213
Bảng 10.3: Một số enzyme hạn chế, dạng vết cắt và nguồn gốc của chúng
Enzyme Trình tự điểm nhận biết Nguồn gốc
Eco RI 5'-G↓AA*TTC Escherichia coli RY 13
Hha I 5'-GC*G↓C
Haemophilus haemolyticus
Ba II 5'-TGG↓C*CA
Brevibacterium albidum
Hae III 5'-GG*↓CC
Haemophilus aegypticus
Bam HI 5'-G↓GATCC Bacilus amyloliquefaciens H
Hind III 5'-A↓AGCTT Hemophilus influenzae Rd
Kpn I 5'-GGTAC↓C
Klebsiella pneumoniae
Mbo I 5'-↓GATC
Moraxella bovis

Hình 10.3 : Hai dạng đầu cắt của enzyme hạn chế loại II:
a) cắt hình thành đầu tầy và b) cắt hình thành đầu dính.
V. Biến dị
1. Biến dị kiểu hình
Biến dị kiểu hình còn gọi là thường biến, là hiện tượng có sự khác
biệt về cấu trúc cũng như đặc điểm phát triển giữa thế hệ con cái so với
thế hệ bố mẹ cũng như giữa chúng với nhau dưới tác động của môi trường
và không liên quan đến sự thay đổi vật chất di truyền. Đây là những biến
dị tạm thời, thuận nghịch và không ổn định của toàn bộ quần thể sinh vật.
Những biến dị này xuất hiện chậm và mất đi khi các yếu tố làm xuất hiện
chúng mất đi.
Bản chất của biến dị kiểu hình là hiện tượng trội - lặn của gen sẵn
có trong tế bào dưới tác động cảm ứng của môi trường. Khi môi trường

trung gian.
Biến dị kiểu hình còn thể hiện ở hiện tượng dung nạp thuốc và khả
năng hình thành enzyme để sử dụng các yếu tố môi trường. Tiếp xúc lâu
ngày với nồng độ thấp chất kháng sinh có thể dẫn đến việc hình thành
những chủng vi khuẩn kháng thuốc kháng sinh do gen lặn được cảm ứng
trở nên trội (mặc dù trong đa số trường hợp sự xuất hiện tính đề kháng với
thuốc kháng sinh là do đột biến hoặc vận chuyển và tái tổ hợp thông tin di
truyền). Trong trường hợp thường biến kháng thuốc các gen tổng hợp yếu
tố đề kháng (thường là enzyme phân giải thuốc kháng sinh hoặc các hợp
chất làm thay đổi các lỗ khổng trên màng tế bào chất) từ trạng thái bị ức
chế được cảm ứng mà chuyển thành dạng hoạt động tức trở thành khuôn
tổng hợp các protein tương ứng.
2. Biến dị kiểu gen
Khái niệm biến dị kiểu gen ở sinh vật đa bào thường được coi là
đồng nhất với khái niệm đột biến (mutation). Tuy vậy, ở vi sinh vật,
thường là đơn bào, thì khái niệm biến dị kiểu gen phải được hiểu rộng
hơn và như là sự hình thành các biến chủng có thể là kết quả của đột biến
(biến đổi cấu trúc genome sẵn có) hoặc của quá trình tiếp nhận vật chất di
truyền từ bên ngoài (thường tiếp theo sau là quá trình tái tổ hợp thông tin
di truyền vào genome nhiễm sắc thể).

215
2.1. Đột biến
Đột biến là sự hình thành các cá thể có những chi tiết (cấu trúc, phát
triển) khác biệt so với thế hệ cha mẹ liên quan đến sự biến đổi vật chất di
truyền. Biến dị này là những biến đổi đột ngột, xuất hiện một cách ngẫu
nhiên, không dự tính trước được và không liên tục ở một số cá thể hiếm
hoi (tần suất xuất hiện ở vi khuẩn: 10
-8
- 10

loãng phân nhỏ ra ống nghiệm và pha loãng mà không phân nhỏ (vẫn để
trong bình lớn) để nuôi cấy chuẩn bị trước khi cấy lên đĩa thạch môi
trường có chất cảm ứng chọn lọc (streptomycin) chứng minh rằng đột
biến xảy ra ngay cả khi không tiếp xúc với yếu tố chọn lọc (chất kháng
sinh).
Tính đặc hiệu của đột biến còn hiểu là tính độc lập của đột biến.
Một tính trạng mới xuất hiện thường không ảnh hưởng đến sự hình thành
tính trạng đột biến khác. Tần suất xuất hiện một đột biến kép (ví dụ, đột
biến đề kháng cả penicillin và streptomycin) là tích số các tần suất tương
ứng. Ví dụ, tần suất xuất hiện biến chủng đề kháng một chất kháng sinh là
10
-7
và tần suất xuất hiện biến chủng đề kháng chất kháng sinh khác là 10
-

216
8
thì tần suất xuất hiện một biến chủng đề kháng cả hai thuốc trên là 10
-15
.
Như vậy, phối hợp hai thuốc trên có thể làm giảm khả năng chọn lọc
những biến chủng kháng thuốc hơn là sử dụng các thuốc kháng sinh riêng
rẽ.
Nguyên nhân đột biến có thể là do các yếu tố hóa học và vật lý ion
hóa hoặc gắn kết hóa trị với cầu nối giữa hai chuỗi monomer của DNA
xoắn kép (tia tử ngoại tạo dimer thymine, actinomycin D, ethidium
bromide, bromouracine, 2-aminopurine, ethyl- hoặc methyl-
metasulfonate, dimethyl- hoặc diethylmetasulfonate, N-methyl-N-nitro-
N-nitroso-guanidine, ethyleneimine, acid nitrơ, ). Tuy nhiên, trong nhiều
trường hợp khó có thể phát hiện và kiểm soát được các nguyên nhân gây


217
so với Acid amin nguyên thủy về thuộc tính phân cực, tính ái thủy và tính
phản ứng thì tính chất nguyên thủy của protein bị thay đổi dẫn đến chức
năng cũ của protein bị mất. Hiện tượng này biểu hiện trầm trọng nếu acid
amin thay thế nằm ở trung tâm hoạt động của một enzyme thiết yếu, kết
quả có thể là biến chủng không thể tồn tại. Trong trường hợp Acid amin
thay thế không có sự khác biệt nhiều so với acid amin nguyên thủy hoặc
đột biến tạo mật mã thoái hóa (nhiều mã bộ ba nucleotide cho một acid
amin) thì đột biến không biểu hiện tính trạng và tích lũy lặn trong quần
thể. Đây thường là nguyên nhân của sự hình thành loài mới trong quá
trình tiến hóa.
Chủng loại đột biến thường gặp khá phong phú. Có thể gặp đột biến
hình thái như đột biến dạng khuẩn lạc, thay đổi khả năng sinh sắc tố hoặc
khả năng hình thành nha bào. Đặc biệt có thể gặp các đột biến khuyết
dưỡng hay tự dưỡng (auxotrophic mutants): các chủng đột biến này mất
khả năng phát dục nếu trong môi trường thiếu một yếu tố nào đó. Ngược
lại, một số đột biến dẫn đến việc tăng khả năng tổng hợp các yếu tố sinh
trưởng hay các hợp chất khác như Acid amin, (đồng nghĩa với việc mất
khả năng điều tiết sản xuất thừa). Các đột biến khác cũng thường gặp ở vi
khuẩn là đột biến thay đổi khả năng lên men, khả năng sử dụng các
đường, đột biến gây vững bền đối với các nhân tố ức chế dẫn đến thay đổi
độc lực, thay đổi tính kháng nguyên hoặc sự mẫn cảm đối với kháng sinh
hoặc tia tử ngoại, v.v
2.2. Sự vận chuyển và tái tổ hợp thông tin di truyền
Có ba cơ chế vận chuyển di truyền khác nhau ở vi khuẩn: Biến nạp
(còn gọi là chuyển thể - transformation), tải nạp (transduction, còn gọi là
chuyển nạp) và tiếp hợp (conjugation, còn gọi là tiếp nạp hay giao phối).
Những cơ chế đều có đặc điểm là vận chuyển di truyền theo một chiều từ
tế bào này sang tế bào khác mà không có chiều ngược lại, và tế bào cho

nhau, vào sự tương đồng các phân tử DNA. Biến nạp tự nhiên thường
diễn ra ở họ Enterobacteriaceae. Trong điều kiện thí nghiệm tần suất biến
nạp tăng cao nhờ tế bào được xử lý làm thay đổi màng tế bào chất (như
xử lý polyethylene glycol) và gây sốc nhiệt (chuyển tế bào từ nhiệt độ
0°C sang nhiệt độ 40 - 50°C trong vòng 50 - 60 giây).
Griffith là người đầu tiên đã phát hiện sự biến nạp ở phế cầu khuẩn
(Streptococcus pneumoniae, tên cũ là Diplococcus pneumoniae hay
pneumococcus) vào năm 1928. Vi khuẩn này có hai dạng khác nhau.
Dạng gây bệnh cho động vật hình thành khuẩn lạc láng ký hiệu là S. Dạng
không gây bệnh hình thành khuẩn lạc nhám ký hiệu R. Nếu tiêm vi khuẩn
sống chủng S thì làm chuột nhắt chết, tiêm S chết do qua xử lý nhiệt (hơ
nóng) thì chuột vẫn sống, còn tiêm vi khuẩn chủng R sống cho chuột thì
chuột vẫn sống, nhưng tiêm R sống đồng thời với tiêm S chết lại làm
chuột chết và sau đó trong máu chuột chết phân lập được chủng S đặc
trưng. Các thí nghiệm sau đó (Avery, MacLeod và McCarty, 1944) cho
thấy nếu xử lý dịch S chết được tinh chế vẫn có năng lực biến nạp in vitro
và nếu xử lý bằng DNase thì làm mất hoạt tính biến nạp của dịch này
trong khi xử lý bằng protease vẫn giữ nguyên tính biến nạp. Điều đó
chứng minh rằng DNA, chứ không phải protein, là vật chất mang thông
tin di truyền.
Cho đến nay, những tính trạng được biến nạp được biết là khả năng
tổng hợp yếu tố sinh trưởng, khả năng sử dụng đường để sinh trưởng, khả
năng kháng thuốc, khả năng sinh độc tính, Hiện tượng này được vận
dụng rộng rãi trong kỹ thuật di truyền.

219
2.2.2. Sự tải nạp (chuyển nạp - transduction)
Tải nạp là sự vận chuyển vật chất di truyền nhờ phage
(bacteriophage hay thực khuẩn thể) là các virus ký sinh vi khuẩn. Có hai
loại phage. Các phage độc làm tan vi khuẩn ký chủ đặc hiệu trong khi các

mang chất di truyền từ tế bào cho (ký chủ trước) sang tế bào nhận (ký chủ
sau). Sự tải nạp phổ biến rộng rãi và được nghiên cứu kỹ ở vi khuẩn họ
Enterobacteriaceae. Ở E. coli đó là các phage T và P-1, ở Shigella P-1, ở
Salmonella typhimurum P-22. Các phage tải nạp ở Staphylococcus,
Pseudomonas và Proteus cũng biết đến. Quá trình tải nạp có thể vận
chuyển một hoặc một số gen bất kỳ như nêu trên được gọi là tải nạp

220
chung hay tải nạp không đặc hiệu (như tải nạp do phage P-1 và P-22 ở E.
coli, Shigella và Salmonella.
Nhiều phage chỉ có thể tái tổ hợp vào một vị trí (locus) nhất định
trong genome ký chủ. Chính vì vậy chúng chỉ có thể vận chuyển những
gen phân bố gần locus này mà thôi. Hiện tượng này gọi là tải nạp đặc
hiệu. Phage lambda (λ) ở E. coli, ví dụ, chỉ vận chuyển những gen nằm kề
locus galactosidase (Gal) là vị trí phage này tái tổ hợp vào genome ký
chủ. Tương tự, phage Φ-80 cũng ở E. coli có thể tái tổ hợp vào gần locus
điều khiển tổng hợp tryptophan và sau đó tải nạp yếu tố này một cách đặc
hiệu.
Khi nghiên cứu sự tải nạp ở Salmonella người ta còn phát hiện được
sự tải nạp khuyết (abortive transduction). Chẳng hạn, trường hợp một
đoạn nhiễm sắc thể điều khiển tổng hợp các purine được phage tải nạp
sang tế bào nhận không tái tổ hợp với nhiễm sắc thể mà tồn tại tự do trong
tế bào chất ở dạng gen ngoài (extragene) và không tự sao chép. Khi đó vi
khuẩn trở nên có khả năng phát triển trên môi trường không có hợp chất
này và thể hiện kiểu hình là các khuẩn lạc nhỏ mọc trên môi trường tổng
hợp không chứa purine. Lý do của quá trình này là gen tổng hợp purine
không sao chép được trong mỗi lần vi khuẩn phân bào nên chỉ một tế bào
vi khuẩn duy nhất mang tính trạng tổng hợp purine trong quần thể (để
phát triển và có thể hỗ trợ tế bào bên cạnh). Một số phage ôn hòa khi làm
dung nguyên hóa vi khuẩn có khả năng làm thay đổi các kháng nguyên vi

nhiễm sắc thể khi nó nằm ở trạng thái liên kết với nhiễm sắc thể đó.
Ngoài yếu tố giới tính F còn có các plasmid tiếp hợp khác như
plasmid điều khiển sự đề kháng của vi khuẩn đối với một số thuốc
(plasmid R). Plasmid điều khiển tổng hợp colicin (col j, col v2, colv 3),
plasmid điều khiển tổng hợp enterotoxin ở E. coli, plasmid Hly điều khiển
sự tổng hợp hemolysin, hemotoxin, có plasmid độc tố vir, cũng như
plasmid điều khiển tổng hợp kháng nguyên K-88 (tức F4), K-99 (tức F5)
và một vài plasmid khác.
Quá trình tiếp hợp của plasmid F tái tổ hợp trong DNA mạch vòng
của nhiễm sắc thể bắt đầu từ khi hai tế bào đực và cái tiếp xúc nhau. Khi
đó, một mạch của đoạn nhiễm sắc thể ở kề bên yếu tố F bị cắt và duỗi ra
mà trở nên có cấu trúc thẳng. Đầu nhiễm sắc thể tự do này tách ra và tự
sao thành hai sợi, hướng về phía pili giới tính và được chuyển theo pili
này sang tế bào F
-
. Bởi vì plasmid F nằm ở cuối chuỗi thẳng nhiễm sắc
thể nên nó không được truyền qua tế bào F
-
vì trong quá trình tiếp hợp
ngắn ngủi DNA nhiễm sắc thể thường bị đứt đoạn, và nhờ đó chỉ một
phần nhiễm sắc thể của tế bào F
+
được chuyển sang tế bào F
-
. Những
chủng có tần suất biến nạp gen nhiễm sắc thể cao được gọi là chủng Hfr
(chủng có tần suất biến nạp cao). Trong trường hợp pili giới tính tự do
trong tế bào chất, hai hiện tượng có thể gặp là biến nạp một phần genome
plasmid F hoặc biến nạp toàn bộ genome plasmid. Trong trường hợp đầu
chỉ một số gen của plasmid F được chuyển sang và có thể tái tổ hợp vào

xâm nhập và phát triển trong tế bào người. Bản chất của quá trình tái tổ
hợp gen virus có thể là sự trao đổi từng đoạn và trao đổi trong đoạn kết
quả là thể lai mang thông tin di truyền của cả hai chủng gốc.
Hoạt hóa đồng loạt là quá trình thường diễn ra trong một tế bào
cảm nhiễm đồng thời nhiều thể virus đã bị vô hoạt bởi bức xạ tử ngoại.
Do tử ngoại chỉ gây đột biến một số phần của genome virus nên, trong
một tế bào, các phần gen còn nguyên vẹn của các genome có thể trao đổi
(tái tổ hợp) dẫn đến hình thành thể có đầy đủ những gen nguyên vẹn.
Dị hợp hóa là hiện tượng khi một số thể virus có tính trạng khác
nhau tái sản đồng thời trong một tế bào có thể hình thành những virion
mang toàn bộ genome của một virus và một phần hoặc toàn bộ genome
của virus thứ hai. Mặc dù sự kết hợp genome trên không di truyền nhưng
nó cho phép các virus sản sinh thế hệ mới, trong đó một số virion mang
tính trạng của một virus khởi nguyên loại này còn một số khác mang tính
trạng của virus khởi nguyên loại khác. Những virus trên được gọi là dị
hợp thể và khác với các virus đồng thể ở chỗ các virion thế hệ con không
đồng nhất. Hiện tượng dị hợp hóa có thể quan sát trong các thí nghiệm
với virus cúm và virus bệnh Newcastle. Thí nghiệm cũng đã chỉ ra rằng
có thể đun nóng làm biến tính DNA virus làm mạch đôi chuyển thành
mạch đơn và khi để nguội thì mạch đôi lại tự phục hồi. Nếu trong dung

223
dịch tồn tại hai loại virus thì có thể hình thành những thể dị hợp mang
genome hỗn hợp của hai virus khởi đầu.
Chuyển vỏ (transcapsidation) là hiện tượng genome của một virus
được ấn nhập vào vỏ của virus khác có khả năng bảo tồn ở trạng thái ổn
định trong tế bào mẫn cảm với virus khởi nguồn. Hiện tượng này có thể
gặp khi nuôi cấy vào tế bào đồng thời adenovirus và virus SV-40 của khỉ.
Hoạt hóa chéo là hiện tượng genome tương tự tái tổ hợp nhưng
một trong hai virus tham gia ở dạng nguyên vẹn còn virus kia đã bị vô

biệt hai virus này đều không thể tái sản nhưng nếu cảm nhiễm hỗn hợp thì

224
quá trình tái sản của cả hai đều xảy ra. Do không có sự tái tổ hợp di
truyền nên các virion thế hệ con cháu cũng có genome khuyết tổn.
Kích thích là hiện tượng một virus nguyên vẹn khi cảm nhiễm
đồng thời với virus khuyết tổn thì cung cấp một hoặc một số nguyên liệu
cần thiết cho virus khuyết tổn thực hiện chu trình tái sản. Ví dụ virus u
thịt Raus không thể cảm ứng tổng hợp protein cấu trúc, mà sử dụng
protein của virus bạch cầu gà trong thành phần áo ngoài. Khi trong môi
trường có mặt của virus bạch cầu gà, từ các tế bào gà biến nạp (có gen đã
tái tổ hợp) virus u thịt Raus xuất hiện các virion virus u thịt Raus. Virus
bạch cầu gà trong trường hợp này gọi là virus trợ giúp. Virus á cúm typ 3
có thể là virus trợ giúp đối với virus Newcastle trong lứa cấy tế bào thận
khỉ, virus Sendai đối với virus bại liệt trong lứa cấy tế bào sơ phôi chuột
vàng, adenovirus đối với các virus tùy thuộc adeno (hay AAV, hay
adenosatelite).
Cản nhiễm (hay can thiệp cảm nhiễm, can nhiễm - interfering) là
hiện tượng một tế bào đã bị cảm nhiễm một loại (typ) virus có khả năng
đề kháng lại sự xâm nhập sau đó của virus khác. Hiện tượng này liên
quan đến sự hình thành protein đặc biệt gọi là interferon do genome tế
bào động vật chi phối, giúp tế bào bị nhiễm cũng như các tế bào bên cạnh
trở nên đề kháng tái cảm nhiễm virus. Phụ thuộc vào chủng loại virus bị
cản nhiễm mà chia thành ba loại cản nhiễm: tự cản nhiễm, cản nhiễm
đồng loại, cản nhiễm dị loại. Điểm đặc biệt của interferon là chỉ bảo vệ
được các tế bào cùng loài với tế bào đã tổng hợp nên nó (tính đặc hiệu ký
chủ) và chống lại sự xâm nhập của các loại virus khác nhau (tính không
đặc hiệu vật ký sinh). Do khả năng hình thành nhanh chóng (khoảng 24 -
48 giờ) và tạo sự đề kháng đối với nhiều loại virus một cách nhanh chóng
nên interferon được coi chú ý ứng dụng. Tác dụng của các vaccine virus

DNA tái tổ hợp vào cơ thể vật mang, dòng hóa và bước tiếp sau đó là sau
đó nuôi cấy vật mang, sản xuất (chiết xuất và tinh chế) sản phẩm mục
tiêu.
Nhờ được cắt cùng một loại enzyme hạn chế (thường là enzyme
đầu dính) các đoạn DNA mục tiêu và các DNA vector (chỉ cắt tại một
điểm của mạch vòng xoắn kép) có thể ngẫu nhiên hình thành mối liên kết
hyđrô tương bù ở các đầu dính, rồi được enzyme ligase hàn gắn các đầu
khấc. Kết quả là trong hỗn hợp hình thành thể tái tổ hợp vector với một
hoặc một số mảnh DNA của genome mục tiêu (bên cạnh các sản phẩm
không mong muốn như vector tự khép vòng, các vector tự tái tổ hợp với
nhau và các mảnh DNA không tái tổ hợp hoặc tự tái tổ hợp). Tất cả các
sản phẩm trong hỗn hợp đều được trộn với các vật mang tạo dòng, sau đó
các vật mang được nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng có chứa yếu tố
chọn lọc (chất kháng sinh đối với vi khuẩn, hóa chất gây chết đối với tế
bào động vật và thực vật). Trong điều kiện đó, chỉ các tế bào vật mang
mang vector sống sót. Hơn nữa, do plasmid bị enzyme hạn chế cắt tháo
vòng tại một vị trí xác định trong một gen điều khiển một thuộc tính nhận
biết khác, những plasmid đã tái tổ hợp mất khả năng tạo tính trạng đó ở
vật mang (chẳng hạn, mất khả năng tổng hợp beta-galactosidase), nên chỉ
những vật mang sống sót và không biểu hiện tính trạng đó được chọn
nuôi cấy tạo dòng. Bước tiếp theo là chọn những dòng biểu hiện tính
trạng của gen mục tiêu hoặc những dòng mang gen mục tiêu (nhờ lai phân
tử: các phương pháp thử nghiệm miễn dịch như ELISA, Western blot
analysis hoặc với các dò DNA hoặc RNA - Southern blot analysis,
Northern blot analysis), hoặc PCR. Nuôi cấy tạo dòng những cá thể vật

226
mang thỏa mãn các bước thử nghiệm trên giúp tạo ra dòng thuần các sinh
vật mang có thể sản xuất các sản phẩm mục tiêu.
Cho đến nay, kỹ thuật di truyền đã đạt được những bước tiến vượt

oligonucleotide có trình tự đặc hiệu biết trước từ các deoxyribonucleoside
triphosphate, thành công trong việc chế tạo máy chu kỳ nhiệt hay máy
luân nhiệt (thermocycler) và tinh chế được enzyme DNA-polymerase chịu
nhiệt (từ vi khuẩn ưu nóng Thermus aquaticus - Taq polymerase, sau đó
từ E. coli tái tổ hợp gen này của Thermus aquaticus - rTaq polymerase).
Trong máy luân nhiệt, hỗn hợp gồm DNA, dNTP, DNA-polymerase, cặp
oligonucleotide mồi và dung dịch đệm được gia nhiệt (94 - 96 °C), khi đó
các DNA mạch đôi biến tính thành chuỗi đơn, sau đó khi máy hạ nhiệt

227
xuống khoảng 40 - 60 °C thì các oligonucleotide mồi sẽ gắn vào các vị trí
đặc hiệu (có trình tự nucleotide tương bù) và cung cấp đầu 3'-OH cho
DNA polimerase gắn vào, khi gia nhiệt lên khoảng 60 - 75 °C polymerase
hoạt động gắn kết các dNTP tương bù kéo dài sợi mới theo hướng 5'→3'
làm cho sợi đơn trở thành sợi đôi bắt đầu từ điểm gắn mồi. Tiếp tục các
chu kỳ gia nhiệt gây biến tính (denaturation), hạ nhiệt gây gắn mồi
(annealling) rồi nâng nhiệt gây kéo dài (elongation) ta có thể tổng hợp
được lượng lớn sợi đơn mới. Do hai mồi trong hỗn hợp được thiết kế có
thể gắn đặc hiệu với hai sợi đơn khác nhau sao cho mạch mới tổng hợp
của mồi này cung cấp chỗ gắn cho mồi kia nên sau một số khá lớn (25 -
40) chu kỳ tổng hợp đoạn DNA nằm giữa hai mồi được tổng hợp với số
lượng lớn áp đảo. Nếu cho sản phẩm phản ứng di động trong gel nhờ
dòng điện một chiều bên cạnh các đoạn DNA có phân tử lượng (DNA
molecular weight marker) biết trước và nhuộm ethidium bromide rồi soi
dưới tia tử ngoại, ta có thể nhận ra các băng DNA và xác định được phân
tử lượng của sản phẩm (cũng như sự thuần khiết của sản phẩm). Do hai
mồi được thiết kế một cách đặc hiệu với trình tự DNA biết trước hay do
mỗi sinh vật có trình tự DNA đặc hiệu nên sản phẩm được PCR tổng hợp
có phân tử lượng đặc hiệu (do tính đặc hiệu của trình tự nucleotide). Nhờ
đó có thể dùng phản ứng này để nhận biết sự hiện diện của một đoạn gen

động với tốc độ khác nhau. Kết quả là ta có các băng (band) phân bố liên
tiếp (lần lượt, đọc từ băng di động nhanh nhất) phụ thuộc vào độ dài của
mạch đơn nucleotide tức phụ thuộc vào vị trí gắn kết của một loại ddNTP.
Trình tự đọc được chính là trình tự nucleotide của đoạn DNA bắt đầu từ
mồi.
Lai phân tử (hybridization) có thể giúp nhận biết sự hiện diện của
một phân tử đặc hiệu nào đó, gồm lai Southern (phân tích DNA) hoặc
Northern (phân tích RNA) và các kỹ thuật miễn dịch học như Western
blot analysis và ELISA. Một trình tự mạch đơn (DNA hoặc RNA) biết
trước gọi là dò (probe) được đánh dấu (bằng chất phóng xạ) được chuẩn
bị sẵn và cho tiếp xúc với sản phẩm RNA hoặc DNA sợi đơn đã cố định
trên giá thể (màng nylon hoặc màng nitrocellulose), nếu có trình tự tương
bù dò sẽ gắn kết một cách đặc hiệu. Sau khi rửa kỹ màng giá thể, nếu phát
hiện được dò (nhờ kỹ thuật phóng xạ tự ký) trên màng chứng tỏ trong sản
phẩm có chứa trình tự nucleotide tương bù. Western blot analysis là
phương pháp lai kháng thể gắn kết với một enzyme có khả năng chuyển
màu cơ chất thích hợp (đánh dấu bằng peroxidase hoặc phosphotase
kiềm) với sản phẩm đã cố định trên màng, trong khi ELISA là phương
pháp lai kháng thể đánh dấu với sản phẩm đã cố định trên bề mặt lỗ khay.
Nếu trong sản phẩm có kháng nguyên đặc hiệu thì kháng thể đánh dấu sẽ
kết hợp đặc hiệu và không bị rửa trôi. Kết quả là nếu phát hiện được yếu
tố đánh dấu (nhờ kỹ thuật chuyển màu cơ chất enzyme) thì chứng tỏ trong
sản phẩm có kháng nguyên hay protein đặc hiệu.

Câu hỏi ôn tập chương 10
1. Vật chất di truyền ở sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus?
2. Sự tự sao DNA?
3. Quá trình phiên mã?
4. Quá trình dịch mã?
5. Sự điều tiết phiên mã và điều tiết dịch mã?

Là miễn dịch tự nhiên mang tính chất bẩm sinh, bao gồm các tuyến
phòng thủ từ ngoài vào trong để ngăn chặn không cho vi sinh vật (VSV)
xâm nhập vào cơ thể.
- Hàng rào vật lý: Da và niêm mạc ngăn cách nội môi của cơ thể
với ngoại môi xung quanh. Trên mặt biểu bì chứa keratin không tan trong
nước, không bị VSV phân giải, do đó không cho VSV thấm qua. Phía
ngoài, biểu bì chủ yếu gồm tế bào chết nên virus không nhân lên được.
Niêm mạc bao phủ bề mặt trong cơ thể như đường hô hấp, tiêu hoá
và sinh dục. Chất nhầy của niêm mạc là cái bẫy bắt giữ VSV, hệ thống
nhu mao chuyển động hất VSV ra bên ngoài qua đường mũi hoặc miệng.
Lông mũi, phản xạ ho, hắt hơi, nôn cũng giúp ngăn chặn VSV xâm nhập
vào cơ thể.
* Dịch cơ thể như nước mắt, nước bọt, nước tiểu cũng giúp rửa trôi
VSV khi chúng bám trên bề mặt các mô, y hệt như ta tắm rửa để làm trôi
bụi bặm.
- Hàng rào VSV bao gồm các vi khuẩn bao phủ bề mặt hoặc khu
trú bên trong cơ thể, tạo nên khu hệ VSV bình thường. Đây là một khu hệ
VSV phức tạp, có số lượng gấp 9 lần tổng số tế bào của cơ thể. Chúng
chiếm trước các vị trí mà VSV gây bệnh đã đến, cạnh tranh thức ăn và tiết
ra chất hoá học tiêu diệt VSV gây bệnh. Ngoài ra nhiều vi khuẩn sống
trong đường tiêu hoá còn tiết ra biotin, riboflavin và các vitamin khác
cung cấp cho cơ thể. Khi phá vỡ sự cân bằng trong khu hệ, một số sẽ có
thể trở thành VSV gây bệnh cơ hội.

231
- Hàng rào hoá học: trong dịch tiết của các mô trong máu, trong
dịch lympho đều chứa các nhân tố ức chế hoặc tiêu diệt VSV gây bệnh.
* pH acid ức chế sự sinh trưởng của VSV. VSV phân giải lipid
thành acid béo làm tăng độ acid của da. Vi khuẩn lactic lên men glycogen
tạo acid lactic trong âm đạo. Dịch vị do tuyến trong dạ dày tiết ra chứa

Bạch cầu này có khả năng gây độc các ấu trùng giun.
Đại thực bào đóng vai trò quan trọng trong chống nhiễm trùng, nhất
là virus. Đại thực bào thâu tóm VSV nhờ giả túc, tạo không bào

232
(phagosom). Các không bào dung hợp với lysosom tạo phagolysosom. Các
VSV trong phagolysosom bị tiêu diệt do nhiều nguyên nhân.
- Các enzyme phụ thuộc oxy chuyển hoá oxy phân tử thành peoxit
gây độc cho VSV.
- Sự thay đổi kiểu hô hấp, tạo acid lactic làm giảm pH, pH thấp
làm tăng hoạt tính nhiều enzyme trong lysosom.
- Cơ chế thực bào không phụ thuộc oxy bao gồm hoạt động của
các enzyme phân giải của lysosom như lyzozim, photpholipase,
ribonuclease, deoxyribonuclease v.v
Sốt là cơ chế bảo vệ tự nhiên, làm tăng phản ứng enzyme phân huỷ
VSV, làm tăng hoạt động của IFN và làm giảm nồng độ sắt tự do trong
máu, do đó góp phần tiêu diệt VSV.
Viêm không đặc hiệu có tác dụng khu trú VSV vào một nơi không
cho chúng lan rộng thêm, 4 tính chất của viêm là: đỏ, đau, sưng, nóng là
do giãn mạch, tăng dòng máu, làm thoát bradykinin và prostaglandin,
bạch cầu trung tính, đại thực bào vào ổ viêm.
II.Chất sinh miễn dịch và kháng nguyên
1. Chất sinh miễn dịch (immunogen) là những chất khi đưa vào cơ
thể ở điều kiện thích hợp có khả năng gây một đáp ứng miễn dịch
(ĐUMD), còn kháng nguyên (KN-antigen) là những chất có khả năng liên
kết với kháng thể hoặc thụ thể đặc hiệu của tế bào limpho T (TCR). Tất cả
các chất sinh miễn dịch đều là kháng nguyên, nhưng không phải tất cả
kháng nguyên đều là chất sinh miễn dịch. Ví dụ: Hapten là kháng nguyên
không trọn vẹn, có thể gắn với kháng thể những không kích thích tạo
kháng thể.

Các tế bào gốc hay còn gọi là tế bào nguồn đi từ tuỷ xương vào
tuyến ức. Tại phần vỏ của tuyến ức, tiền tế bào T được phân chia nhiều lần
và biệt hoá thành tế bào T chín với các thụ thể khác nhau trên bề mặt. Các
gen kiểm tra sự hình thành các thụ thể này xuất hiện do tái tổ hợp
DNAcủa tế bào T non khi còn ở tuyến ức. Phần lớn các tế bào T có thụ thể
nhận diện được kháng nguyên bản thân sẽ bị loại trừ và chết. Các tế bào
còn lại di cư vào phần tuỷ của tuyến ức để tiếp tục biệt hoá tạo các dòng tế
bào T phân lớp, sau đó các tế bào này theo máu rời tuyến ức để vào cơ
quan lympho ngoại vi.
Túi Fabricus là cơ quan lympho trung tâm chỉ có ở gia cầm, nằm
gần hậu môn và là nơi biệt hoá tế bào B. Động vật có vú không có túi
Fabricus nên sự biệt hoá tế bào B xẩy ra ngay trong tuỷ xương và các cơ
quan tương đương, như cơ quan lympho của hệ tiêu hoá. Các tế bào B
chín rời túi đến cơ quan lympho ngoại vi. Khi tiếp xúc với kháng nguyên
sẽ được kích thích, biệt hoá để trở thành tế bào plasma (tương bào) sản
xuất kháng thể. Vì thế tế bào plasma được coi là nhà máy sản xuất kháng
thể.
1.2. Các cơ quan lympho ngoại vi
Lách là cơ quan lympho ngoại vi lớn nhất, là nơi bẫy kháng
nguyên vào bằng đường tĩnh mạch và là cơ quan chính tạo kháng thể.
Trong lách có vùng chứa tế bào T và vùng chứa tế bào B. Trung tâm mầm

234
nằm trong nang lympho ở vùng tế bào B. Trong trung tâm mầm chứa đầy
tế bào B và tế bào plasma, một số đại thực bào và tế bào tua.
Hạch lympho nằm rải rác khắp cơ thể và hoạt động như một hệ
thống lọc. Kháng nguyên di chuyển chậm theo các mạch hẹp và gấp khúc
để tăng sự tiếp xúc với đại thực bào và tế bào lympho.
Phần vỏ gồm vùng vỏ nông có nhiều nang chứa tế bào B. Khi có
kháng nguyên kích thích, nang sẽ nới rộng ra tạo trung tâm mầm, chứa

mono (tiền thân của đại thực bào) và các tế bào đa nhân (bạch cầu trung
tính, bạch cầu kiềm và bạch cầu acid). Dòng hồng cầu tạo tế bào hồng cầu
và dòng tế bào khổng lồ tạo tiểu cầu.
- Dòng lympho đi vào các cơ quan trung tâm. Nếu vào túi
Fabricius, sẽ biệt hoá thành tế bào B (từ chữ Bursa Fabricius) khi được
kháng nguyên kích thích tế bào B sẽ biệt hoá thành tế bào plasma sản xuất
kháng thể và tế bào B nhớ để đáp ứng với kháng nguyên vào lần hai.
Nếu tế bào nguồn đi vào tuyến ức sẽ được biệt hoá thành các tế bào
lympho T (từ chữ Thymus-tuyến ức). Các tế bào T được phân biệt bởi các
thụ thể bề mặt thành các dòng tế bào T4 và T8.
Dòng tế bào T4 bao gồm:
- Lympho T hỗ trợ (T
H
) có nhiệm vụ kích thích tế bào B biệt hoá
thành tế bào plasma sản xuất kháng thể.
- Lympho T cảm ứng (Ti) tiết ra intơlơkin-2 kích thích sự biệt hoá
và hoạt động của các tế bào T khác.
- Lympho T gây quá mẫm muộn (T
DTH
) tiết lymphokin hoạt hoá
đại thực bào và các bạch cầu khác gây quá mẫm muộn.
- Lympho T điều hoà ngược (T
FR
) có tác dụng hoạt hoá lympho T
ức chế.
Dòng tế bào T8 bao gồm:
- Lympho T độc (T
C
) tấn công trực tiếp các tế bào có kháng
nguyên lạ (tế bào ung thư, tế bào nhiễm virus).


Hình 11.2: Cấu tạo của kháng thể

237
Các amino acid nằm xa nhau trên cùng một chuỗi có thể gắn với
nhau nhờ cầu nối S-S để tạo vùng gấp (domain)
Chuỗi nhẹ: Trật tự amino acid của hai chuỗi nhẹ giống hệt nhau và
được chia làm hai vùng. Vùng có trật tự amino acid thay đổi gọi là vùng
biến đổi (ký hiệu V
L
), nằm phía đầu amin (-NH
2
) của phân tử. Vùng có
trật tự amino acid không thay đổi gọi là vùng cố định (ký hiệu C
L
), nằm ở
phía đầu cacboxyl (-COOH). Trật tự amino acid vùng cố định của chuỗi
nhẹ luôn giống nhau ở tất cả các lớp kháng thể, hoặc theo trật tự λ (lamda)
hoặc theo trật κ (kappa). Ngược lại trật tự ở vùng biến đổi luôn khác nhau,
kể cả ở các kháng thể do cùng một tế bào sinh ra.
Chuỗi nặng: Mỗi chuỗi nặng có 4 vùng amino acid: một vùng biến

- IgG chiếm 80% tổng Ig trong huyết thanh người bình thường,
cấu tạo gồm hai chuỗi nhẹ κ (kappa) hoặc λ (lamda) và hai chuỗi nặng γ
(gama). Ở người Việt Nam nồng độ IgG trong máu là 1400 mg/100ml.
IgG là kháng thể duy nhất được truyền từ mẹ sang thai qua nhau thai. IgG
giữ vai trò chính bảo vệ cơ thể chống tác nhân gây bệnh, đảm nhiệm các
chức năng opsonin hoá (giúp đại thực bào bắt giữ kháng snguyên), hoạt
hoá bổ thể, gây độc qua trung gian tế bào phụ thuộc kháng thể (giúp tế bào
K diệt tế bào đích) trung hoà ngoại độc tố (độc tố uốn ván, độc tố do