác. 7.1.1 Marker chọn lọc cho plasmid 2 µm:
Vòng 2 µm phù hợp là vector cloning: kích thước 6 kb, tồn tại trong tế bào
nấm men với số lượng copy khoảng 70-200. Việc nhân đôi plasmid yêu cầu một số
yếu tố tham gia: ori trên plasmid, vài enzyme được cung cấp từ tế bào chủ, các

cloning ra khỏi chromosome là một công việc khó khăn và đây cũng là trở ngại lớn
cho những thí nghiệm cloning có sử dụng bước đọc trình tự DNA. Nhưng khó khăn
trên không xảy ra khi sử dụng vector YEps vì YEps tồn tại độc lập với nhân trong tế
bào nấm men.
Quy trình chuẩn được sử dụng để cloning trong nấm men là:
B1: Tạo và sàn lọc DNA tái tổ hợp sẽ được thực hiện trong E.coli.
B2: Tinh khiết và xác định đặc tính phân tử DNA cần cloning.
B3: Phân tử DNA mục tiêu được đưa vào tế bào nấm men. (hình 7.4).
Hình 7.4 Cloning với vector E.coli-yeast shuttle cụ thể là YEp13.

7.1.3 Đưa YEp vào DNA của nấm men
Thuật ngữ “episomal” nói lên rằng YEp có thể sao chép độc lập với nhân và
có thể tích hợp vào nhiễm sắc thể trong nhân của nấm men. Hiện tượng tích hợp xảy
ra vì trên vector có mang những gen làm marker chọn lọc tương đồng chặt chẽ với
các phiên bản của nó nằm trong DNA nhiễm sắc thể nấm men. Ví dụ với YEp13, sự
tái tổ hợp có thể xảy ra giữa gen LEU12 của plasmid và gen LEU12 đột biến của
nấm men, kết quả là toàn bộ plasmid được đưa vào nhiễm sắc thể của nấm men
(hình 7.5).
Hình 7.5 Recombination giữa plasmid và gen LEU2 của NST có thể hòa hợpYEp13
trong DNA NST nấm men. Sau đó có 2 copy của gen LEU2, một vẫn giữ chức năng
của nó và một bị đột biến.

7.1.4 Những loại khác của vector cloning nấm men
Ngoài YEps, còn có vài loại vector cloning dùng cho S.cerevisae:
1. Yeast integrative plasmids (YIps): là plasmid vi khuẩn cơ bản mang gen
nấm men. Ví dụ: YIp5 là pBR322 chứa gen URA3 (hình 7.6(a)). Gen này mã
hoá cho orotidine-5’-photphate decarbocylase (enzyme xúc tác sự sinh tổng
hợp các pyrimidine nucleotide) và được sử dụng như marker chọn lọc như
LEU2. YIp không thể tự nhân lên như plasmid và nó không chứa bất cứ phần
nào của vòng 2 µm nhưng sự tồn tại của nó phụ thuộc vào sự hợp nhất trong

tiêu trong tế bào nấm men qua nhiều giai đoạn nuôi cấy.

7.1.5 NST nhân tạo (artificial chromosome) được sử dụng để clone đoạn DNA
lớn trong nấm men:
Vector YAC (yeast artificial chromosome) phát triển từ sự nghiên cứu của
NST eukaryote. Thành phần chủ yếu của NST (hình7.7):
1. Centromere: giúp NST phân bố đồng đều về 2 tế bào con trong suốt quá
trình phân chia tế bào.
2. Hai telomere: nằm hai đầu mút của NST. Có nhiệm vụ: đảm bảo sự sao
chép đầy đủ trình tự DNA ở 2 đầu mút NST trong quá trình nhân đôi và
bảo vệ NST khỏi enzyme exonuclease.
3. Những điểm ori: nằm dọc theo NST, ở đó khởi đầu sự sao chép DNA,
giống đoạn ori ở plasmid.
Hình 7.7 Cấu trúc của chromosome
NST nhân tạo được tạo ra bằng kỹ thuật tái tổ hợp rồi phân lập, sau đó kết hợp
lại lần nữa trong test tube. DNA trong NST nấm men tự nhiên chỉ vài trăm kb trong
khi đó NST nhân tạo có thể clone đuợc đoạn DNA lớn hơn.
(a) Cấu trúc và cách dùng vector YAC:
pYAC3 (hình7.8(a)) là plasmid pBR322 và có một số gen của nấm men. Trong
đó có hai gen URA3 và TRP1 là marker chọn lọc tương ứng cho YIp5 và YRp7.
Giống YRp7, đoạn DNA mang TRP1 cũng chứa điểm ori; nhưng trong pYAC3 còn
chứa thêm chuỗi CEN4 là DNA ở vùng tâm động NST 4. Đoạn TRP1-ori-CEN4
chứa hai trong ba thành phần của NST nhân tạo.
Thành phần thứ ba là telomere (chuỗi TEL). Bản thân hai đoạn trình tự này
không phải là 2 telomere hoàn chỉnh nhưgn khi pYAC3 nằm trong nhân nấm men
thì TEL có vai trò như một trình tự khơi màu cho telomere của NST trong nhân bám
vào. Ngoài ra còn thành phần khác nữa là SUP4. SUP4 là marker chọn lọc, tại vị trí
này DNA mục tiêu được chèn trong quá trình cloning.
Quá trình cloning với pYAC3 (hình 7.8(b)):
B1: Vector pYAC3 bị cắt thành ba đoạn bởi BamHI và SnaBI. Đoạn BamHI bị

và cơ chế hoạt động của gen mà trước đây khó thực hiện bằng kỹ thuật DNA
recombination. Gần đây, YACs có thể nhân lên trong tế bào động vật từ đó ta có thể
phân tích chức năng những gen mà sinh vật mang theo.
YAC quan trọng trong việc tạo thư viện gen. Kích thước tối đa của gen đưa vào
E.coli là 300 kb, thư viện gen người cần 30000 clone. YAC thường sử dụng để
clone đoạn 600kb, ở loài đặc biệt có thể lên đến 1400kb nên chỉ cần 6500 clone cho
thư viện gen người. Không may là “mega-YACs” không ổn định trong việc chèn
DNA, DNA được clone thỉnh thoảng sắp xếp lại bằng việc tái tổ hợp bên trong phân
tử. Nhưng YACs vẫn có giá trị lớn trong việc cung cấp những đoạn DNA lớn được
clone sử dụng để sequencing trong Chương trình nghiên cứu gen người (Human
Genome Project).
7.1.6 Những vector cho nấm men và nấm mốc khác:
Episomal plasmid dựa trên vòng 2 µm của S.cerevisiae có thể nhân lên trong vài
loại nấm men khác nhau nhưng điều này vẫn chưa đủ để cho thấy vector 2 µm có
giá trị tổng quát. Trong trường hợp recombinant được cung cấp ổn định và phát triển
trong thời gian dài trong bioreactor thì YIps là vector phù hợp cho thí nghiệm.
Vector bây giờ phải thực hiện được với nhiều loài như nấm men Pichia pastoris,
Kluveromyces lactis và nấm sợi Aspergillus nidulans, Neurospora crassa.

7.2 Vector cloning cho thực vật bậc cao:
Cloning gen đã tạo ra những cây kháng virus, côn trùng, cà chua biến đổi
gen…và nhờ những biến dị mới ở cây trồng bằng kỹ thuật cloning đã cải thiện được
chất lượng dinh dưỡng, khả năng phát triển trong điều kiện khắc nghiệt… ở vài loài
thực vật.
Ba loại hệ thống vector được sử dụng thành công ở thực vật bậc cao:
1) Vector dựa trên plasmid tự nhiên của Agrobacterium.
2) Chuyển gen trực tiếp bằng cách sử dụng đoạn DNA không gắn với một
vector cloning của cây.
3) Vector dựa trên virus của thực vật.
7.2.1 Agrobacterium tumefaciens

Plasmid mới dựa trên pBR322 hay vector E.coli nhưng mang T-DNA. Sự
tương đồng giữa phân tử mới và plasmid Ti nghĩa là nếu cả hai hiện diện trong cùng
vi khuẩn A.tumefaciens, thì sự tái tổ hợp có thể hoà hợp pBR vào vùng T-NDA. Gen
được clone được chèn vào restriction site trên pBR, chuyển vào vi khuẩn
A.tumefaciens mang plasmid Ti và sự tái tổ hợp tự nhiên sẽ hòa hợp gen mới vào T-
DNA. Sự lây nhiễm của cây dẫn đến gen mới được đưa vào cùng với T-DNA trong
NST thực vật.
Hình 7.12 Sự hòa hợp chung
(b) Tạo cây chuyển gen với plasmid Ti:
Làm lây nhiễm vào tế bào thực vật hay tế bào trần trong môi trường lỏng
thực hiện hiệu quả hơn ở những cây trưởng thành (hình 7.13). Tế bào TV và tế bào
trần được xử lý giống nhau bằng VSV. Ví dụ chúng có thể được tái sinh từ những tế
bào chuyển nạp chứa gen được clone trong mỗi tế bào. Tuy nhiên sự tái sinh của
một cây chuyển gen chỉ xảy ra nếu vector Ti giảm khả năng gây hại để tế bào
chuyển gen không thể hiện bệnh. Điều này có thể thực hiện vì gen bệnh nằm trên T-
DNA mà không cần cho quá trình lây nhiễm, đặc tính lây nhiễm điều khiển bởi
vùng virulence của plasmid Ti. Gen bệnh được đưa ra khỏi T-DNA, thay thế bằng
gen mới mà không làm xáo trộn quá trình lây nhiễm.
Hình 7.13 Chuyển gen tế bào thực vật bằng recombinant A.tumefacien . (a) Sự xâm
nhiễm vào một vết thương: tế bào thực vật được chuyển nạp chỉ hiện diện trong
crown gall (b) Sự chuyển gen trong môi trường lỏng chứa tế bào: tất cả tế bào đều
được biến nạp.
Vector cloning Ti hiện nay là pBIN19 (hình 7.14) chứa 2 chuỗi trái, phải của
T-DNA mang gen lac Z, cloning site và gen kháng kanamycin. Như shuttle vector,
E.coli mang pBIN19 được clone, phân tử pBIN19 recombinant được chuyển vào
A.tumefaciens và vào cây. Tế bào chuyển gen được chọn lọc bởi môi trường agar
chứa kanamycin.
Hình 7.14 Vector Ti đôi
Plasmid Ti như pBIN19 gần đây được bổ sung bởi vector dựa trên plasmid Ri
của A.rhizogenes. Plasmid Ri và Ti khác nhau ở điểm là chuyển T-DNA từ plasmid

nghiệm cloning chỉ xảy ra ở loài brassicas như củ cải, bắp cải, bong cải.
Còn về geminivirus? Có tiềm năng do khả năng xâm nhiễm tự nhiên vào cây
trồng quan trọng như bắp, lúa mì. Nhưng trong quá trình xâm nhiễm, bộ gen của
geminivirus tái sắp xếp lại và loại bỏ, mà đó là điều hoàn toàn bất lợi đối với một
vector cloning. Và virus này phá hoại cây trồng, vì vậy ứng dụng geminivirus đang
được kiểm soát để không lây nhiễm vào quần thể tự nhiên.
7.2.4 Những khó khăn trong cloning gen ở thực vật một lá mầm:
Thực tế là A.tumefaciens và A.rhizogenes chỉ xâm nhiễm vào cây hai lá mầm.
Ngoài ra, cây một lá mầm còn kháng hoàn toàn với sự biến nạp bằng vector Ti và
Ri. Nhưng kỹ thuật mới đã chuyển thành công T-DNA. Tuy vậy, sự chuyển gen với
vector Agrobacterium cần sự tái sinh cây nguyên vẹn (intact) từ tế bào trần, tế bào
hay mô sẹo nuôi cấy được biến nạp.
Việc tái tổ hợp để gắn kết DNA plasmid dạng xoắn vào NST thực vật thì hiệu
quả trên cả cây một và hai lá mầm. Vì vậy chuyển gen trực tiếp là cách tốt nhất để
có tế bào biến nạp của cây một lá mầm. Để chuyển gen trực tiếp hiệu quả thì thể
biến nạp ban đầu phải là tế bào trần, tuy vậy vẫn có khó khăn trong tái sinh cây
intact. Khi giải quyết vấn đề này phải tập trung vào kỹ thuật bắn gen
(microprojectile) để đưa DNA plasmid vào phôi thực vật. Đã thành công trên cây
ngô và một số cây một lá mầm khác.

7.3 Vector cloning cho tế bào động vật:
Chuyển gen trực tiếp có thể thực hiện với tế bào động vật nhưng không mấy hiệu
quả. NST nhân tạo cũng chưa thể sử dụng được. Vì vậy, những thí nghiệm cloning
với tế bào động vật dựa trên vector virus.
Vector nguồn gốc virus động vật:
Thí nghiệm cloning đầu tiên trên tế bào động vật 1979 với vector virus 40
của khỉ (SV40).Virus này có khả năng nhiễm vào vài loài động vật hữu nhũ. Bộ gen
kích thước 5,2kb (hình 7.17(a)) và chứa hai gen: “early gene” biểu hiện sớm chu kỳ
xâm nhiễm và mã hóa protein cần cho sự nhân lên của DNA virus; “late gene” mã
hóa protein vỏ capsid của virus. SV40 vẫn có vấn đề như vector virus khác ở thực