BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
THỬ NGHIỆM ĐIỀU CHẾ AUTO-VACCINE
PHÕNG TIÊU CHẢY DO E. coli TRÊN
HEO CON SAU CAI SỮA

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2003 – 2007
Sinh viên thực hiện: CAO VĂN HÕA Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 9/2007

iii
LỜI CẢM TẠ

Đề tài nghiên cứu này tuy Con làm còn nhiều thiếu sót và chƣa tốt nhƣng Con
cũng xin dành tặng ba mẹ. Đây là kết quả mà 22 năm ba mẹ làm lụng để nuôi dạy
con. Con hy vọng món quà bé nhỏ này sẽ làm vui và vơi bớt phần nào nỗi khổ cực,
lo âu của ba mẹ. Con trai của ba mẹ yêu ba mẹ nhiều lắm.
Em xin chân thành cảm tạ Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông Lâm thành phố
Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ Môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô
đã truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng.
Và ngƣời có ảnh hƣởng rất lớn đến sự hoàn thành đề tài này là thầy Hải (TS.
Nguyễn Ngọc Hải). Em cám ơn thầy rất nhiều về những gì mà thầy đã dành cho
em. Em đến với thầy trong một hoàn cảnh rất khác với các bạn, nhƣng với sự quan
tâm hƣớng dẫn ân cần của thầy đã giúp em có nhiều nghị lực và niềm vui mà vƣợt
qua các giai đoạn khó khăn. Khi làm việc với thầy, em không chỉ học hỏi đƣợc ở
thầy kiến thức, kỹ năng mà em còn thấy ở thầy nhiều đức tính cao đẹp để em học
tập. Thầy có lối sống thật đơn giản, nhƣng thầy rất giàu tình cảm và đức hy sinh.
Thầy là một Nhà Giáo mẫu mực đầu tiên mà em đƣợc gặp.
Em xin cảm ơn TS. Lê Anh Phụng, ThS. Trần Thị Bích Liên, cô Lê Thị Hà và
BSTY. Nguyễn Thị Kim Loan đã giúp đỡ và cho em điều kiện thực hiện đề tài
này.
Em cũng xin cảm ơn Ban lãnh đạo và các anh chị ở công ty Gia Nam đã nhiệt
tình giúp em hoàn thành đề tài này.
Và các bạn của tôi (Uyên, Thái, Phi, Linh, Vy), những ngƣời đã chia sẻ, giúp đỡ
tôi khi gặp khó khăn.
Cuối cùng, anh cám ơn Em. Em luôn bên cạnh cổ vũ khi anh mệt mỏi và động
viên khi anh cảm thấy chán. Em là nguồn tinh thần vô cùng quý báu của anh.

v
SUMMARY

CAO VAN HOA, Nong Lam University, HCM city. Graduating thesis topic:
“The experiment of auto-vaccine production to protect the post – weaning
piglet from the diarrhoea caused by E. coli”. The thesis was carried out at
Microbiology lab, Microbiology and Infectious Diseases Dept. of Faculty of Animal
Science and Veterinary, Nong Lam University and Gia Nam Ltd. Company, Binh
Duong province from 5/2007 to 8/2007.
Supervisor: Dr. NGUYEN NGOC HAI
First, isolate E. coli from the diarrhoea feces and identify them by IMViC test,
then serotype with F4, F5, F6 antiserum.
Second, selecte 5 E. coli isolates of serotype F4 or F5 to produce the auto-
vaccine.
Third, set up the experiment to evaluate the efficiency of auto-vaccine (the
experiment was repeated in 2 times):
The first group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine
injection one times.
The second group: 3 litters (28 piglets, from 14 to 20 days aged), vaccine
injection two times with 10 days interval.
The control group: 2 litters (22 piglets, from 14 to 20 days aged), adjuvant
injection two times with 10 days interval.
The efficacy of auto-vaccine was evaluated by antiody titers, medium daily gain
and the side effects.
Result:
The auto-vaccine made a high antibody titers and long immunization.
The auto-vaccine did not bring neither the bad effects to piglets vaccinated
health nor the gain weight of piglet.
The results could not conclude exactly the efficacy of auto-vaccine on E.
Coli diarrhoea control.

2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae) ....................................................................... 5
2.1.3.4. Kháng nguyên H hay kháng nguyên lông roi (flagella) ............................ 6
2.2. Bệnh tiêu chảy ................................................................................................. 6
2.2.1. Khái niệm ..................................................................................................... 6
2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy .......................................................................... 7
2.2.2.1. Điều kiện ngoại cảnh bất lợi ..................................................................... 7
2.2.2.2. Nuôi dƣỡng không đúng kỹ thuật ............................................................. 7
2.2.2.3. Vi sinh vật ................................................................................................. 8
2.3. Sự miễn dịch.................................................................................................... 9
2.3.1. Khái niệm miễn dịch .................................................................................... 9
2.3.2. Phân loại miễn dịch ...................................................................................... 9
2.3.2.1. Miễn dịch không đặc hiệu ......................................................................... 9
2.3.2.2. Miễn dịch đặc hiệu .................................................................................. 10
2.3.3. Khái niệm về kháng nguyên (antigen) và kháng thể (antibody) ................ 11

viii
2.3.3.1. Kháng nguyên (antigen) .......................................................................... 11
2.3.3.2. Kháng thể (antibody)............................................................................... 13
2.4. Auto-vaccine ................................................................................................. 16
2.4.1. Định nghĩa vaccine ..................................................................................... 16
2.4.2. Phân loại vaccine ........................................................................................ 16
2.4.2.1. Vaccine giảm độc lực (attenuated) .......................................................... 16
2.4.2.2. Vaccine bất hoạt (inactivated) ................................................................. 16
2.4.2.3. Các “toxoid” ............................................................................................ 17
2.4.2.4. Vaccine từng phần hay vaccine dƣới đơn vị (subunit) ........................... 17
2.4.2.5. Một số loại vaccine mới đang nghiên cứu .............................................. 17
2.4.3. Định nghĩa auto-vaccine ............................................................................ 18
2.4.4. Quy trình sản xuất auto-vacine .................................................................. 18
2.4.5. Ƣu điểm và nhƣợc điểm của việc sản xuất, sử dụng auto-vaccine ............ 18
2.4.5.1. Ƣu điểm ................................................................................................... 18

x
3.4.6.3. Tiến hành phản ứng ................................................................................. 34
3.4.6.4. Đọc kết quả ............................................................................................. 34
3.5. Các chỉ tiêu theo dõi ...................................................................................... 35
3.6 Xử lý số liệu ................................................................................................... 36
4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 37
4.1. Kết quả lựa chọn chủng E. coli làm auto-vaccine ......................................... 37
4.2. Phƣơng pháp bố trí thí nghiệm ...................................................................... 38
4.3. Hiệu giá kháng thể ........................................................................................ 39
4.3.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 39
4.3.1.1. Lần rút máu thứ nhất ............................................................................... 40
4.3.1.2. Lần rút máu thứ hai ................................................................................. 40
4.3.1.3. Lần rút máu thứ ba .................................................................................. 41
4.3.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 43
4.3.2.1. Lần rút máu thứ nhất ............................................................................... 43
4.3.2.2. Lần rút máu thứ hai ................................................................................. 44
4.3.2.3. Lần rút máu thứ ba .................................................................................. 44
4.3.3. Kết quả tổng kết hiệu giá kháng thể ........................................................... 46
4.4. Tỷ lệ heo tiêu chảy ........................................................................................ 47
4.4.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 47
4.4.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 48

xi
4.5. Tăng trọng tuyệt đối ...................................................................................... 50
4.5.1. Thí nghiệm 1 .............................................................................................. 50
4.5.2. Thí nghiệm 2 .............................................................................................. 51
4.5.3. Tổng kết tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua 2 thí nghiệm ...... 52
4.6. Các chỉ số khác .............................................................................................. 52
4.7. Kết quả chung ............................................................................................... 52
5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................................. 54

Hình 3.4. Vi khuẩn E. coli hình que, màu hồng Gram âm ................................... 24
Hình 3.5. Phản ứng Indol ..................................................................................... 25
Hình 3.6. Phản ứng Methyl Red ........................................................................... 25
Hình 3.7. Phản ứng Voges Proskauer .................................................................. 26
Hình 3.8. Phản ứng Citrate ................................................................................... 26
Hình 3.9. Rút máu heo con ................................................................................... 33

xiv
DANH SÁCH CÁC BẢNG

BẢNG TRANG
Bảng 2.1. Tỷ lệ các vi sinh vật gây tiêu chảy trên heo........................................... 8
Bảng 3.1. Phân lô và liều tiêm heo con ................................................................ 31
Bảng 4.1. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 1) ............ 39
Bảng 4.2. Hiệu giá kháng thể của 3 lô qua 3 lần rút máu (thí nghiệm 2) ............ 43
Bảng 4.3. Tổng kết hiệu giá kháng thể của 2 thí nghiệm ..................................... 46
Bảng 4.4. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 1 .............................................. 47
Bảng 4.5. Kết quả heo bị tiêu chảy ở thí nghiệm 2 .............................................. 48
Bảng 4.6. Tỷ lệ tiêu chảy của heo toàn thí nghiệm .............................................. 49
Bảng 4.7. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN1) ....... 50
Bảng 4.8. Kết quả thống kê tăng trọng trung bình tuyệt đối của 3 lô (TN2) ....... 51
Bảng 4.9. Tăng trọng trung bình tuyệt đối của các lô qua cả 2 TN ..................... 52

xv

Sơ đồ 3.2. Quy trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................... 29
Sơ đồ 3.3. Tóm tắt bố trí thí nghiệm ......................................................................... 31
Sơ đồ 3.4. Lịch trình thực hiện của 1 lần thí nghiệm ................................................ 31
Sơ đồ 3.5. Quy trình tạo dịch huyền phù kháng nguyên E. coli ............................... 34
Sơ đồ 3.6. Cách tiến hành phản ứng ngƣng kết xác định
hiệu giá kháng huyết thanh ...................................................................... 35 1
Chƣơng 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Trong chăn nuôi nói chung và chăn nuôi heo nói riêng, việc phòng chống dịch
bệnh là vô cùng cần thiết đối với đàn vật nuôi. Và với mô hình chăn nuôi công
nghiệp, nếu không chú ý kiểm soát thì dịch bệnh rất dễ xảy ra và dễ bùng phát thành
đại dịch.
Tiêu chảy là một trong số các bệnh xảy ra nhiều và rộng, gây tổn thất không nhỏ
cho đàn heo. Và một trong những nguyên nhân của bệnh, đặc biệt ở heo con sau cai
sữa, là vi khuẩn Escherichia coli, với đặc điểm xảy ra lẻ tẻ quanh năm và bùng phát
mạnh lúc giao mùa, khi thời tiết không ổn định (Nguyễn Khả Ngự & ctv, 1998). 3
Chƣơng 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Vi khuẩn Escherichia coli
2.1.1. Định nghĩa
Escherichia thuộc họ Enterobacteriaceae, bao gồm các loại trực khuẩn Gram âm
có kích thƣớc khoảng 2-3µm x 0,5µm, di động nhờ các tiêm mao, không tạo bào tử,
hiếu khí hoặc hiếu khí tùy nghi. Các nhóm vi khuẩn này có mặt thƣờng xuyên trong
ruột của động vật, ở phần cuối của ruột non hoặc ruột già, cần thiết trong quá trình
tiêu hóa thức ăn và là thành phần của khuẩn lạc ruột. Chúng chiếm đến 80% trong
thành phần của hệ vi sinh vật hiếu khí đƣờng ruột (Intervet, 1997).
Chi Escherichia bao gồm 5 loài: E. coli, E. fergusonii, E. hermanie, E. vulneris,
E. blattae.
Nguồn gốc tên gọi: năm 1885, tại Munich, Theodor Escherich - một bác sĩ nhi
khoa trẻ phát hiện một loài vi khuẩn từ trong tã lót của trẻ em và đƣợc công bố với
tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune, bốn năm sau, đƣợc giới chuyên môn
đổi tên thành Escherich nhằm tri ân ngƣời có công khám phá. Năm 1895, ngƣời ta
lại gọi bằng tên Bacillus coli và năm 1896, gọi thành Bacterium coli. Sau nhiều kiểu
gọi, đến năm 1991, vi khuẩn kia đƣợc định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia
coli.
4
Phân loại

C trong 2 giờ
vẫn giữ đƣợc tính kháng nguyên, có khả năng ngƣng kết và kết hợp. Kháng nguyên
O giữ một vai trò nhất định đối với khả năng gây bệnh của các dòng vi khuẩn và 5
một trong số các kháng nguyên này có tính chất chuyên biệt cho từng loài vật chủ.
Ví dụ nhƣ các type kháng nguyên sau đây:
 Ở ngƣời: O2, O4, O75, O9, O18, O22, O1.
 Ở bò: O8, O15, O20, O35, O86, O101, O115.
 Ở heo: O8, O45, O54, O138, O139, O141, O147.
 Ở gia cầm: O1, O2, O8, O11, O78.
2.1.3.2. Kháng nguyên bề mặt hay kháng nguyên K
Kháng nguyên K là kháng nguyên giáp mô, che phủ hoàn toàn kháng nguyên O
nên không cho kháng thể O gắn kết với các epitop trên kháng nguyên O, làm cho
hiện tƣơng ngƣng kết không xảy ra (Lê Huy Chính và ctv, 2001). Kháng nguyên K
gồm 3 type A, L, B.
2.1.3.3. Kháng nguyên F (fimbriae)
Là kháng nguyên tiêm mao, có hình sợi, dài 4 µm, thẳng hay xoắn, đƣờng kính
2,1 - 7 nm. Chúng tạo nên đặc tính kết dính của vi khuẩn đối với tế bào, đặc biệt là
đối với tế bào niêm mạc ruột. Kháng nguyên này cũng chính là yếu tố tạo nên khả
năng gây bệnh và khả năng ngƣng kết hồng cầu cho những vi khuẩn có mang
chúng. Tuy nhiên khả năng ngƣng kết hồng cầu này lại bị ức chế bởi đƣờng
mannose.
Gần đây, để tránh nhầm lẫn với cách gọi tên của kháng nguyên giáp mô, ngƣời ta
đã dùng danh pháp chuẩn hơn cho các yếu tố kết dính, đƣợc ký hiệu F. Trong đó,
K88 thành F4 , K99 thành F5, 987P thành F6 (Orskov, 1992; trích dẫn Broes và
Fairbrother, 1993).
Kháng nguyên F là kháng nguyên mạnh, khi xâm nhập vào trong cơ thể nó sẽ
kích thích cơ thể tạo nên kháng thể đặc hiệu và là cơ sở cho việc chẩn đoán huyết

-
và Na
+
. 7
Giảm thể tích huyết tƣơng.
Máu đặc, huyết tƣơng có hàm lƣợng Cl
-
và Na
+
giảm, hàm lƣợng urea tăng.
Tiêu chảy có 4 cơ chế chính, đó là: tiêu chảy do phân tiết, tiêu chảy do thẩm
thấu, tiêu chảy do rối loạn vận động ruột và tiêu chảy do tổn thƣơng niêm mạc ruột.
Tiêu chảy do vi khuẩn E. coli thƣờng theo cơ chế phân tiết, phân nhiều và lỏng
(Buddle và Bolton, 1992). Thang thẩm thấu do sự tích tụ của Na
+
và Cl
-
trong lòng
ruột làm cho một lƣợng lớn nƣớc di chuyển từ máu vào lòng ruột. Phân đẳng trƣơng
(isotonic) so với huyết thanh và có khuynh hƣớng kiềm vì chứa nhiều bicarbonate
(đây là một trong các cách giúp phân biệt với bệnh tiêu chảy do tiêu hóa/hấp thu
kém ở nhiễm trùng Rotavirus). Hậu quả là thú mất nƣớc và toan huyết.
2.2.2. Nguyên nhân gây tiêu chảy
Tiêu chảy là một hiện tƣợng bệnh lý liên quan đến rất nhiều yếu tố, có yếu tố là
nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Vì vậy phân biệt thật
rõ ràng nguyên nhân gây tiêu chảy không giản đơn. Đa số các nhà nghiên cứu trong
và ngoài nƣớc đề nghị phân chia các nguyên nhân gây tiêu chảy thành 3 nhóm chính

7
8
9
10
11
Escherichia coli
Isospora
Rotavirus
T.G.E virus
Enterovirus
Parvovirus
Coronavirus (khác T.G.E)
Calicivirus
Salmonella
Treponema hyodysenteriae
Không chẩn đoán được
45,6
23,0
20,9
11,2
2,0
0,7
0,5
0,2
0,1
0,1
14,0