Chuyển DNA vào trong tế bào sống
1 CHƯƠNG V: CHUYỂN DNA VÀO TẾ BÀO SỐNG

Những thao tác được mô tả trong chương IV cho phép các nhà sinh học phân tử tạo ra
những phân tử DNA tái tổ hợp mới. Bước tiếp theo trong thí nghiệm gene cloning là việc
chuyển những phân tử này vào trong tế bào sống, thông thường là vi khuẩn, chúng đồng
thời tăng trưởng và phân chia để sản xuất ra các clone (Hình 1.1). Nói một cách chính
xác, “cloning” chỉ dùng cho các bước sau của phương pháp chứ không dùng cho việc tạo
chính phân tử DNA tái tổ hợp.
Cloning phục vụ cho 2 mục đích, đầu tiên nó cho phép sản xuất được một số lượng lớn
phân tử DNA tái tổ hợp từ một lượng giới hạn nguyên liệu ban đầu. Lúc đầu chỉ có sẵn
một lượng vài nanogram DNA tái tổ hợp, nhưng mỗi vi khuẩn mang một plasmid sẽ phân
chia nhiều lần để tạo ra một khuẩn lạc (colony), mỗi tế bào lại chứa nhiều bản sao của
phân tử. Từ một khuẩn lạc thuần nhất có thể tạo ra vài microgram DNA tái tổ hợp, tượng
trưng cho sự nhân lên gấp hàng ngàn lần so với lượng ban đầu (hình 5.1). Nếu như vi
khuẩn không được sử dụng như một nguồn DNA mà được sử dụng để nhân sinh khối thì
lượng DNA tạo thành có thể đạt đến vài mg DNA tức là năng suất tăng lên gấp hàng
triệu lần. Bằng cách này, cloning có thể đáp ứng một lượng lớn DNA cần thiết cho việc
nghiên cứu sinh học phân tử vế cấu trúc và biểu hiện gen.
Vai trò quan trọng thứ hai của cloning là được dùng trong quá trình tinh sạch. Những
thao tác tạo ra phân tử DNA tái tổ hợp hiếm khi được điều khiển tới mức độ mà không có
một phân tử DNA nào khác hiện diện khi kết thúc quá trình sản xuất. Việc gắn trộn có thể
gồm, ngoài những phân tử tái tổ hợp mong muốn, còn có một số dạng sau:
1. Phân tử vectơ không đóng vòng (có bị cắt).
2. Những đoạn DNA mở (không gắn vào vectơ, có đoạn mang gen mong muốn hoặc
không).
3. Phân tử vectơ tự đóng vòng mà không mang đoạn DNA mới được chèn (“self-
ligated” vectơ).

Hình 5.2: Cloning cũng tương tự như tinh sạch, từ một hỗn hợp nhiều loại phân tử khác
nhau, có thể thu được các clone chỉ chứa các bản sao của một loại phân tử
a. Sản phẩm của sự gắn kết
đoạn DNA mở Phân tử vector tự đóng vòng
Phân tử vector gen phân tử DNA tái tổ hợp
không đóng vòng mong muố
n
Phân tử DNA tái tổ hợp sai

b. Tất cả phân tử đóng vòng được clone (nhân dòng)
Tế bào chứa vector tự đóng vòng tế bào chứa phân tử DNA tái tổ hợp sai
Tế bào chứa phân tử mong muốn
Clone của vector Clone mong muốn Clone của phân tử sai
tự đóng vòng
Chuyển DNA vào trong tế bào sống
4

Chương này đưa ra cách plasmid và vectơ phage, phân tử tái tổ hợp thu nhận từ các
khuẩn lạc trên các tế bào vi khuẩn. Xuyên suốt chương này, ta sẽ thấy việc chọn giữa
khuẩn lạc chứa phân tử tái tổ hợp và khuẩn lạc chứa vectơ tự đóng vòng là tương đối dễ
dàng. Việc khó hơn là làm sao để phân biệt các clone chứa phân tử DNA tái tổ hợp đúng
trong tất cả những clone tái tổ hợp khác sẽ sẽ được đề cập trong chương VIII.

Chuyển DNA vào trong tế bào sống

vậy gọi là các tế bào khả biến (competent cell).
5.1.2 Chuẩn bị các tế bào E.coli khả biến (competent cell)
Cũng như nhiều phát minh khác trong kỹ thuật tái tổ hợp DNA, biến nạp được quan tâm
vào những năm 70, khi người ta quan sát thấy tế bào E.coli ngâm trong dung dịch muối
Chuyển DNA vào trong tế bào sống
6

lạnh thì hấp thụ DNA hiệu quả hơn những tế bào không ngâm và trở thành bước phát
triển quan trọng. Trong kỹ thuật này, các phương pháp cũ thường sử dụng 50mM CaCl
2
mặc dù những muối khác như Rubidium Cloride cũng không kém hiệu quả.
Thực chất người ta không biết chính xác được tại sao phải xử lý. Có khả năng do CaCl
2

làm DNA giảm ở ngoài tế bào hoặc có thể muối CaCl
2
gây ra một số dạng thay đổi trong
màng tế bào làm tăng khả năng kết dính DNA. Cho dù là trong trường hợp nào thì việc
ngâm CaCl
2
chỉ có tác dụng với việc kết dính DNA và không ảnh hưởng đến việc hấp
phụ DNA vào tế bào. Khi DNA được đưa vào môi trường chứa các tế bào đã được xử lý,
nó chỉ gắn lên trên bề mặt tế bào và tại thời điểm đó, nó hoàn toàn chưa được chuyển đến
tế bào chất (Hình 5.3). DNA chỉ thật sự dịch chuyển vào tế bào khả biến khi bị kích thích
bằng cách gia nhiệt lên 42
0
C. Một lần nữa, nguyên nhân tại sao sốc nhiệt lại tạo ra hiệu
quả vẫn không thể giải thích được.

Hình 5.3: Tế bào vi khuẩn khả biến (competent bacterial cell)

tet
R
), do đó có khả
năng tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch chứa 2 loại kháng sinh này (Hình 5.4), còn thể
không biến nạp do vẫn còn nhạy cảm với Ampicillin và Tetracillin nên không có khả
năng tạo khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc. Như vậy, việc phân biệt giữa thể biến nạp
(transformant) và thể không biến nạp(non-transformant) là khá dễ dàng.

Hình 5.4: Lựa chọn các tế bào chứa plasmid pBR322 bằng cách nuôi cấy trên môi trường
thạch chứa Ampicillin hay Tetracillin hay cả hai
Tế bào E.coli bình thường tế bào E.coli chứa pBR322
(không chứa plasmid)

không thể tồn tại trong tồn tại và tạo colony trong
môi trường chọn lọc môi trường chọn lọc

môi trường thạch chứa 40µg/ml Ampicillin,
15 µg/ml Tetracillin hay kết hợp cả hai

Chuyển DNA vào trong tế bào sống
9
Hấu hết plasmid dùng làm vectơ trong cloning chứa ít nhất 1 gen quy định tính kháng
kháng sinh cho tế bào chủ bằng việc chọn lọc thể biến nạp qua phương pháp trãi đĩa trên
môi trường thạch có chứa loại kháng sinh tương ứng. Tuy nhiên, vấn đề nảy sinh là tính
kháng kháng sinh không chỉ hoàn toàn do sự hiện diện của plasmid trong các tế bào được
biến nạp. Gen kháng kháng sinh trên plasmid cần phải được biểu hiện, từ đó mới có
enzyme giải độc kháng sinh. Ngay sau khi biến nạp, gen kháng kháng sinh biểu hiên ngay

Việc trải đĩa trên môi trường chọn lọc cho phép phân biệt được các thể biến nạp và không
biến nạp. Vấn đề kế tiếp là phải xác định được khuẩn lạc biến nạp chứa tế bào mang các
phân tử DNA tái tổ hợp và chứa những phân tử vectơ “self-ligated”. Với hầu hết vectơ
dùng trong cloing, sự chèn 1 đọn DNA vào trong plasmid sẽ phá đi sự nguyên vẹn của
một trong số các gen hiện diện trong phân tử. Do đó, thể tổ hợp (recombinant) có thể
được nhận diện bởi những đặc tính được mã hóa bởi gen bất hoạt không còn hiện diện
trong tế bào chủ nữa (Hình 5.6). Nguyên lý chung của sự chèn bất hoạt được minh họa
bới thí nghiệm cloning điển hình sử dụng pBR322 như là 1 vectơ. Chuyển DNA vào trong tế bào sống
12

Hình 5.6: Sự chèn bất hoạt
a. Vector bình thường- không được tái tổ hợp, tạo cho tế bào chủ những đặc
tính để chọn lọc.
b. Gen này bị bất hoạt bởi đọn DNA ngoại lai chèn vào vector, kết quả là tế
bào được tái tổ hợp không có những đặc tính tương tự.
Chuyển DNA vào trong tế bào sống
13

5.2.1 Chọn lọc thể tái tổ hợp với pBR322 - Sự chèn bất hoạt của một gen kháng kháng
sinh
pBR322 có một số vùng cắt giới hạn đặc biệt có thể sứ dụng để mở vòng một vectơ trước
khi chèn vào một đoạn DNA mới (Hình 5.7a). Ví dụ: BamHI cắt pBR322 chỉ tại một vị
trí nằm trong cụm gen mã hóa tính kháng Tetracillin. Phân tử pBR322 tái tổ hợp (có
mang đọan DNA ngoại lai tại vị trí BamHI (Hình 5.7b)) không còn khả năng tạo tính

Chuyển DNA vào trong tế bào sống
15

nhóm gen tạo ra tính kháng Tetracillin vẫn hoạt động (amp
R
tet
R
). Các khuấn lạc không
phát triển được trên môi trường thạch chứa Tetracillin là thể tái tổ hợp (amp
R
tet
S
). Cùng
lúc đó, những khuẩn lạc có cùng vị trí trên đĩa môi trường gốc chứa Ampicillin sẽ được
thu thập lại cho những nghiên cứu xa hơn.

Hình 5.8: Chọn lọc pBR322 tái tổ hợp nhờ việc chèn bất hoạt vào gen kháng Tetracillin
a. Tế bào được nuôi trên môi trường thạch chứa Ampicillin, tất cả thể biến nạp đều tạo
khuẩn lạc
b. Các khuẩn lạc được cấy chuyến qua môi trường chứa Tetracillin.
c. Các khuẩn lạc phát triển trên môi trường Tetracillin chứa các tế bào không được tái
tổ hợp (amp
R
tet
R
) , còn thể tái tổ hợp (amp
R
tet
S
) tuy không mọc được nhưng vị trí
Chuyển DNA vào trong tế bào sống
18

Beta galactosidase là một trong những enzyme liên quan đến việc việc hoạt hóa quá trình
căt lactose thành glucose và galactose. Beta galactosidase thường được mã hóa bởi gen
“lac Z” nằm trên nhiễm sắc thể của E.coli. Một vài chủng E.coli có gen “lac Z” bị đột
biến (thiếu đi đoạn “lac Z”) mã hóa cho một phần đoạn peptide của beta galactosidase
(Hình 5.10a). Những E.coli đột biến này chỉ có thể tổng hợp enzyme khi chúng nhận
thêm một plasmid (như pUC8) mang đoan “lac Z” mà gen thiếu.
Thí nghiệm cloning với pUC8 liên quan đến sự chọn lọc thể biến nạp trên môi trường
thạch Ampicillin và để xác định thể tái tổ hợp thông qua sàng lọc hoạt tính của beta
galactosidase. Tế bào chứa plasmid pUC8 bình thường kháng Ampicillin và có khả năng
tổng hợp beta galactosidase (Hình 5.9a) còn thể tái tổ hợp cũng kháng Ampicillin nhưng
không có thể tổng hợp beta galactosidase (Hình 5.9b).
Sự sàng lọc cho sự hiện diện hay không hiện diện trên thực tế khá dễ dàng. Chỉ cần thử
nghiệm sự phân cắt lactose thành glucose và galactose, kiểmtra các phản ứng khác nhau
xúa tác bởi enzyme. Điều này đói hỏi phải có chất tương tự như lactose và X-gal (5-
bromo-4-chloro-3-indoline-β-galactopyranosid) cũng bị phân cắt bởi β-galactosidase tạo
ra sản phẩm màu xanh đậm. Nếu X-gal (cộng cới chất cảm ứng emzyme như isopropyl-
thiogalactoside IPTG) thêm vào môi trường thạch cùng với Ampicillin, sau đó những
khuẩn lạc không chứa plasmid tái tổ hợp có thể tổng hợp beta galactosidase sẽ có màu
xanh. Trong khi đó, những thể tái tổ hợp có chứa gen “lac Z” bị bất hoạt nên không có
khả năng tạo beta galactosidase sẽ có màu trắng. Hệ thống này được gọi là Lac selection
được tóm tắt trong hình 5.10b.


a. Sự lây nhiễm: đây là quá trình tương ứng với sự biến nạp, chỉ khác ở chỗ DNA
của plasmid được thay thế bằng DNA của phage. Chỉ với 1 plasmid, phage DNA
Chuyển DNA vào trong tế bào sống
21

được tinh sạch hay phân tử phage tái tổ hợp được trộn lẫm với thành phấn của tế
bào E.coli và DNA được hấp phụ bắng cách sốc nhiệt.
b. Invitro packaging: sự lây nhiễm bắng phân tử DNA λ thì không hiệu quả bằng việc
gây nhiễm nuôi cấy tế bào bằng phage λ trưởng thành. Sẽ rất có ích nếu phân tử λ
tái tổ hợp có thể được đóng gói vào cấu trúc đầu và đuôi của λ trong ống nghiệm.
Điều này có vẻ như khó nhưng trong thực tế là dễ dàng đạt được. Việc đóng gói
đòi hỏi nhiều protein khác nhau mã hóa bởi hệ gen λ nhưng những phân tử protein
này có thể được chuẩn bị ở nồng độ cao từ tế bào bị nhiễm chủng phage λ khiếm
khuyết. Người ta sử dụng 2 hệ thống khác nhau. Đối với hệ thống thứ nhất, phage
λ khiếm khuyết mang một đột biến ở vị trí cos, vì vậy các enzyme endonuclease
không nhận biết được các vị trí này và thường tách khỏi chuỗi khảm
(concatamer) của λ trong suốt quá trình sao chép của phage. Do đó những phage
khiếm khuyết không thể sao chép mặc dù nó trực tiếp tổng hợp các protein cần
thiết cho việc đóng gói. Những protein tích lũy trong vi khuẩn và cơ thể được tinh
sạch từ những giống E.coli bị nhiễm λ đột biến và được sử dụng cho việc đóng gói
invitro phân tử λ tái tổ hợp (Hình 5.11a).
Với hệ thống thứ hai cần có 2 chủng λ khiếm khuyết. Cả 2 chủng đều có mang đột
biến trên gen mã hóa cho một trong những thành phần của lớp vỏ bọc protein của
phage: 1 chủng đột biến trên gen D

và chủng kia đột biến trên gen E (Hình 2.9).
Cả 2 chủng đều không thể hoàn thành chu trình gây nhiễm ở E.coli do sự vắng mặt
các sản phẩm của những gen đột biến không tạo thành cuả trúc hoàn chỉnh của
capsid. Thay vào đó là sự tích lũy những sản phẩm của tất cả gen mã hóa cho lớp
vỏ bọc protein (Hình 5.11b). Do đó, hỗn hợp cho việc đóng gói invitro được chuẩn

5.3.1 Quan sát sự lây nhiễm phage bắng những vết lan trên môi trường thạch
Bước cuối cùng của chu trình lây nhiễm phage là sự dung giải tế bào. Những tế
bào lây nhiễm bị lan ra trong môi trường thạch ngay lập tức sau khi thêm phage
ngay sau khi lây nhiễm với DNA phage. Sau đó sự dung giải tế bào có thể được
quan sát bằng những vết lan trên đám vi khuẩn (Hình 5.12a). Mỗi vết lan là 1 vùng
trống được tạo ra khi phage phân giải tế bào và tiếp tục gây nhiễm, cuối cùng phân
giải những tế bào vi khuẩn bên cạnh (Hình 5.12b).
Cả λ và M13 đều tạo ra những vất lan. Đối với λ là những vết lan thật tạo thành do
sự phân giải tế bào. Tuy nhiên, những vết lan của M13 khác một chút so với λ do
M13 không phân giải tế bào chủ, thay vào đó M13 làm giảm tốc độ phát triển của
các tế bào bị nhiễm để tạo ra 1 vùng tương đối trống trên đám vi khuẩn. Mặc dù
không phải là những vết lan thật nhưng những vùng trống này có thể được xác
định bằng mắt đói với những vết lan của phage bình thường (Hình 5.12c).
Kết quả cuối cùng của thí nghiệm gen cloning, bằng việc sử dụng λ hay M13 là
đĩa thạch phủ vết lan phage . Mỗi vết lan bắt nguồn từ tế bào bị nhiễm hay chỉ
nhiễm đơn và do đó có những phần của phage xác định. Những phần này có thể
chứa những phân tử vectơ tự đóng vòng hay phân tử tái tổ hợp.

Hình 5.12: Vết lan của bacteriophage
a. Sự xuất hiện vết lan trên những vùng vi khuẩn
b. Những vết lan tạo ra bởi phage phân giải tế bào chủ, ví dụ những vết lan
chứa các tế bào bị phân giải + những thành phần của phage
c. Các vết lan tạo ra bởi M13 chứa các vi khuẩn chậm phát triển+ các thành
phần của M13
Chuyển DNA vào trong tế bào sống
24
5.4 Xác định phage tái tổ hợp

mới tạo được
vết lan.

Hình 5.13: Phương pháp chọn lọc phage tái tổ hợp
a. Sự chèn bất hoạt của gen “lac Z”
b. Sự chèn bất hoạt của gen λCI
c. Chọn lọc bằng cách sử dụng kiểu hình Spi
Chỉ λ tái tổ hợp có thể nhiễm vào
λ không tái tổ hợp không nhiễm vào được
d. Chọn lọc dựa trên kích thước genome λ (hệ gen)