20
2.5.2. Tác dụng của chất bổ trợ
 Chất bổ trợ giúp kháng nguyên di chuyển đến các hạch lympho, tại đây chúng
đƣợc các tế bào lympho T nhận diện. Nhờ vậy mà có nhiều tế bào lympho T đƣợc
hoạt hóa để tham gia tạo kháng thể.
 Chất bổ trợ nhƣ một tác nhân bảo vệ vật lý giúp kháng nguyên kéo dài sự biểu
hiện bên trong cơ thể đƣợc tiêm vaccine. Qua đó hệ miễn dịch có thêm thời gian
để tăng cƣờng điều chỉnh tế bào lympho T và B.
 Chất bổ trợ giúp tăng sức chịu đựng tại nơi tiêm, giải tỏa những phản ứng phụ
nguy hiểm.
 Chất bổ trợ không chỉ tăng cƣờng đáp ứng miễn dịch đặc hiệu mà còn tăng
cƣờng đáp ứng miễn dịch không đặc hiệu.
2.5.3. Chất bổ trợ MONTANIDE (chất bổ trợ đƣợc sử dụng
trong đề tài này)
Montanide đƣợc sản xuất bởi công ty SEPPIC (trụ sở chính công ty tại Paris,
nƣớc Pháp), là chất bổ trợ tăng cƣờng tính hiệu quả và sự ổn định của vaccine,
ngoài ra nó còn làm giảm những phản ứng phụ trên cơ thể đƣợc tiêm vaccine và rất
dễ sử dụng.
Montanide đƣợc sử dụng rộng rãi cho các vaccine thƣơng phẩm trên nhiều loài
nhƣ heo, bò, cá… và chỉ đƣợc sử dụng trong thú y.
Đặc điểm Montanide:
 Dạng dung dịch dầu hỗn hợp Anhydro mannitol ether octodecenoate.
 pH: 5 - 7
 Không mùi, có màu vàng.
 Điểm sôi: > 100
o
C.
 Điểm bốc cháy: > 100
o

Bộ kít huyết thanh chuẩn để định type đối với vi khuẩn E. coli (F4, F5, F6).
Chất bổ trợ Montanide
Dung dịch formol 0,3% dùng để bất hoạt vi khuẩn.
Tăm bông tiệt trùng, que cấy, ống nghiệm, đĩa petri, kính hiển vi, tủ ấm, tủ lạnh,
nhiệt kế, cylindre, máy hấp autoclave
3.3. Nội dung
- Sản xuất auto-vaccine trong phòng thí nghiệm.
- Đánh giá hiệu quả của auto-vaccine trên heo con thí nghiệm.
3.4. Phƣơng pháp tiến hành
3.4.1. Phƣơng pháp lấy mẫu
Chọn những heo có dấu hiệu tiêu chảy, chƣa sử dụng kháng sinh. Đầu tiên, dùng
bông gòn thấm cồn để sát trùng hậu môn, tiếp theo sử dụng tampon tiệt trùng đƣa
vào trong trực tràng khoảng 3cm, ngoáy một đến hai vòng rồi cắm sâu tampon vào
giữa ống nghiệm có chứa nƣớc muối sinh lý, đậy nút bông vào cẩn thận.
Mẫu đƣợc bảo quản ở 0-4
o
C trong thùng đá sau đó đem về phòng xét nghiệm để
phân lập.
Hình 3.1. Lấy mẫu phân tiêu chảy ở heo con 23
3.4.2. Nghiên cứu vi sinh vật
3.4.2.1. Nuôi cấy phân lập
Sử dụng môi trƣờng chuyên biệt EMB (Eosin Methylen Blue).
Thực hiện phân lập vi khuẩn trực tiếp từ mẫu sang môi trƣờng chuyên biệt EMB
trên đĩa petri bằng que cấy vòng. Sau đó đem ủ đĩa EMB đã đƣợc cấy vi khuẩn
24
Kết quả trên môi trƣờng KIA của vi khuẩn E. coli là cả phần nghiêng và
phần đứng của môi trƣờng đều có màu vàng, có hơi. Từ môi trƣờng KIA, vi khuẩn đƣợc cấy truyền sang môi trƣờng TSA (Tryptone
Soya Agar) ủ ở nhiệt độ 37
o
C trong vòng 24 giờ để nhuộm Gram và thực hiện các
phản ứng sinh hóa, phản ứng huyết thanh học.
i. Nhuộm Gram: vi khuẩn từ các ống TSA đƣợc nhuộm Gram.
Kết quả: E. coli có màu hồng Gram âm.


Hình 3.5. Phản ứng Indol
Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red


Hình 3.8. Phản ứng Citrate 27
iii. Phản ứng huyết thanh học định type kháng nguyên của vi khuẩn E. coli: bằng
phản ứng ngƣng kết trên phiến kính với các kháng huyết thanh của các type F4, F5,
F6.
Tiến hành: sử dụng lame sạch, nhỏ lên lame 10µl kháng huyết thanh và 10µl nƣớc
muối sinh lý bên cạnh. Dùng que cấy vòng lấy một ít vi khuẩn trong ống TSA, trộn
vào giọt nƣớc muối sinh lý, trộn đều rồi hòa kháng huyết thanh và vi khuẩn với nhau.
Kết quả của phản ứng ngƣng kết đƣợc đọc trong vòng 30 giây sau khi vi
khuẩn và kháng huyết thanh đã đƣợc trộn lẫn.Trong trƣờng hợp vi khuẩn
có kháng nguyên phù hợp với kháng thể có trong kháng huyết thanh, trong
huyễn dịch sẽ hình thành nên các hạt ngƣng kết lớn, màu trắng đục, nhìn
thấy rất rõ bằng mắt thƣờng, phản ứng đƣợc đọc là dƣơng tính. Nếu huyễn
dịch vẫn đồng nhất, không thấy có sự xuất hiện các hạt ngƣng kết, phản
ứng đƣợc đọc là âm tính (Diagnostic Pasteur Manual. 3e ed).
Sơ đồ 3.1. Qui trình phân lập và định danh vi khuẩn E. coli (Nguyễn Ngọc Hải, 1999)

9
tế bào/ml đƣợc cho vào
các flacon đã tiệt trùng, sau đó cho chất bổ trợ Montanide vào (theo tỷ lệ 50 chất bổ
trợ và 50 dịch vi khuẩn). Bảo quản các flacon vaccine này ở 0
0
C - 4
0
C.