Chương 8

1
CHƯƠNG 8: PHƯƠNG PHÁP THU NHẬN
CLONE TỪ GENE ÐẶC TRƯNG

Vấn đề được quan tâm hiện nay là làm cách nào để tạo phân tử DNA tái tổ
hợp và chuyển chúng vào tế bào sống trong thực tiễn nhằm tạo các gen clone
chuyên biệt và cung cấp thông tin quan trọng đối với SHPT và CNSH
Kiểm tra thử nghiệm gene cloning – thông qua các kỹ thuật có thể chọn lọc
trực tiếp những clone mang gene mong muốn hoặc phân biệt chúng với những thể
tái tổ hợp khác mà quyết định sự thành công hay thất bại.
8.1 VẤN ĐỀ CHỌN LỌC:
Ngay cả những vi sinh vật đơn giản nhất như E.Coli cũng chứa đến hàng
ngàn gen và việc phân cắt giới hạn tổng số DNA tế bào tạo ra không chỉ những
đoạn mang gen mong muốn mà còn tạo ra các đoạn chứa các gen còn lại.(H8.1a)
Trong suốt phản ứng gắn kết sẽ tạo ra nhiều phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau do
không có chọn lọc đối với từng đoạn rieng rẻ (H8.1b). Do đó mà có nhiều clone tái
tổ hợp được tạo ra sau quá trình biến nạp và plating out ( trải trên đĩa) (H8.1c).
Bằng cách nào đó mà xác định clone mong muốn.

Hình 8.1: Vấn đề chọn lọc
a. Cắt phân tử DNA bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI, rồi chuyển vào vector.
b. Kết quả tạo phân tử DNA tái tổ hợp.
c. Tất cả đều tạo khuẩn lạc, làm thế nào xác định clone mong muốn.

8.1.1 Hai kỹ thuật cơ bản để tạo clone mong muốn:
 Chọn lọc trực tiếp từ gen mong muốn (H8.2a): chỉ những clone từ các gen
mong muốn là được tạo ra. Hầu như sự chọn lọc được tiến hành trên đĩa.
 Xác định clone từ gen library (H8.2b) :đòi hỏi thử nghiệm ‘shotgun’ cloning
ban đầu để tạo clone library chứa hầu hết hoặc tất cả các gen có trong tế bào, sau

mới có khả năng sống sót và tạo ra khuẩn lạc (H8.3c).

Hình 8.3:Chọn lọc trực tiếp clone gen kháng kanamycin của plasmid R6-5
a. Plasmid R6-5 bị phận cắt thành 13 đoạn khác nhau bởi EcoRI
b. Gắn kết 13 đoạn gen này vào vector tạo 13 phân tử DNA tái tổ hợp khác nhau,
trải trên đĩa (plate out)
c. Chỉ có một thể tái tổ hợp mọc được trên môi trường agar chứa kanamycin
(50µg/ml), đó là thể chứa gen kháng kanamycin

a.Marker rescue mở rộng phạm vi chọn lọc trực tiếp:
Chương 8

3
Hạn chế của chọn lọc trực tiếp là chỉ dùng để clone các gen kháng kháng
sinh. Hiện nay người ta sử dụng các dòng đột biến từ E.Coli làm vật chủ cho sự
biến nạp được ứng dụng rộng rãi trong các kỹ thuật.
Ví dụ: clone gen trpA từ E.coli – gen này mã hóa cho enzyme tổng hợp tryptophan
(một loại aa thiết yếu). Dòng E.coli đột biến chứa gen không có chức năng trpA
-

chỉ sống sống trong mối trường tăng sinh có tryptophan. Và dòng E.coli trpA
-
là ví
dụ về sự khuyết dưỡng.
Dòng E.coli trpA
-
dùng để clone các bản sao của gen trpA: tinh sạch toàn bộ

 Cần môi trường chỉ có wild-type mới có thể sống sót ( những đột biến khuyết
dưỡng không sống được)
Trong nhiều trường hợp tổng quát, marker rescue ứng dụng cho các gen mã
hóa các enzyme sinh tổng hợp, các gen này đã được chọn lọc từ môi trường tối
thiểu (giống cách thức của trpA). Tuy nhiên, kỹ thuật này không hạn chế đối với
Chương 8

4
E.coli và vi khuẩn, các dòng nấm men và nấm sợi khuyết dưỡng, marker rescue
dùng để chọn lọc các genes cloned vào các sinh vật này.
8.3 XÁC ĐỊNH MỘT CLONE TỪ LIBRARY:
a. Gene libraries:
Gen library (trang130) là tập hợp nhiều clone khác nhau, hầu như chứa mọi
gen đơn hiện diện trong một sinh vật cụ thể. Chuẩn bị gen library: tinh sạch DNA
tổng số, đánh dấu điểm phân cắt giới hạn từng phần (a partial restriction digest),
kết quả tạo ra các đoạn được clone vào vector thich hợp (H8.5), thường là vector
thay thế lamda, cosmid, YAC.

Hình 8.5: Chuẩn bị gen library từ vector cosmid
Phân cắt DNA tế bào bằng Sau3A thành những đoạn có độ dài khoảng 35kb, gắn
kết các đoạn này vào cosmid. Bảo quản invito, nhiễm vào E.coli. Tập hợp các dĩa
petri mang khuẩn lạc tạo gene library

Đối với vi khuẩn, nấm men, nấm sợi số clone cần tạo một gen library hoàn chỉnh
không quá lớn do khó điều chỉnh (H6.1)
Đối với động vật, thực vật dù một library hoàn chỉnh chứa nhiều clone khác
nhau thì việc xác định clone mong muốn được chứng minh từ voi mamoth. Đối

clone mRNA mã hóa gliadin.(H8.7e).

Hình 8.7: Sơ đồ cloning cDNA
a. Tổng hợp mạch đầu tiên: mRNA gắn đuôi polyA sẽ bắt cặp với primer
oligo(dT) tạo mạch DNA nhờ reverse transcriiptase
b. Phân giải RNA bằng Rnase H tạo các doạn RNA
c. Tổng hợp mạch thứ hai từ những đoạn RNA bị phân cắt trước đó nhờ DNA polI
tạo cDNA mạch kép
d. Gắn kết cDNA vào vector
e. Biến nạp

8.4 PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLONE:
Xác đính clone dựa vào sản phẩm dịch mã của gen được clone, nhưng thường
dùng kỹ thuật hydrization probing xác định trực tiếp phân tử DNA tái tổ hợp thì
chính xác hơn.
8.4.1. Lai các mạch nucleic acid bổ sung với nhau:
Hầu hết sự bắt cặp của các phân tử acid nucleic tạo cấu trúc lai không ổn
định bởi chỉ một số ít các liên kết bên trong mạch được hình thành (H8.8a). Tuy
nhiên nếu các polynucleotide bổ sung nhau, sau đó mở rộng sự bắt cặp giữa các
base sẽ tạo ra các phân tử mạch kép ổn định (H8.8b)

Hình 8.8: Lai acid nucleic
Chương 8

6
a. Phân tử lai không ổn định được tạo từ 2 mạch DNA không tương đồng.
b. Thể lai ổn định tạo ra giữa 2 mạch bổ sung (có vùng ngắn không bổ sung nhưng
không ảnh hưởng đến tính ổn dịnh chung)
c. Thể lai DNA – RNA tạo ra từ một gen và bản sao của nó


c. Probe bằng DNA được đánh dấu
d. Đọc kết quả qua phóng xạ tự ghi.
Chương 8

7

Trước đây sử dụng nucleotide được đánh dấu phóng xạ (radioactive
nucleotide) hay bằng việc tạo vết cắt nhỏ (nick) hoặc biến đổi đầu bằng thành đầu
lồi (end – filling) – xem thêm glossary hoặc alternatively bằng cách sử dụng các
hexamer DNA ngẫu nhiên gắn kết với DNA chuỗi đơn (random priming)
(H8.10) tạo probe có hoạt tính cao có thể phát hiện một số lượng nhỏ DNA nối kết
màng. Phát hiện tín hiệu lai thông qua phóng xạ tự ghi. Do đánh dấu phóng xạ gây
nguy hiểm nên prbe được đánh dấu bằng chất không có hoạt tính phóng xạ(H8.11)

Hình 8.10: Đánh dấu DNA bằng cách sử dụng các hexamer DNA ngẫu nhiên
gắn kết với DNA chuỗi đơn (random priming). Hổn hợp hexamer ngẫu nhiên
(hexameric oligonuclotides của trình tự ngẫu nhiên) là phức hợp áo chứa ít nhất
một vài phân tử có thể bắt cặp (base – pair) với probe.
DNA mạch kép bị biến tính bởi nhiệt độ tạo DNA mạch đơn. Bổ sung hexamer
oligonucleotides ngẫu nhiên, một số hexamer bắt cặp.Thêm Klenow polymerase
và dNTPs, một trong hai loại đã được đánh dấu, DNA gắn kết trên màng được
đánh dấu.

Sau đây là 2 phương pháp đánh dấu probe không có hoạt tính phóng xạ:
Phương pháp 1: sử dụng dUTP đã biến đổi qua phản ứng với phản ứng với biotin –
một phân tử hữu cơ có ái lực mạnh đối với protein avidin tạo biotin – dUTP, sau
đó tiến hành lai. Rửa và phát hiện vị trí lai của các biotin – dUTP đã gắn kết bằng
marker có đánh dấu huỳnh quang (H8.11a).
Phương pháp 2: probe DNA được trộn chung với horseradish peroxidase và phát
hiện thông qua hoạt tính phân giải luminol của enzyme nhờ sự phát quang qua

đúng.
Ví dụ sau sẽ làm rõ cách thực hiện những suy đoán này. Xét cytochrom c –
một protein đóng vai trò quan trọng trong chuỗi hô hấp mô bào của sinh vật hiếu
khí. H8.13 trình bày trình tự protein cytochrom c của nấm men, trình tự này chứa
một đoạn bắt đầu tại vị trí aa 59 : Trp – Asp – Glu – Asn - Asn – Met. Trình tự này
được mã hóa bởi TGG – GA
T
C
– GA
A
G
– AA
T
C
– AA
T
C
– ATG. Although this
represents a total of 16 different possible sequences, 14 trong 18 Nu có thể
đoán đúng.
Tuy nhiên ngày nay thì những đoạn oligonucleotide ngắn của trình tự đoán
trước (predetermined sequence) có thể được tổng hợp trong phòng thí nghiệm
(H8.14). Vì thế một probe oligoNu có thể tạo ra dựa theo trình tự Nu suy đoán và
probe này có thể xác định gen mã hóa protein. Ví dụ, cytochrom c của nấm men,
16 oligoNu có thể mã hóa cho Trp – Asp – Glu – Asn – Asn – Met sẽ được tổng
hợp, hoặc phân chia hoặc tổng hợp (either separatedly or as a pool) và sau đó sử
dụng probe genomic nấm men hoặc cDNA library (H8.15). Probe có vài Nu tương
đồng với cytochrom c gene cung cấp đầy đủ tín hiệu lai rõ ràng.Thậm chí nếu
nhiều hơn 1 clone cho kết quả lai dương tính, việc reprobe với 1 oligoNu định
trước bởi một đoạn khác của trình tự aa cytochrom c đưa kết quả xác định (H8.15).

Thường một số lượng đáng kể Nu tương đồng được nhận ra khi 2 gen mã hóa
cho cùng một loại protein, nhưng từ những sinh vật khác nhau thì phải được so
sánh, phản ánh sự duy trì cấu trúc gen tring suốt quá trình biến đổi. Thông thường,
hai gen thừ những sinh vật có quan hệ thì tương đồng for probe mạch đơn chuẩn bị
từ một gen để định dạng thể lai (hybrid) ổn định với gen thứ hai. Mặc dù 2 phân tử
không bổ sung toàn vẹn nhưng đủ base pairs thì sẽ được định dạng để tạo cấu trúc
ổn định.(H8.16)
Hình 8.16: Sử dụng một phân tử acid nucleic để nhận dạng các phân tử có liện
quan bằng cách lai với probe (heterologous probing)
a. Thể lai giữa các mạch DNA có liên quan (related DNA): tạo cấu trúc ổn định
b. Heterologous probing giữa các loài ( gen cytochrom c nấm men được đánh dấu
+ gene library của DNA Neurospora có thể tạo được clone cytochrom c
Neurospora).
Chương 8

10
c. Heterologous probing trong cùng một loài (gene library lúa mì + gliadin cDNA
được đánh dấu tạo members of the gliadin multigene family).
Heterologous probing sử dụng phép lai giữa các trình tự liên quan để xác
định clone. Ví dụ: cytochrom c gen của nấm men được xác định trước bằng
oligoNu probing cũng có thể nó được dùng như hybridizatio probe để xác định
những cytochrom c gen trong các clone library của sinh vật khác. Một probe chuẩn
bị từ gen nấm men sẽ không bổ sung nguyên vẹn với gen nấm men nhưng những
base bắt cặp đầy đủ sẽ xảy ra trong một phép lai được định dạng và phat hiện bằng

với protein đã tiêm cho con thỏ ban đầu.
Chương 8

11
(b). Sử dụng kháng thể tinh sạch để phát hiện prtein trong khuẩn lạc tái tổ
hợp.
Có nhiều kiểu chọn lọc miễn dịch nhưng phương pháp hữu ích nhất là dò tìm
trực tiếp bằng thể lai bản sao (đối chiếu) của khuẩn lạc (a direct counterpart of
colony hybridization probing). Các khuẩn lạc chứa thể tái tổ hợp được chuyển lên
màng lai polyvinyl, làm dung giải tế bào, thêm vào dung dịch chứa kháng thể đặc
biệt (H8.18a). Kháng thể được đánh dấu hoặc màng được rửa với dung dịch
protein A được đánh dấu – một protein vi khuẩn gắn kết chuyên biệt với globulin
miễn dịch sản xuất kháng thể (H8.18b). Nguyên tử đánh dấu có thể là chất có hoạt
tính phóng xạ, trong trường hợp đó phát hiện khuẩn lạc liên kết với nguyên tử
được đánh dấu bằng phóng xạ tự ghi hoặc bằng tín hiêu huỳnh quang nếu nguyên
tử đánh dấu không có hoạt tính phóng xạ, cũng có thể phát hiện bằng sự phát
quang hóa học.
Hình 8.18: Sử dụng kháng thể tinh sạch để phát hiện protein trong các khuẩn lạc
tái tổ hợp. Thay vì sử dụng protein A đã được đánh dấu, thì có thể sử dụng chính
kháng thể được đánh dấu hoặc một kháng thể được đánh dấu khác mà nó gắn kết
đặc hiệu với kháng thể sơ cấp.
a. Chọn lọc miễn dịch (immunoscreening): khuẩn lạc bám dính trên màng, làm
dung giải tế bào bằng chloroform, bổ sung kháng thể đặc hiệu. Kháng thể sẽ gắn
kết với những tế bào đã bị dung giải. Thêm protein A đã được đánh dấu, protein A
gắn kết với kháng thể.
b. Kết quả phóng xạ tự ghi: kết quả dương tính là protein tái tổ hợp đã được clone
(c). Những vấn đề biểu hiện gen:
Immunological screening phụ thuộc vào gene được clone đang biểu hiện để
sản phẩm dịch mã protein hiện diện trong các tế bào tái tổ hợp. Tuy nhiên, gen của
sinh vật này thì không biểu hiện trong sinh vật khác. Đặc biệt, thật không giống