151

Trong tự nhiên, vitamin B
12
chỉ được tổng hợp nhờ vi sinh vật. Là
một coenzyme, trong hóa sinh học động vật vitamin B
12
có vai trò quan trọng
trong nhiều sự tái sắp xếp nội phân tử, ở đó một nguyên tử hiđro gắn vào một
nguyên tử cacbon được đổi chỗ cho một gốc thay thế gắn vào nguyên tử
cacbon bên cạnh. ở người, sự thiếu nhiều vitamin B
12
sẽ dẫn đến một bệnh
nghiêm trọng có tên là bệnh thiếu máu ác tính, được đặc trưng bởi sự sản
xuất ít các tế bào hồng cầu và bởi những sự rối loạn trong hệ thần kinh.
Nhu cầu về vitamin B
12
của động vật được đáp ứng nhờ thực phẩm ăn
vào hay nhờ hấp thụ vitamin trong ruột của động vật do các vi sinh vật đường
ruột sinh ra. Thực vật không sinh ra và cũng không sử dụng vitamin B
12
.
Để sản xuất công nghiệp vitamin B
12
người ta sử dụng các chủng vi
sinh vật đã
được chọn lọc một cách đặc biệt, có sản lượng cao về vitamin B
12
. các thành
viên
Hình 7.10: Trái -Cyanocobalamin (vitamin B12), Phải -Riboflavin (Vitamin B2)

Câu hỏi ôn tập chương 7
1.Trình bày:
a.Các cơ chế điều hòa hoạt tính và sự tổng hợp enzyme ở các chủng
hoang dại
b.Nguyên tắc của sự tổng hợp thừa.
c.Tính chất và vai trò của các enzyme dị lập thể trong điều hòa hoạt tính
enzyme.
d.Các phương pháp tạo các thể đột biến tổng hợp thừa
e. Nguyên tắc của kỹ thuật penicillin
2. Lysine có thể được tạo ra nhờ E. coli bằng cách loại CO
2
từ một acid amin
chứa 7 cacbon, acid amin này có tên là:
a.guanine
b.proline
c.acid diaminopimelic
d.acid glutamic
153
Chương 8
Các chất trao đổi bậc hai
I. Các chất kháng sinh
Hiện đã biết trên 8000 chất kháng sinh và mỗi năm có khoảng vài
trăm chất kháng sinh mới được phát hiện. Trong tương lai chắc chắn còn
có nhiều chất kháng sinh khác nữa cũng sẽ được tìm ra vì đa số các vi sinh
vật có khả năng tạo thành chất kháng sinh đã được nghiên cứu cho tới nay
đều chỉ thuộc về các chi Streptomyces và Bacillus. Nhiều nhà nghiên cứu
về các chất kháng sinh tin rằng sẽ có nhiều chất kháng sinh mới được phát
hiện nếu tìm thêm ở các nhóm vi sinh vật khác. Mặt khác các kỹ thuật của
công nghệ di truyền sẽ cho phép thiết kế một cách nhân tạo các chất kháng
sinh mới khi mà các chi tiết về bản đồ gen của các vi sinh vật sản sinh chất
kháng sinh đã được biết rõ.
Tuy nhiên, phương thức chủ yếu được sử dụng cho đến nay để phát
hiện các chất kháng sinh mới vẫn là phương pháp sàng lọc. Trong phương
pháp sàng lọc, một số lượng lớn chủng vi sinh vật có tiềm năng tạo thành
chất kháng sinh sẽ được thu thập từ tự nhiên dưới dạng giống thuấn khiết,
sau đó các chủng này sẽ được kiểm nghiệm khả năng sinh kháng sinh qua
việc xem xem chúng có tạo ra bất cứ chất khuếch tán nào có năng lực ức
chế sự sinh trưởng của các vi khuẩn kiểm định hay không. Vi khuẩn kiểm
định được lựa chọn từ nhiều loại vi khuẩn nhưng đó phải là các chủng đại

sản sinh ra không phải chỉ một loại sản phẩm cuối cùng mà trong đó có lẫn
cả các chất kháng sinh khác. Để đạt được mục tiêu cuối cùng là chỉ có một
chất kháng sinh duy nhất, các nhà hóa học đã phát triển các phương pháp
loại bỏ sản phẩm phụ trong khi đó các nhà vi sinh vật lại tìm kiếm các
chủng sản xuất không sinh ra các sản phẩm phụ không mong muốn. Hiếm
khi có thể phân lập được từ tự nhiên một chủng vi sinh vật tạo thành chất
kháng sinh mong muốn với hàm lượng cao đạt yêu cầu của sản xuất
thương mại. Do vậy, một trong những nhiệm vụ chủ yếu của các nhà vi
sinh vật học công nghiệp là phân lập các chủng mới có sản lượng cao.
Ngày nay, sản lượng penicillin đã tăng lên hơn 50.000 lần so với chủng
ban đầu nhờ việc chọn chủng và tạo ra môi trường thích hợp. Việc lựa
chọn chủng bao gồm gây đột biến giống ban đầu, nuôi các thể đột biến và
thử nghiệm các thể đột biến về khả năng sinh chất kháng sinh. Trong đa số
trường hợp, các thể đột biến thường tạo ra ít chất kháng sinh hơn bố mẹ,
do vậy việc nhận được các chủng có sản lượng cao là rất hiếm hoi.
Trong những năm gần đây, các kỹ thuật của công nghệ di truyền đã
cải thiện dáng kể các quy trình tìm kiếm các chủng cho sản lượng cao. Kỹ
thuật khuếch đại gen cho phép đưa các bản sao bổ sung của các gen mong
muốn vào một tế bào nhờ một vectơ như plasmit. Việc cải thiện các quá
trình điều khiển cũng cho phép làm tăng sản lượng. Tuy nhiên, khó khăn
của việc sử dụng các quy trình di truyền để làm tăng sản lượng là ở chỗ
các con đường sinh tổng hợp đa số các chất kháng sinh thường bao gồm
rất nhiều bước với rất nhiều gen và không rõ gen nào cần được cải biến để
nâng cao sản lượng. Do vậy, những nghiên cứu cơ bản có ý nghĩa rất quan
trọng. Trong nhiều trường hợp, để tăng sự tổng hợp một chất kháng sinh
nào đó, việc ứng dụng các kết quả nghiên cứu trao đổi chất cơ bản mang
lại nhiều lợi ích lớn hơn so với các chương trình gây đột biến và tuyển
chọn mò mẫm.

155

vẫn gây nên hàng triệu ca tử vong mỗi năm. Các đại dịch tả và dịch hạch
trong lịch sử đã từng do hai loài vi khuẩn Gram âm, Yersinia pestis và
Vibrio cholera gây ra, trong khi các chủng E. coli, Salmonella và Shigella
thường xuyên là nguyên nhân của các bệnh tiêu chảy. Trực khuẩn Gram
âm Pseudomonas aeruginosa thường được mô tả như một tác nhân cơ hội
gây bệnh ở những người bị tổn thương về miễn dịch hoặc bị bệnh u xơ
nang.
Giống như các bệnh dịch hạch, tả, tiêu chảy, một số bệnh nhiễm
khuẩn như viêm phổi thường dễ bị mắc nhất trong môi trường cộng đồng,

156
trong khi các bệnh khác lại bị nhiễm trong môi trường bệnh viện, thường
được gọi là các bệnh nhiễm trùng bệnh viện. Các bệnh sau mổ do tụ cầu
và cầu khuẩn đường ruột thuộc nhóm thứ hai, và vì chúng tồn tại trong
môi trường thường xuyên sử dụng các chất kháng sinh nên nhiều chủng tụ
cầu và cầu khuẩn đường ruột có tính đề kháng với các chất kháng sinh và
trở thành các vi khuẩn đặc biệt phiền hà.
Các tụ cầu kháng các penicillin và đặc biệt là kháng methicilin có
thể có mặt với tỷ lệ rất cao (40% tỉ lệ nhiễm trùng gặp ở Staphylococccus
aureus kháng methicilin và 50% gặp ở S. epidermidis kháng chất kháng
sinh này) ở một số bệnh viện. Chúng gây tử vong cao (25-63%) trong các
trường hợp nhiễm trùng máu.
Vào cuối những năm 1990 các cầu khuẩn đường ruột chiếm tới 12%
tổng số ca nhiễm trùng bệnh viện ở một số thành phố của Mỹ trong đó trên
15% trường hợp vi khuẩn đề kháng với vancomycin. Nhiễm trùng do cầu
khuẩn đường ruột đề kháng với vancomycin đã gây nên tỉ lệ tử vong từ 42
đến 81%.

Bảng 8.1: Phương pháp điều trị hiệu quả nhất bằng chất kháng sinh


Nhiễm trùng
đường niệu
Vi khuẩn Gram âm
như E. coli
sulfametoxazol + trimetroprim,
fluoroquinolone, fosfomycin
Lao
Mycobacterium
tuberculosis
isoniazid + rifampin + pirizinaid +
etambutol

157
Nhiều chất kháng sinh khác cũng đã được sử dụng trong những
trường hợp đặc biệt và chống lại những vi khuẩn đặc biệt, chẳng hạn
bacitracin được sử dụng tại chỗ để chống lại các bệnh nhiễm khuẩn ở da
còn các tetracyclin được dùng để điều trị các bệnh do Helicobacter, Vibrio
cholerae và các bệnh nhiễm khuẩn do Brucella.
3. Đích tác dụng của các chất kháng sinh ở vi khuẩn
Các cơ chế tác dụng của hầu hết các chất kháng sinh kháng khuẩn
đều đã được làm sáng tỏ sau khi người ta phát hiện ra rằng các phân tử này
gây hiệu quả lên sinh trưởng của vi khuẩn, hoặc bằng cách làm chậm đột
ngột sinh trưởng (ức khuẩn) hoặc giết chết vi khuẩn (diệt khuẩn). Hình 8.1
trình bày bốn đích chủ yếu ở các vi khuẩn gây bệnh được tìm ra sau nhiều
thập kỷ nghiên cứu về cơ chế tác dụng của các chất kháng sinh : sự sinh
tổng hợp thành tế bào, sự sinh tổng hợp protein, sự sao chép và sửa chữa
ADN và sự sinh tổng hợp coenzyme folate.

vị trí đa thụ thể trên màng tế bào chất vi khuẩn có thể liên kết cộng hóa trị
với penicillin. Một số protein liên kết với penicillin (penicillin binding
proteins = PBP) hoạt động như các enzyme và biểu hiện hoạt tính của
carboxypeptidase, transpeptidase, endopeptidase và transglycosilase. Vai
trò chính xác của các PBP, bất kể thuộc hoạt tính enzyme nào, trong sự
sinh trưởng và phân chia tế bào, vẫn chưa được biết rõ, và vì vậy cơ chế
phân tử của hoạt động gây chết của các chất kháng sinh β-lactam vẫn chưa
thể giải thích được.
Nhóm enzyme thứ hai phản ứng với các chất kháng sinh β-lactam có
vai trò sinh lý đối lập với các enzim tổng hợp thành tế bào, tức là, chúng
thuỷ phân vòng β-lactam và hoạt động bảo vệ tế bào khỏi sự tấn công của
các β-lactam. Việc làm bất hoạt các chất kháng sinh β-lactam bởi các β-
lactamase đã được biết tới từ cách đây hơn 50 năm, và điều này đã là một
yếu tố quan trọng đóng góp vào việc phát triển không ngừng nhóm chất
kháng sinh này. β-Lactamase là các enzyme có hiệu quả cao xúc tác cho
sự thuỷ phân hàng loạt các β-lactam. Cơ chất cho các enzyme này bao
gồm các penicillin và các cephalosporin nhị vòng cũng như các β-lactam
một vòng và các β-lacton.
4.1. Các loại penicillin
Phân nhóm
Chất kháng sinh β-lactam được phát hiện đầu tiên, penicillin G, chủ
yếu hoạt động chống lại các vi khuẩn Gram dương. Sở dĩ như vậy là vì các
vi khuẩn Gram âm không cho chất kháng sinh này đi qua. Về sau người ta
đã phát hiện ra nhiều penicillin mới trong đó một số chống lại rất có hiệu
quả các vi khuẩn Gram âm. Đó là những phát hiện có ý nghĩa nhất trên
lĩnh vực chất kháng sinh trong vài thập kỷ qua. Penicillin là các dẫn xuất
acyl của acid 6-aminopenicillanic (nhân 6-APA - hình 8.3). Chúng được
sản xuất nhờ hai kiểu lên men : kiểu 1 tạo ra các penicillin với chuỗi bên
không phân cực tức là chỉ có các β-lactam, và kiểu 2 sinh ra penicillin N
cùng với các β-lactam khác (hình 8.4). Kiểu 1 chỉ gặp ở nấm và bản chất


Hình 8.2: Cấu trúc cơ sở của một số loại chất kháng sinh β-lactam gặp
trong tự nhiên
Penicillium chrysogenum là một ví dụ biết rõ nhất về lên men kiểu
1, song một số loài Penicilium khác cũng như hàng chục chi nấm khác
cũng sản sinh các penicillin mang chuỗi bên không phân cực.
161
H×nh 8.3: Nh©n 6-APA
H×nh 8. 4: Penicillin N
Hoạt tính sinh học Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một
penicillin nào đó có thể được coi như một đại lượng để đo khả năng thâm
nhập vào màng ngoài tế bào, khả năng đề kháng với sự tấn công của các


Hình 8.5: Các penicillin bán tổng hợp
Penicillin G và ampixilin có ái lực cao đối với PBP 2 và 3 và hậu
quả là làm xuất hiện một số lượng thấp các tế bào bị phồng lên và kéo dài.

163
Amoxycilin có ái lực với các PBP 1a, 1b và 2 và cho tế bào ít có hình sợi
hơn so với ampicillin. Rõ ràng rằng tính liên kết của các penicillin khác
nhau với các PBP thay đổi rất nhiều và bản thân các PBP ở các vi sinh vật
khác nhau cũng có sự khác biệt về kiểu và số lượng. Lên men và tách sản
phẩm
Penicillium chrysogenum là cơ thể vẫn được sử dụng để sản xuất

công nghiệp.
Khi lên men kết thúc, toàn bộ môi trường lên men được lọc và sợi
nấm cũng như mọi chất rắn khác đều được loại bỏ. Dịch lọc được acid hóa
đến khoảng pH 4 rồi penicillin được chiết trong một loại dung môi như
butyl acetate. Sau đó penicillin được kết tủa khỏi dung môi nhờ bổ sung

164
acetate kali và được thú hồi nhờ biện pháp lọc. Ở bước tiếp theo, nó có thể
được kết tinh lại từ isopropanol.
Hình 8.6: Quy trình sản xuất penicillin
Muối kali của penicillin G có thể sử dụng được sau khi tiến hành
các quy trình kiểm tra chất lượng, hoặc thông thường hơn, được chuyển
hóa thành nhân 6-APA cho các quá trình chế biến tiếp theo.
Nhân 6-APA được sản xuất từ penicillin G bằng cách cho
penicillin G đi qua một cột chứa penicillin acylase bất động. Acylase sẽ
cắt penicillin G thành acid phenylacetic và 6-APA : pH của cột được giữ
trung tính bằng cách bổ sung NaOH. Nhân 6-APA rời khỏi cột được thu
hồi bằng cách kết tủa ở pH 4.

nocardicin, acid clavulanic, và thianemycin. Acid clavulanic là một chất
kháng sinh được chú ý đặc biệt bởi vì, mặc dù nó không có hiệu quả như
một chất kháng sinh song nó lại kìm hãm hoạt tính của các β-lactamase.
Các enzyme này do một số vi khuẩn tạo thành, chúng phá huỷ các chất
kháng sinh β-lactam làm cho chúng trở nên vô hiệu khi được dùng để
chữa một bệnh nào đó. Do vậy, khi được sử dụng tổ hợp cùng với các
penicillin và cephalosporin mẫn cảm với β-lactamase, acid clavulanic sẽ
làm tăng rõ rệt hoạt tính của các chất kháng sinh này.
5. Các chất kháng sinh do các sinh vật nhân sơ sinh ra
Nhiều chất kháng sinh hoạt động mạnh chống lại các sinh vật nhân
sơ cũng lại được sinh ra bởi chính các sinh vật nhân sơ. Thuộc về nhóm
này có các aminoglycoside, các macrolide, các tetracyclin và nhiều loại
khác. Trong số chúng, nhiều chất kháng sinh có công dụng y học chủ chốt
và vì vậy việc sản xuất chúng giữ vai trò quan trọng trong công nghiệp
dược.
5.1. Các chất kháng sinh aminoglycoside
Aminoglycoside là những chất kháng sinh chứa các đường amin nối
với các đường amin khác bởi các liên kết glycoside. Nhiều chất kháng
sinh có công dụng điều trị cao thuộc về các aminoglicozit, đó là
streptomycin và các chất họ hàng, kanamycin, gentamycin và neomycin.
Chúng được sử dụng trong thực tiễn y học trước hết để chống lại các vi

166
khuẩn Gram âm. Streptomycin cũng được sử dụng rộng rãi để điều trị
bệnh lao.
Đứng về mặt lịch sử, việc phát hiện ra giá trị của streptomycin đối
với bệnh lao là một bước tiến quan trọng trong y học bởi vì đó là chất
kháng sinh đầu tiên tìm thấy có khả năng khống chế bệnh nhiễm trùng
đáng sợ này. Tuy nhiên, không có chất kháng sinh aminoglycoside nào
được sử dụng rộng rãi như trước đây chúng từng được sử dụng.

vậy, bản thân nhân tố A không phải là một tiền chất của streptomycin,
điều này được chỉ ra qua hiện tượng là chỉ cần bổ sung một lượng rất nhỏ

167
nhấn tố A, 1μg, đã có thể dẫn đến việc tạo thành 1 gam streptomycin.
Song cũng cần lưu ý rằng, sự sinh tổng hợp streptomycin không chỉ được
điều khiển bởi một mình nhân tố A vì các quá trình điều khiển khác cũng
tác động lên sự sinh tổng hợp streptomycin.

Hình 8.7 Sinh tổng hợp các penicillin 168 Hình 8.8: Các chất kháng sinh β-lactam mới

169 Hình 8.9: Sinh tổng hợp streptomycin ở Streptomyces griseus
5.2. Các chất kháng sinh macrolide
Các chất kháng sinh macrolide chứa các vòng đại lacton nối với các
thành phần đường Những sự thay đổi trong cấu trúc của cả hai thành phần
vòng lacton và đường đã làm xuất hiện nhiều loại kháng sinh macrolide.
Chất kháng sinh macrolide biết rõ nhất là erythromycin, còn các macrolide
khác là oleandomixin, spiramixin và tyloxin.
Erythromycin thường được sử dụng trong điều trị để thay thế
penicillin đối với các bệnh nhân bị dị ứng với penicillin hoặc với các chất
kháng sinh β-lactam khác. Erythromycin có giá trị đặc biệt trong điều trị

được khuyến khích vì nó chứa đựng nguy cơ tạo nên hiện tượng kháng
kháng sinh.
Sự sinh tổng hợp một tetracyclin bao gồm nhiều bước phản ứng do
enzyme xúc tác. Trong trường hợp của chlotetracyclin có tới 72 sản phẩm
trung gian tham gia vào sự tổng hợp mà đa số trong chúng chỉ được biết
một cách rất đại cương.
Các nghiên cứu về di truyền học ở vi khuẩn sản sinh chlotetracyclin
Streptomyces aureofaciens cho biết rằng có trên 300 gen đã tham gia vào !
Với một số lượng gen lớn đến như vậy, sự điều khiển sinh tổng hợp chất
kháng sinh rõ ràng là rất phức tạp. Tuy nhiên một số tín hiệu điều hòa đã
được làm rõ và các quy trình sản xuất đang được cải thiện.

171
Chẳng hạn, sự tổng hợp các tetracyclin bị kiềm chế bởi cả glucose
và phosphate. Sự kiềm chế bởi phosphate có tầm ý nghĩa đặc biệt lớn bởi
vậy môi trường nuôi cấy trong sản xuất thương mại phải được sử dụng với
những nồng độ phosphate hạn chế.
Cũng giống như trong sản xuất penicillin, cao ngô được sử dụng
trong sản xuất chlotetracyclin ở quy mô lớn, song người ta tránh dùng
glucose vì glucose gây nên hiện tượng kiềm chế dị hóa. Nguồn cacbon tốt
nhất nên dùng ở đây là saccharose.
Quy trình sản xuất chlotetracyclin như sau:
Nguyên liệu cấy (bào tử trên thạch nghiêng hoặc trong đất vô trùng) cao thịt 2%; asparagin 0,05%; glucose 1%,
KH
2
PO
4

4
,ZnSO
4
; CuSO
4
; MnCl
2
Lên men chính

2-10%
nguyên liệu cấy Tinh khiết phần dịch trong
sau khi đã loại tế bào

(R
1
= H; R
2
= CH
3
; R
3
= OH; R
4
= Cl)

Hình 8.10: Quy trình sản xuất chlotetracyclin


LD
50
(đường miệng, chuột cống) LD
50
(trong màng bụng, chuột nhắt)
7,2mg/kg 10-20 mg/kg

LD
50
(đường miệng, chuột cống) 15mg/kg ; LD
50
(đường miệng, chuột cống)
4-13mg/kg
Hình 8.11: Cấu trúc của hai loại độc tố nấm điển hình Aflatoxin
B
B
1
và roquefortin 173
1. Tình hình nghiên cứu về độc tố nấm
Cho đến giữa những năm 1980 người ta đã biết tới trên 300 độc tố
nấm, chúng có thể xếp thành 25 kiểu cấu trúc và do kboảng 350 loại nấm
khác nhau tạo thành. Hình 8.10 trình bày hai loại độc tố nấm điển hình,
aflatoxin B
1
và roquefortin. Độ độc của hai loại chất độc nổi tiếng là asen
và paration cũng được nêu ra để tiện so sánh.
Penicillium roqueforti, nấm sợi sản sinh roquefortin, thường được sử

(IV, chuột nhắt) < 50mg/kg, hoại tử gan.

Hình 8.13: Độc tố T-2 (Fuarium culmorum)

Aflatoxin B
1
( A. flavus) Aflatoxin M
1
(Sữa của các động vật mà
thức ăn của chúng có chứa Aflatoxin B
1
)
Hình 8.14: Bệnh do aflatoxin ở người: độc tố, nguồn gốc và phương thức
tác dụng

Hình 8.15: Citreoviridin
(P. citreoviride, A. terreus) gây khó thở, buồn nôn, nôn mửa ngừng thở, kìm hãm
tổng hợp ATP ở ti thể
2. Cấu trúc, hoạt tính sinh học và các bệnh do độc tố nấm gây ra
Là loại sản phẩm bậc hai điển hình gặp trong tự nhiên, các độc tố nấm tồn
tại dưới rất nhiều dạng cấu trúc và có đặc tính hóa học đa dạng. Chẳng hạn