ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
=== ===
Trần Thanh Hà
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC
RỄ CÂY CỐT KHÍ CỦ
(REYNOUTRIA JAPONICA HOUTT.)
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Cán bộ hướng dẫn: PGS. TS. Nguyễn Văn Đậu
Hà Nội – 2012
LỜI CẢM ƠN
Luận văn tốt nghiệp này được hoàn thành tại Phòng thí nghiệm Hoá
học các hợp chất thiên nhiên, Bộ môn Hoá hữu cơ, Khoa Hóa học, Trường
Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội.
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng kính trọng và lời cảm ơn
chân thành đến:
PGS. TS Nguyễn Văn Đậu đã tin tưởng giao đề tài, tận tình hướng dẫn
và tạo các điều kiện nghiên cứu thuận lợi giúp tôi trong suốt thời gian thực
hiện luận văn.
Tôi gửi lời cảm ơn chân thành tới anh chị em đồng nghiệp tại Viện
Dược liệu - nơi tôi công tác đã chia sẻ công việc, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian tôi học cao học.
Đồng thời tôi cũng gửi lời cảm ơn chân thành tới các thầy cô giáo, các
nghiên cứu sinh, các bạn học viên cao học K21 và các em sinh viên trong
Phòng thí nghiệm Hoá học các hợp chất thiên nhiên đã tạo môi trường nghiên
cứu khoa học thuận lợi giúp đỡ tôi hoàn thành tốt bản luận văn này.
Hà Nội, tháng 12 năm 2012
1.4.5. Tác dụng hạ lipit 21
1.4.6. Tác dụng chống virus 21
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
1.4.7. Trị đái tháo đường 21
1.4.8. Các tác dụng khác 22
Chương 2: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1. PHƯƠNG PHÁP CHIẾT CÁC CHẤT 25
2.2. PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH VÀ PHÂN TÁCH 25
2.3. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHỔ KHẢO SÁT CẤU TRÚC 26
2.4. PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG BẰNG HPLC 26
Chương 3: THỰC NGHIỆM 28
3.1. THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT 28
3.1.1. Thiết bị 28
3.1.2. Hóa chất 29
3.2. NGUYÊN LIỆU THỰC VẬT 29
3.3. ĐỊNH TÍNH CÁC NHÓM CHẤT CÓ TRONG RỄ CỐT KHÍ CỦ 29
3.3.1. Định tính các thành phần trong dịch chiết ete dầu hỏa 29
3.3.2. Định tính các thành phần trong dịch chiết etanol 30
3.3.3. Định tính các nhóm chất khác 32
3.4. ĐIỀU CHẾ CÁC PHẦN CHIẾT TỪ RỄ CỐT KHÍ CỦ 33
3.5. PHÂN TÍCH CÁC PHẦN CHIẾT BẰNG SẮC KÝ LỚP MỎNG 34
3.5.1. Phân tích phần chiết n-hexan (RJH) 34
3.5.2. Phân tích phần chiết etyl axetat (RJE) 35
3.5.3. Phân tích phần chiết n-butanol (RJB) 36
3.6. PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ CÁC PHẦN CHIẾT 37
3.6.1. Phân tách phần chiết n-hexan (RJH) 37
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
3.6.2. Phân tách phần chiết etyl axetat (RJE) 38
Bảng 3.4. Phân tích phần chiết n-butanol (RJB) 37
Bảng 4.1. Kết quả định tính các nhóm chất trong rễ cốt khí củ 51
Bảng 4.2. Nồng độ chất resveratrol và piceid trong hỗn hợp chuẩn 69
Bảng 4.3. Hàm lượng resveratrol và piceid có trong các mẫu rễ cốt khí củ 71
Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây cốt khí củ 6
Hình 2.1. Phương pháp sắc ký cột 26
Hình 4.1. Tương tác HSQC của RJE13 65
Hình 4.2. Tương tác HMBC của RJE13 65
Hình 4.3. Sắc ký đồ HPLC 68
Hình 4.4. Phương trình đường chuẩn piceid 70
Hình 4.5. Phương trình đường chuẩn resveratrol 70
Sơ đồ 4.1. Quy trình điều chế các phần chiết từ rễ cốt khí củ 50
Sơ đồ 4.2. Quy trình phân tách phần chiết n-hexan 53
Sơ đồ 4.3. Quy trình phân tách phần chiết etyl axetat 55
Sơ đồ 4.4. Quy trình phân tách phần chiết n-butanol 56
Sơ đồ 4.5. Các mảnh cấu trúc của emodin 59
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
CÁC CHỮ VIẾT TẮT SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN
ghép nối ion khối phổ và
UV
Các phương pháp phổ
IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại
EI-MS
Electron Impact Mass Spectroscopy
Phổ khối lư
ợng va chạm
điện tử
1
H-NMR
Proton Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
Phổ cộng hư
ởng từ hạt
nhân proton
13
C-NMR
Cacbon 13 Nuclear Magnetic Resonance
Spectroscopy
Phổ cộng hư
ởng từ hạt
nhân cacbon 13
DEPT
hỏi các nhà hóa học nghiên cứu các quy trình phân tách hiệu quả các hợp chất thiên
nhiên từ các nguồn thực vật, vi nấm, sinh vật biển… và thực hiện các chuyển hóa
hóa học, ví dụ như bằng các con đường mô phỏng sinh học (biomimetic), để tạo ra
các dẫn xuất mới.
Reynoutria Japonica Houtt. tên thường gọi là cây cốt khí củ, thuộc họ Rau
răm (Polygonaceae) là loại cây mọc hoang và được trồng phổ biến ở nhiều nơi trên
khắp nước ta và nhiều nước trên thế giới.
Rễ của cây cốt khí củ (radix Polygoni cuspidati) hay còn gọi là củ cốt khí là
một trong những vị thuốc kinh nghiệm dân gian Việt Nam và nhiều nước khác trên
thế giới có tác dụng chữa tê thấp, thông kinh, lợi tiểu, tiêu đờm, giảm đau, giảm
độc, dùng cho những người bị kinh nguyệt bế tắc, kinh nguyệt khó khăn đau đớn,
đẻ xong huyết ứ, bụng trướng, tiểu tiện khó khăn. Nó được sử dụng để điều trị các
tổn thương viêm, viêm gan, các khối u, hạ sốt và tiêu chảy. Do đó, các vị thuốc từ
củ cốt khí được quan tâm nghiên cứu và đã được tiêu chuẩn hoá trong sử dụng, các
tiêu chuẩn về kiểm nghiệm dược liệu từ củ cốt khí có trong dược điển quốc gia.
Reynoutria Japonica Houtt. (cây cốt khí củ) là một nguồn cung cấp các hợp
chất anthranoid và stilbenoid. Do có các hoạt tính chống ung thư, chống oxy hóa,
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
2
kháng viêm, hạ lipit, đóng vai trò như các phytoestrogen… cùng với độc tính thấp
các anthranoid và stilbenoid đang là khuôn mẫu hóa học cho các nghiên cứu phát
triển các thuốc chống ung thư và phòng ngừa bệnh tim mạch thế hệ mới. Do đó,
chúng tôi đã lựa chọn rễ cây cốt khí củ làm đối tượng nghiên cứu của luận văn
thạc sĩ với tiêu đề: “Nghiên cứu thành phần hoá học rễ cây cốt khí củ (Reynoutria
Japonica Houtt.)”.
Luận văn này có những nhiệm vụ nghiên cứu sau:
1 - Xây dựng một quy trình chiết thích hợp để điều chế các phần chiết chứa
các hợp chất hữu cơ poliphenol từ rễ cây cốt khí củ.
cây bụi, cây thân gỗ nhỏ, đôi khi là dây leo. Lá thường mọc cách, các lá kèm ở gốc
lá dính lại với nhau thành 1 ống gọi là bẹ chìa. Cụm hoa kép gồm nhiều xim, hoa
nhỏ thường lưỡng tính ít khi đơn tính, hoa đều không có cánh hoa, đài gồm 3-6
mảnh, màu lục trắng hay đỏ hồng; nhị 6 xếp thành 2 vòng, đôi khi 9 nhị; nhụy gồm
3 lá noãn, ít nhiều dính lại, bầu trên, chứa một noãn thẳng ở đáy. Quả đóng hạt có
phôi thẳng và nội nhũ bột lớn. Dây leo quấn, lá hình tim, rễ phình thành củ.
Tên gọi khoa học của họ dựa trên chi Polygonum và lần đầu tiên được
Antoine Laurent de Jussieu sử dụng năm 1789 trong sách Genera Plantarum của
ông [9]. Tên gọi này là chỉ tới nhiều mắt phồng lên trên thân của nhiều loài. Nó có
nguồn gốc từ tiếng Hy Lạp poly nghĩa là nhiều và goni nghĩa là đầu gối hay khớp.
Họ Rau răm (Polygonaceae) thuộc bộ Rau răm (Polygonales), phân lớp cẩm chướng
(Caryophylliadae), lớp hai lá mầm (Dicotyledoneae).
Ở Việt Nam, theo Phạm Hoàng Hộ, họ Rau răm (Polygonaceae) có 47 loài
đánh số thứ tự từ 2968 đến 3025 [2], có tài liệu lại cho rằng có 11 chi, 45 loài [107].
Đỗ Tất Lợi cũng liệt kê 11 loài trong những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam [4].
Một số thành viên trong họ này được biết đến như là kiều mạch, chút chít, đại
hoàng, nghể, rau răm, hà thủ ô đỏ, ti gôn v.v.
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
4
1.1.2. Chi Reynoutria
Trên thế giới chi Reynoutria bao gồm 28 loài [108] gồm các loại cây mọc lâu
năm, có hoa đực và hoa cái ở khác thân. Thân rễ dày đặc. Thân cây thẳng đứng, to,
rỗng. Lá đơn, mọc so le, có cuống lá, phiến lá hình trứng hoặc hình trứng - elip,
mép lá nguyên vẹn; bẹ chìa không đối xứng. Hoa đơn tính hình chùy mọc thành
cụm hoa ở nách lá; bao hoa liên tục có 5 phiến; hoa có 3 cánh, hoa cái có cánh nằm
xa trục. Nhị hoa 8. vòi nhụy 3, đầu nhụy có lông ở rìa. Quả hình trứng, có mặt cắt
tam giác [95].
Chi Reynoutria có nguồn gốc ở Đông Á, nó được di thực vào châu Âu vào
10-11.
Cốt khí củ có nguồn gốc ở vùng Đông Á, sau lan xuống khắp các vùng cận
nhiệt đới và nhiệt đới, bao gồm Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản, Việt Nam, Lào
và một vài nơi khác. Ở Việt Nam, cây mọc hoang dại ở vùng núi cao, từ 1000 -
1600 m và được trồng rải rác trong nhân dân ở vùng trung du và đồng bằng Bắc Bộ.
Cốt khí củ ưa sáng, ưa ẩm, nhưng ráo nước (úng ngập dễ làm thối củ) thường
mọc thành khóm trong các thung lũng, nơi gần nguồn nước. Cây rụng lá vào mùa
đông, ra hoa quả nhiều hàng năm, có khả năng mọc chồi từ thân rễ. Cây sinh trưởng
mạnh từ mùa xuân đến mùa thu, bắt đầu cho thu hoạch củ từ tháng 9 trở đi, nên thu
hoạch vào những ngày nắng ráo trong mùa đông, khi phần thân lá bắt đầu héo hoặc
cũng có thể thu hoạch vào đầu mùa xuân, trước khi cây tái sinh.
Củ cốt khí (radix Polygoni cuspidati) là rễ phơi hay sấy khô của cây cốt khí
củ, rễ cốt khí củ thu hái quanh năm, tốt nhất vào thu đông, rửa sạch đất cát, cắt bỏ rễ
con, thái thành miếng nhỏ dày chừng 1-2 cm, phơi hoặc sấy khô. Dược liệu có mặt
ngoài nâu xám, sần sùi, nhăn nheo theo chiều dọc, có các mấu đốt và gióng, mặt cắt
ngang màu vàng bẩn, lõi gần như rỗng, phần không rỗng có màu nâu sẫm. Chất nhẹ,
hơi cứng, mùi không rõ, vị hơi đắng [1].
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
6 Hình 1.1. Một số hình ảnh về cây cốt khí củ
1.2. ỨNG DỤNG
Theo y học cổ truyền, rễ cốt khí củ có vị đắng, tính ấm. Quy kinh can, tâm
bào với công năng hoạt huyết thông kinh, chỉ thống, trừ phong thấp, thanh thấp
nhiệt, tiêu viêm, sát khuẩn. Ở Việt Nam rễ cốt khí củ thường được dùng để chữa tê
phổ (LC–ESI-MS), Bin Shan và cộng sự đã xác định sự có mặt của emodin-8-O-
(6’-O-malonyl)-glucosid (5), emodin-1-O-glucosid (6) [13]. (4), (3) cũng đã được
phân lập với quy mô lớn (large-scale) bằng phương pháp sắc ký phân bố ngược
dòng tốc độ cao (HSCCC ) bởi Fuquan Yang và cộng sự [35].
Hợp chất (1) đã được Nguyễn Hải Nam và cộng sự phân lập vào năm 2007
từ cốt khí củ trồng ở Việt Nam [5]. Nó cũng được phân lập cùng với một hợp chất
oestrogenic mới là citreorosein (7) vào năm 2009 [105].
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
8
Sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) kết hợp với
detector UV cũng đã nhận biết được các hợp chất chrysophanol (8), rhein (9), (4),
(3), (2), (1) có trong rễ cốt khí củ [25].
Trong công bố của Guangsheng Qian năm 2006 có đề cập đến sự có mặt của
falacinol (10), questinol (11) trong rễ cốt khí củ [36].
Questin (tức emodin-8-methyl ether) (12) được phân lập bởi Hua Yan [45].
Hai anthraquinon malonylglucosid mới được Huan Zhang và cộng sự phân
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
9
lập là polyganins A (emodin-8-O-β-D-(6’-methylmalonyl)-glucopyranosid) (13) và
polyganins B (physcion-8-O-β-D-(6’-methylmalonyl)-glucopyranosid) (14) từ cặn
chiết EtOAc của dịch chiết EtOH 95% rễ cốt khí củ [46].
trans-resveratrol-3-O-β-D-glucopyranosid-5- natri sunfat (26), trans-resveratrol-3-
O-β-D-glucopyranosid-4′-natri sunfat (27) [55]. Nhóm tác giả này cũng phân lập
được hai đime stilben glycosid là (28), (29) [58].
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
11 Vinod R. Hegde và cộng sự tách được từ dịch chiết 70% metanol của rễ cốt
khí củ hai dẫn xuất của (15), tuy nhiên hai chất này mới chỉ được dự đoán có cấu
trúc như (30), (31) [93].
1.3.3. Phenol
Các hợp chất phenol cũng được phân lập như phenol sunfat: 5,7-
dimethoxyphthalid (32) [41], 1-(3-O-β-D-glucopyranosyl-4,5-dihydroxyphenyl)-
etanon (33) [56], axit natri 3,4-dihydroxy-5-methoxybenzoic (34), axit gallic (35),
axit 2,6-dihydroxybenzoic (36) [57], tachiosid (37), isotachiosid (38), axit
protocatechuic (39). Sự phong phú của các hợp chất phenol còn thể hiện qua sự có
mặt của hợp chất torachrysone-8-O-β-D-glucosid (40) [87], axit chlorogenic (41),
axit p-coumaric (42) [79].
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
121.3.4. Flavonoit
Các nghiên cứu sơ bộ về thành phần hóa học của rễ cây cốt khí củ cho thấy
sự có mặt của các flavonoit như catechin (43), (+)–catechin-5-O-β-D-
glucopyranosid (44) [57].
Năm 2009, Peihong Fan và cộng sự đã sử dụng kỹ thuật sắc ký lỏng kết hợp
ứng định tính với thuốc thử Mayer và Dragendoff. [90]
Phenylpropanoid: Các phenylpropanoid glucosid được tìm thấy trong rễ cốt
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
15
khí củ là lapathosid A (58), lapathosid C (59), hydropiperosid (60), vanicosid A
(61), vanicosid B (62) [87]. Naphthoquinon: Một naphthoquinon là 2-methoxy-6-acetyl-7-methyljuglon
(63) đã được Kimura và cộng sự phân lập được từ dịch chiết axeton rễ cốt khí củ
[61], [45]. Hợp chất này cũng đã được nghiên cứu tổng hợp với tên là 2-
methoxystypandron [89].
Trần Thanh Hà Cao học Hóa K21
Luận văn Thạc sĩ 2012
16
1.3.6. Thành phần hóa học của hoa, lá, thân cây cốt khí củ
Các nghiên cứu về cây cốt khí củ phần lớn tập trung vào bộ phận rễ của nó
bởi các hoạt tính sinh dược học quý giá. Vì thế có rất ít công bố về thành phần hóa
học cũng như hoạt tính sinh học của các bộ phận khác của cây như hoa, lá, thân.
Công bố của Nadezda Vrchotová và cộng sự (2010) gần như là công bố đầu
tiên về thành phần hóa học của hoa và thân của cây này [81].
Các hợp chất phenolic trong cặn chiết metanol của ba loài Polygonum
cuspidatum Sieb et Zucc, P. sachalinense (F. Schmidt) và P. bohemicum (Chrtek et
Chrtková) Zika (Polygonaceae) đã được nghiên cứu bằng cách sử dụng sắc ký lỏng
hiệu năng cao và điện di mao quản.
Theo đó, trong hoa của cốt khí củ có chứa các hợp chất (43), (16), (50), (52),
và một lượng lớn quercetin toàn phần. Trong thân chứa (50), (46), (45), (41), (15),
phenolic và polysaccharit. Hàm lượng của tro, protein, lignin, axit uronic và α-
cellulozơ trong lá của F. sachalinensis, F. bohemica và R. Japonica tương ứng là
63,3%, 64,1%, 63,4%, còn lại là hemicellulozơ và muối cacbohydrat của
polysaccharit pectic [103].
Theo một công bố của Naoharu Mizuno và cộng sự, trong nhựa của lá cốt
khí củ có chứa các kim loại như Ni, Mn, Fe, Zn, K, Mg, Ca. Trong đó Ni, Fe, Mn
chiếm hàm lượng cao nhất. Hàm lượng này thay đổi phụ thuộc vào các phần của lá,
vào từng loại đất mà cây sinh trưởng [83].
1.4. TÁC DỤNG SINH HỌC
Sự phong phú về thành phần hóa học và các nhóm chất có hoạt tính sinh học
cao làm cho cốt khí củ có nhiều tác dụng sinh học quý giá: chống oxy hóa, bảo vệ
tim mạch, điều hòa miễn dịch, chống ung thư, chống vi khuẩn, chống nấm, chống
virus hiệu quả.
1.4.1. Tác dụng kháng khuẩn
Rễ cốt khí củ và hoạt chất của nó là emodin (1) đã được chứng minh là có
hoạt tính kháng khuẩn trực tiếp kháng lại Vibrio vulnificus, một loại vi khuẩn gây ra
nhiễm trùng huyết dễ dẫn đến tử vong. Trong một khảo nghiệm, Kim JR và cộng sự
nhận thấy rằng rễ cốt khí củ ngăn chặn sự chết cấp tính, ngăn ngừa tổn hại về hình
thái của tế bào HeLa và RAW264.7 gây bởi V. vulnificus, ức chế sự sống sót, tăng
trưởng của V. vulnificus trong nước thường và nước biển [60].
Dịch chiết metanol của rễ cốt khí củ và các phân đoạn chiết khác nhau có
khả năng ức chế các vi khuẩn gây sâu răng gram (+) và gram (-) bao gồm 20 chủng
vi khuẩn Streptococcus mutans và Streptococcus sobrinus với nồng độ ức chế tối
thiểu MIC 0,5-4,0 mg/ml, và nồng độ diệt khuẩn tối thiểu MBC cao gấp 2-4 lần so
với MIC [90], [91], [92].
Các stilben và dẫn xuất như (15), (16), (19), anthraquinon và dẫn xuất như
(1), (2), (6) đã được chứng minh là có tác dụng diệt khuẩn đối với các vi khuẩn thực
Copyright: Tài liệu đại học ©