Chương 3
1

CHƯƠNG 3: TINH SẠCH DNA TỪ TẾ BÀO SỐNG

Kỹ thuật di truyền tại nhiều thời điểm khác nhau, cần chuẩn bị ít nhất 3 loại
DNA riêng biệt. Trước hết, total cell DNA sẽ được yêu cầu như một nguồn nguyên
liệu từ các gen để tiến hành clone. Total cell DNA có thể là DNA từ nuôi cấy vi
khuẩn, từ cây trồng, từ các tế bào động vật hoặc từ các nguồn sinh vật đang được
nghiên cứu khác.
Loại DNA thứ 2 được yêu cầu là DNA plasmid tinh khiết. Việc chuẩn bị
DNA plasmid từ nuôi cấy vi khuẩn theo những bước tương tự cơ bản như việc tinh
khiết total cell DNA, nhưng điểm quan trọng là tại vài giai đoạn, DNA plasmid phải
được phân chia từ một số lượng lớn DNA nhiếm sắc thể cùng tồn tại trong tế bào.
Cuối cùng, DNA phage được sử dụng trong kỹ thuật cloning phage. DNA
phage nhìn chung được chuẩn bị từ các hạt bacterriophage hơn từ việc ly trích từ tế
bào nhiễm. Vì vậy, không gây nhiễm đối với DNA của vi khuẩn. Tuy nhiên, cần có
những kỹ thuật đặc biệt để phá vỡ lớp vỏ phage. Một ngoại lệ là dạng sao mã mạch
đôi của M13 từ các tế bào E.coli dường như giống với plasmid vi khuẩn.
3.1. Việc chuẩn bị total cell DNA.
Nguyên tắc cơ bản của việc chuẩn bị DNA là ( )
Quy trình của sự chuẩn bị DNA total từ việc nuôi cấy tế bào vi khuẩn có thể
được phân chia thành 4 giai đoạn (hình 3.1):
1. Nuôi cấy tế bào vi khuẩn tăng sinh khối và thu hoạch
2. Phá vỡ tế bào để giải phóng các thành phần tế bào
3. Phần trích của tế bào được xử lý để rút các thành phần, thu nhận DNA
4. Cô đặc dung dịch DNA thu được
3.1.1. Tăng sinh khối và thu hoạch trong nuôi cấy vi khuẩn:
Hầu hết các vi sinh vật có thể tăng trưởng trong môi trường lỏng (môi trường
canh) không quá khó khăn. Môi trường nuôi cấy phải cung cấp một hỗn hợp cân
bằng chất dinh dưỡng thiết yếu trong dung dịch quy định cho phép vi khuẩn sinh

dịch nuôi cấy (hình 3.3). Tốc độ giảm của máy ly tâm sẽ lắng tụ vi khuẩn xuống đáy
ống ly tâm, cho phép trích dịch nuôi cấy. Vi khuẩn từ dich nuôi 1000ml ở mật độ tế
bào cực đại chỉ cần thu lại trong một dung tích 10ml hoặc ít hơn bả vi khuẩn.
Hình 3.2: Đánh giá số lượng tế bào vi khuẩn thông qua đo lường mật độ
quang (a). Dịch nuôi cấy chứa trong bình thủy tinh và ánh sáng bước sóng 600nm
chiếu qua. Lượng ánh sáng chiếu qua dịch nuôi cấy được đo và tính toán mật độ
quang như sau:

1 đơn vị OD = -log
10
Hệ thống này được thực hiện nhờ quang phổ kế. Lượng tế bào tương ứng với
việc đọc OD được tính toán từ đường cong xác định giá trị. Đường cong này được
vẽ từ giá trị OD dịch đó mật độ tb đã biết.
Ví dụ: E.coli 1 đơn vị OD = 0,8.10
9
tb/ml
a) Đo mật độ quang:
b) Đánh giá số lượng tế bào từ đường cong xác định giá trị.
3.1.2. Chuẩn bị dịch trích tế bào:
Tế bào vi khuẩn được bọc bên trong lớp màng cytoplasmic và bao xung
quanh bởi thành tế bào cứng. Ở nhiều loài, như E.coli, thành tế bào là lớp màng bên
ngoài thứ hai. Để giải phóng các thành phần tế bào phải phá hủy tất cả các lớp chắn
bên ngoài.
cường độ ánh sáng truyền đi


b) Ly tâm dịch trích tế bòa để tách các cặn không hòa tan được. Dịch vi khuẩn
Máy ly tâm
(Quay ở 8000 r.p.m trong
10 phút)
Lớp lắng tế
bào vi khu
ẩn

Phá hủy thành tế bào
Phân hủy màng tế bào
Dịch trích tế bào
Ly tâm
Dịch trích tế
bào

mỗi lần trộn và các bước ly tâm sẽ gây đứt gãy các phân tử DNA. Phương pháp xử
lý dịch chiết tế bào là dùng protease như Pronase hay Proteinase K trước khi xử lý
phenol. Các enzyme này phá gãy các polypeptide thành những đơn vị nhỏ hơn, để
dễ dàng hơn trong phân tách phenol.
Các phân tử RNA, đặc biệt là RNA thông tin (mRNA), được phân tách nhờ
xử lý phenol nhưng hầu như vẫn còn chứa DNA trong lớp dịch nước. Cách hiệu quả
duy nhất để tách RNA là dùng enzyme ribonuclease. Phân hủy nhanh chóng các
phân tử đó thành các đơn vị nhỏ ribonucleotide.
3.1.4. Cô đặc mẫu DNA:
Thông thường sự chuẩn bị thành công thường tạo ra được dung dịch đặc
DNA mà không cần phải tiến hành cô đặc thêm. Tuy nhiên, khi thu được dịch loãng,
điều quan trọng là tìm phương pháp để cô đặc DNA.
Phương pháp cô đặc DNA được sử dụng phổ biến là ethanol precipitation.
Trong môi trường muối (chính xác là các cation hóa trị I như Na
+
), tại nhiệt độ
-20
o
C hoặc thấp hơn, ethanol nguyên chất kết tủa một cách hiệu quả các acid nucleic
polymeric. Với dịch đặc DNA, ethanol được tách lớp ở phần trên của mẫu, các phân
tử tủa ở mặt tiếp xúc. Một mẹo hay là sử dụng đũa thủy tinh nhúng xuyên qua dịch
ethanol và dung dịch DNA, khuấy đũa trong dung dịch, các phân tử DNA sẽ bám
chặt vào đũa và được kéo ra khỏi dung dịch ở dạng sợi dài (hình 3.6a). Hơn nữa,
Dịch trích
tế bào
Trộn với
phenol
DNA + RNA
Proteins
Phenol

280
) là 1,8. Tỉ lệ thấp hơn 1,8 thì mẫu có thể bị nhiễm bẩn, hoặc protein hay
phenol.
3.1.6. Chuẩn bị total cell DNA từ các sinh vật khác:
Vi khuẩn không phải là sinh vật duy nhất để trích DNA yêu cầu. Total DNA
từ thực vật và động vật sẽ được sử dụng nếu như mục tiêu của dự án kỹ thuật di
truyền là clone gene từ các sinh vật khác. Mặc dầu các bước cơ bản trong tinh sạch
DNA tương tự nhau trên các sinh vật, những biến đổi phải được lưu ý để phát hiện
ra những đặc trưng đặc biệt của những tế bào đang được sử dụng.
Sự tăng trưởng của các tế bào trong môi trường lỏng có lẽ là không hợp lý,
mặc dù dịch tế bào động vật và thực vật đang trở nên rất quan trọng trong sinh học.
Chương 3
6

Tuy nhiên, những biến đổi chính hầu như được sử dụng tại giai đoạn phá hủy tế
bào. Những hóa chất được sử dụng cho việc phá vỡ tế bào vi khẩn thướng không
phù hợp với các sinh vật khác:ví dụ như lysozyme, không tác động lên tế bào thực
vật. Các enzyme phân hủy đặc biệt có thể được sử dụng cho hầu hết các loại thành
tế bào nhưng thông thường là các kỹ thuật vật lý như nghiền lạnh vật liệu bằng cối
và chày thì hiệu quả hơn. Mặc khác, hầu hết các tế bào động vật không co thành
tế bào và có thể được phân giải một cách đơn giản thông qua việc xử lý bằng chất
tẩy.
Một khám phá quan trọng khác là thành phần sinh hóa trong các tế bào
đang được sử dụng để ly trích DNA. Ở hầu hết vi khuẩn, thành phần sinh hóa
chính hiện diện trong tế bào là protein, DNA và RNA, vì vậy phải tiến hành việc
chiết tách bằng phenol hay xử lý protease, sau đó là loại RNA bằng ribonuclease,
thu được mẫu DNA tinh sạch. Tuy nhiên, các phương pháp đó có thể không đủ để
tinh tạo ra một mẫu DNA tinh sạch nếu như các tế bào chứa một lượng đáng kể
các chất sinh hóa khác. Đặc biệt, vói các mô thực vật thì phương pháp này rất khó
khăn vì chúng thường chứa một lượng lớn carbohydrate, không thể tách ra bằng

vi khuẩn cùng tồn tại trong tế bào.
Việc phân tách hai loại DNA rất khó khăn nhưng rất cần thiết đối với các
plasmid được sử dụng trong kỹ thuật cloning. Sự hiện diện một lượng ít nhất DNA
vi khuẩn tạp nhiễm trong kỹ thuật cloning cũng dễ dàng dẫn đến một kết quả không
mong muốn. May mắn là có nhiều phương pháp để loại bỏ DNA vi khuẩn trong
quá trình tinh sạch plasmid, và việc sử dụng từng phương pháp riêng lẽ hay kết hợp
các phương pháp với nhau đều có thể phân lập được DNA plasmid rất tinh sạch.
Các phương pháp đó dựa trên những đặc điểm khác nhau cơ bản giữa DNA
plasmid và DNA vi khuẩn,chủ yếu là dựa vào kích cở. Plasmid lớn nhất chỉ bằng
8% kích cở của nhiễm sắc thể E.coli,và hầu hết là nhỏ hơn.Các kỹ thuật phân tách
các phân tử DNA nhỏ từ cá phân tử lớn vì vậy mà tinh sạch các DNA plasmid một
cách hiệu quả.
Ngoài kích cở, DNA vi khuẩn và plasmid còn khác nhau về hình thể. Khi sử
dụng một polymer như DNA, thường dựa vào hình thể không gian của phân tử, với
hai hình thể đơn giản nhất là dạng sợi và dạng vòng. Các plasmid và nhiễm sắc thể
vi khuẩn có dạng vòng, nhưng trong quá trình chuẩn bị dịch trích tế bào,
chromosome bị bẻ gãy thành các mảnh dạng sợi. Ứng dụng phương pháp phân tách
các plasmid dạng vòng từ các phân tử dạng sợi sẽ thu được các phân tử plasmid tinh
sạch.

3.2.1. Sự phân chia dựa vào kích thước:
Thông thường để phân đoạn theo kích thước thì phải chuẩn bị chất chiết tế
bào. Những tế bào này sẽ bị tan ra dưới điều kiện kiểm soát cẩn thận, sau đó 1 lượng
nhỏ những đọan gãy của NST sẽ thoát ra ngoài. Kết quả là những đoạn DNA này
Chương 3
8

vẫn còn rất lớn, lớn hơn nhiều so với plasmid, và có thể loại bỏ cùng với những
mảnh vỡ tế bào bằng ly tâm. Tiến trình này được thực hiện bằng cách NST của vi
khuẩn dính vào màng tế bào vi khuẩn, và những đoạn này hầu hết sẽ tạo trầm tích

thường, dạng linh hoạt, gọi là open-circular (3.10 b). Như vậy plasmid có cấu hình
thay đổi.
Dạng siêu xoắn quan trọng trong việc chuẩm bị plasmid bởi vì phân tử siêu
xoắn có thể được phân tách dễ dàng từ DNA sợi đôi bình thường. Để làm điều này
hai phương pháp được dùng phổ biến .
Cả hai phương pháp có thể tinh sạch DNA plasmid từ chất chiết tế bào thô sơ. Thực
tế kết quả tốt nhất đạt được nếu chuẩn bị một dịch tan sạch trước.
Hình.3.10. Hai cấu hình của DNA plasmid. a ). Dạng siêu xoắn: hai sợi DNA
còn nguyên. b ). Dạng vòng mở: 1 trong 2 sợi bị đứt.
a.) Sự biến tính bằng kiềm:
Chương 3
9

Vấn đề cơ bản của kỹ thuật này là có một khoảng pH nhỏ mà ở đó DNA sợi
đôi bình thường bị biến tính, trong khi plasmid siêu xoắn thì không. Nếu bổ sung
dung dịch hydroxide vào chất chiết tế bào hay dịch tan sạch thì pH tăng đến 12-
12.5, pH cao này làm đứt nối hydrogen trong phân tử DNA bình thường, sau đó 2
sợi polynucleotic tách ra.( h 3.11), nếu thêm acid vào pH giảm còn 7. Những sợi
DNA của VK đã biến tính quấn lại với nhau thành một đám rối. Hỗn hợp này đem
ly tâm để tách DNA plasmid, DNA plasmid nổi lên trên, phân tử DNA thẳng lắng
dứơi đáy ống nghiệm.
Một thuận lợi của phương pháp này là ( đặc biệt là làm tan tế bào bằng SDS
hay hòa tan = dd acetate) thì hầu hết protein hay RNA cũng không hòa tan và có thể
loại bỏ bằng ly tâm. Sự xử lý với chất chiết phenol và ribonuclease có thể không cần
đến nếu phương pháp biến tính bằng dung dịch kiềm được sử dụng.
b) Phương pháp ly tâm trong gradient độ đậm nhờ Ethidiumbromide-casein
chloride:
Đây là sự đảo ngược đặc biệt của kỹ thuật ly tâm cân bằng trong gradient độ
đậm. Một mật độ gradient được tạo ra bằng ly tâm dd CsCl với tốc độ cao.( H.
3.12a). Gradient được tạo ra bởi vì với lực ly tâm lớn kéo các ion Cs và Cl về phía

plasmid ở vị trí phân biệt với DNA thẳng của VK, phần protein thì nổi lên trên đỉnh,
RNA lắng dưới đáy. Vị trí của DNA plasmid có thể được nhìn thấy bằng chiếu bức
xạ tia cực tím lên thành ống nghiệm. Tia này làm cho EtBr đã kết dính phát huỳnh
quang. DNA plasmid đựơc lấy ra bằng cách dùng ống tiêm đâm vào vị trí mẫu trên
ống nghiệm.(H.3.14 b). EtBr đã kết hợp với DNA plasmid được lấy ra bằng n-
butanol. Lắc hỗn hợp DNA plasmid với n-butanol sẽ phân hai lớp EtBr và DNA.
Chương 3
10

(H3.14 c). Sau đó tách CsCl bằng sự thẩm tích. DNA plasmid đựợc đựng trong ống
thẩm tích và đặt ống này trong dd buffer. CsCl sẽ thẩm tích vào buffer.
3.2.3. Sự khuyếch đại plasmid:
Sự chuẩn bị DNA plasmid có trở ngại là tỷ lệ DNA plasmid thì ít hơn so với
tổng DNA của VK trong tế bào. Năng suất DNA từ việc nuôi cấy tế bào VK cũng
không cao. Sự khuyếch đại plasmid thì có ý nghĩa trong vấn đề này.
Sự khuyếch đại này nhắm vào việc tăng số lượng bản sao plasmid. Một vài
plasmid có áô lượng bản sao lớn (20 hoặc hơn), đây là đặc tính có lợi cho sự
khuýêch đại, trong điều kiện để khuyếch đại plasmid NST VK không thể sao chép
và sự tổng hợp protein bị ức chế.Đặc tính này có lợi trong suốt quá trình plasmid
sinh trưởng trong nuôi cấy tế bào chuẩn bị cho sự tinh sạch DNA plasmid. Sau
khi thỏa mãn mật độ tế bào đạt được, chất ức chế tổng hợp protein được thêm vào(
chloramphenicol) và ủ trong 12 giờ. Trong suốt thời gian này plasmid tiếp tục được
sao chép trong khi sự sao chép của NST VK và sự phân chia tế bào bị ức chế
(h3.15). Kết quả là khoảng vài ngàn bản sao plasmid được tạo thành . Sự khuyếch
đại này là phương pháp có hiệu quả để nâng cao số lượng bản sao plasmid.
3.3. Sự chuẩn bị DNA phage:
Sự khác nhau cơ bản giữa sự làm sạch DNA phage và sự chuẩn bị tổng DNA
tế bào và DNA plasmid là nguyên liệu ban đầu để tinh sạch phage không phải là
chất chiết tế bào. Ta có thể thu được một lượng lớn hạt thực khuẩn thể trong dịch
ngoại bào từ việc nuôi cấy vi khuẩn bằng phương pháp nhiễm.Khi ly tâm tế bào

o
C gen cI bị bất hoạt và sự tiềm
tan không xảy ra.
H3.17 . Sự cảm ứng tiềm tan của gen cIts bằng cách tăng nhiệt độ từ 30
o
C-42
o
C.
Gen cIts xâm nhiễm vào DNA của Ecoli để sản xuất phage ngoại bào. Ở
30
o
C, không cảm ứng tế bào nhân đôi. Ở 42
o
C, nhiệt độ cảm ứng tạo genome phage
lamda mong muốn, phage này qua quá trình phân chia, tổng hợp, đóng gói và phóng
thích ra ngoài.
3.3.2. Sự chuẩn bị phage lamda có khả năng tiểm tan:
Mặc dù hầu hết phage lamda có tính tiềm tan, nhiều vector tạo dòng được tạo
ra từ phage lamda bằng cách loại bỏ gen cI và một vài gen khác vì thế sự tiềm tan
không xảy ra. Những vector này không thể xâm nhiễm vào genome vi khuẩn, chúng
chỉ xâm nhiễm vào tế bào bằng chu trình sinh tan.
Để đạt mật độ phage cao ta bổ sung phage vào giai đọan tế bào phát triển
thích hợp.
+ Nếu bổ sung phage vào khi số tế bào còn thấp phage sẽ giết chết tế bào,
mật độ phage sẽ ít. (h3.18a)
+ Nếu bổ sung phage khi mật độ tế bào quá cao, sự nuôi cấy sẽ không hoàn
tất vẫn còn lượng tế bào dư, mật độ phage sẽ ít. (h3.18b)
+Thích hợp nhất là khi nuôi vi khuẩn ở mức nào đó thì cho phage vào ở mức
đó , tạo sự cân bằng, việc nuôi cấy sẽ phát triển tốt, mật độ phage cao. (h3.18c)


lớn thì dễ dàng tinh sạch bằng phương pháp tinh sạch plasmid. Chuẩn bị chất chiết
tế bào từ tế bào đã nhiễm M13, các bản sao của M13 được tách khỏi DNA VK bằng
ly tâm độ đậm gradient EtBr-CsCl.
DNA sợi đơn của M13 được chứa trong vỏ protein của M13. Thuận lợi hơn
so với lamda là M13 dễ đạt được mật độ cao, sự tiềm tan không xảy ra (h2.8). Để
đạt được mật độ M13 cao ta cần tăng số lượng tế bào bị nhiễm lên. Mật đô M13 có
thể đạt 10
12
/ml và cao hơn nữa một cách dễ dàng nếu không dùng chất ức chế đặc
biệt. Mật độ M13 cao có ý nghĩa trong việc chuẩn bị DNA sợi đơn của M13 từ việc
nuôi cấy chỉ một thể tích nhỏ 5 ml hay ít hơn. Trong trường hợp này không có sự
tiềm tan, không có vấn đề với mảnh vỡ tế bào còn sót lại trong dịch huyền phù.
Thường thì ly tâm graduent độ đậm CsCl thì cần thiết đối với phage lamda nhưng
không cần thiết đối với M13.
Tóm lại, chuẩn bị sợi đơn DNA M13 liên quan đến việc nuôi cấy nhiễm với
thể tích nhỏ, ly tâm để loại bỏ tế bào VK, tủa phage M13 với PEG, dùng phenol để
loại bỏ vỏ protein, tủa bằng ethanol để thu DNA.
Hình 3.21Sự chuẩn bị DNA M13 của VK.
a. Nuôi cấy tế bào bị nhiễm.
b. Ly tâm loại bỏ tế bào. Tế bào lắng dưới đáy, M13 còn lại trong dịch huyền
phù.
c. Thêm PEG vào dịch huyền phù, ly tâm để tủa M13.
d. Phage M13 lơ lửng trong buffer
e. Thêm phenol loại bỏ vỏ protein thu được dịch DNA M13
f. Thêm ethanol để tủa DNA M13, DNA lắng dưới đáy.
g. Thu được DNA M13 trong thể tích nhỏ.