i
LỜI CẢM ƠN

Đồ án tốt nghiệp này đã được hoàn thành nhờ sự giúp đỡ tận tình của
rất nhiều thầy cô giáo, bạn bè, gia đình và các tập thể trực thuộc trường Đại
học Nha Trang. Qua đây em xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới tất cả các
cá nhân và tập thể đã giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề
tài.
Em xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn cô Th.S Ngô Thị Hoài Dương,
người đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và tận tình chỉ bảo những kinh nghiệm
quý báu trong suốt thời gian em thực hiện đề tài.
Em xin chân thành biết ơn các, cô giáo trong khoa Chế biến đã dạy dỗ và
truyền đạt cho em những kiến thức vô cùng quý báu trong suốt quá trình học
tập.
Em xin chân thành biết ơn Ban giám đốc và các anh, chị tại Phòng thí
nghiệm Trung tâm Công nghệ sinh học và Môi trường đã tạo điều kiện cho
em trong suốt quá trình thực tập.
Cuối cùng em xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thành viên trong gia đình, các
bạn đồng môn đã động viên và giúp đỡ để em có thể thực hiện tốt đề tài này.
Nha trang, tháng 7 năm 2011
Sinh viên

Vũ Thị Thúy

ii

1.4.2 Nghiên cứu ngoài nước 23
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 25
2.1 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 25
2.1.1 Đầu tôm 25
2.1.2 Enzyme Pepsin 25
2.1.3 Hóa chất 25
2.2 SƠ ĐỒ BỐ TRÍ THÍ NGHIỆM 25
2.2.1 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 26
2.2.2 Xác định thành phần hóa học cơ bản của bã ép, dịch và bã sau khi
thủy phân 27
2.2.3 Xác định mức độ khử khoảng và pH khi sử dụng axit HCl ở các nồng
độ khác nhau. 31
2.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của pH tới hoạt động của enzyme 32
2.2.5 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme 33
2.2.6 Bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của thời gian thủy phân 35
2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ XỬ LÝ SỐ LIỆU 36
2.3.1 Phương pháp nghiên cứu 36
2.3.2 Phương pháp xử lí số liệu 37
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 38
3.1 Kết quả xác định thành phần hóa học của đầu tôm Thẻ chân trắng đã ép38
3.2 Kết quả khảo sát mức độ khử khoáng ở các nồng độ axit HCl khác nhau39
3.3 Kết quả ảnh hưởng của pH tới hoạt động của enzyme 42
3.4 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ enzyme 43 iv

3.5 Kết quả ảnh hưởng của thời gian thủy phân 45
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 48
KẾT LUẬN 48

Bảng 1.2: Thành phần (%) đầu và vỏ tôm [10] 12
Bảng 3.1: Thành phần hóa học của tôm Thẻ chân trắng 38
vi

DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1: Chitin – chitosan – 1 số loại vỏ giáp xác 4

nguyên biển đã được thực hiện hơn một thế kỷ nay và cho tới bây giờ vẫn
được nghiên cứu rộng rãi trên toàn thế giới.
Hiện nay, ở nước ta nguồn phế liệu đầu và vỏ tôm được thải ra với một
số lượng khổng lồ cho phép Việt Nam phát triển nền công nghiệp phát triển
chitin và dẫn xuất của chúng. Tuy nhiên nguồn phế liệu chưa được tận dụng
trên quy mô lớn và chủ yếu được dùng cho sản xuất chitin. Các quy trình sản
xuất chitin đang sử dụng là các quy trình hóa học và chỉ tập trung thu hồi
chitin (Robert, 1997) mà không thu hồi các thành phần khác có giá trị như
protein và astaxanthin. Chất lượng của protein và astaxanthin trong qui trình
hóa học thường có chất lượng thấp do ảnh hưởng của các hóa chất xử lí và vì
vậy không được thu hồi mà thải ra môi trường, dẫn đến gây ô nhiễm môi
trường xung quanh các cơ sở chế biến phế liệu tôm. Tình trạng trên đặt ra yêu
cầu cấp bách cho các nhà khoa học công nghệ, cho ngành thuỷ sản là phải sử
dụng hợp lý và hiệu quả lượng phế liệu tôm rất lớn do các nhà máy chế biến
thuỷ sản tạo ra hàng ngày để sản xuất ra sản phẩm có giá trị cao, chitin –
chitosan.
Một trong những hướng giải quyết vấn đề trên là phải nghiên cứu ra
công nghệ sản xuất chitin và dẫn xuất bằng con đường sinh học trong đó việc
sử dụng chế phẩm enzyme thuỷ phân protein trong đầu tôm để sản xuất ra sản
phẩm chitin và dẫn xuất có chất lượng cao, chúng ta vừa có thể giải quyết
được vấn đề môi trường, vừa có thể thu hồi protein có nhiều hoạt tính sinh 2

học bổ sung vào thực phẩm. Tuy nhiên vẫn cần phải tiếp tục nghiên cứu để rút
ngắn thời sản xuất và có thể dùng nhiều loại enzyme để sản xuất. Nhiều loại
enzyme protease đã được trích ly từ tự nhiên và được ứng dụng rộng rãi như:
protease từ nội tạng tôm cá, bromelaine từ dứa, papain từ đu đủ, pepsin từ
niêm mạc lợn, protease từ vi sinh vật vv. Trong đó pepsin là loại protease

cho chất mà ông chiết ra được từ cánh cứng của những con bọ da vào những
năm 1823. Nó cũng chính là chất mà Braconnot tìm ra từ nấm mốc bậc cao.
Chitin có tên khoa học là poli–β–(1,4) 2–axetamido–2–deoxy–Dglucose. Tên
gọi chitin được dùng đến ngày nay cho cả chitin có nguồn gốc động vật hay
thực vật.
Chitin là một polysaccarit phổ biến trong tự nhiên, chỉ sau xenlulozơ.
Chúng là một thành phần quan trọng cấu tạo nên vỏ của giáp xác, biểu bì của
côn trùng cũng như có trong nhuyễn thể chân đầu và nấm. Các nguồn chitin
từ công nghiệp thuỷ sản bao gồm vỏ tôm, cua, vỏ tôm hùm, mai mực ống,
mực nang. Nhìn chung hàm lượng chitin trong phế liệu giáp xác chiếm
khoảng 10 − 60% so với khối lượng chất khô.
Chitin tồn tại trong tự nhiên ở dạng tinh thể đó là một cấu trúc gồm nhiều
phân tử được nối với nhau bằng các nối hydrogene và tạo thành một hệ thống
sợi. Chitin hiếm khi tồn tại ở trạng thái tự do và gần như luôn luôn liên kết
bởi những nối đồng hoá trị với các protein dưới dạng phức hợp chitin –
proteiques. Hậu quả là nó khó bị enzyme thủy phân và tham gia phản ứng với
nhiều hoá chất gây nhiều khó khăn cho việc nghiên cứu. Mặt khác không chỉ
có duy nhất một loại chitin mà còn có các loại polime khác nhau về kích
thước, tỷ lệ axetyl hoá, trạng thái tinh thể tuỳ vào đặc tính của cơ thể và sự
thay đổi theo mùa. [4]
Chitin là một trong những polyme có nhiều trong các loài động vật như
tôm, cua. Tận dụng nguồn nguyên liệu chitin này, chúng ta tạo ra được 4

chitosan có ứng dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau mang lại hiệu quả kinh
tế cao.

Hình 1.1: Chitin – chitosan – 1 số loại vỏ giáp xác

axetyl amino (NHCOCH
3
).
-
Trong phân tử chitin/ chitosan có chứa các nhóm chức –OH, -NHCOCH
3

trong các mắt xích N-axetyl-D- glocozamin và nhóm –OH, nhóm –NH
2
trong
các mắt xích D-glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là
amit. Phản ứng hóa học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O
-
, dẫn xuất N
-
, hoặc thế dẫn xuất thế O
-
, N.

- Mặt khác chitin/chitosan là những polime mà các monome được nối với
nhau bởi các liên kết b-(1-4)-glicozit; các liên kết này rất dễ bị cắt đứt bởi các
chất hóa học như acid, bazo, tác nhân oxy hóa và các enzyme thủy phân

Hình 1.2: Cấu tạo phân tử của Chitin

1.1.2 Tính chất của chitin và các dẫn xuất
- Chitin có màu trắng, cũng giống cellulose, chitin có tính kị nước
cao (đặc biệt đối với (α-chitin) và không tan trong nước, trong kiềm, trong
7

- Có 3 phương pháp sản xuất chitin-chitosan chính đó là: Phương pháp
hóa học, phương pháp sinh hoc và phương pháp sinh học kết hợp với phương
pháp hóa học.
 Phương pháp hóa học: Dùng NaOH để khử protein trong phế liệu tôm,
sau đó dùng HCl để khử khoáng và cuối cùng dùng các chất oxy hóa mạnh để
tẩy màu.
Ưu điểm: nhanh chóng, đơn giản, dễ thực hiện ở quy mô lớn.
Nhược điểm: Do xử lí bằng acid, kiềm ở nồng độ cao, thời gian dài nên
sản phẩm chitin-chitosan có phân tử lượng thấp, độ nhớt thấp. Đồng thời sản
phẩm có thể còn chứa tạp chất hóa học, chưa tận thu nguồn protein và
astaxanthin có giá trị để ứng dụng trong chế biến thức ăn. Bên cạnh đó, lượng
hóa chất thải ra từ quy trình sản xuất là rất lớn, gây ô nhiễm môi trường.
 Phương pháp sinh học: Phương pháp này quá trình khử khoáng được
thực hiện bằng cách lên men lactic, ủ xilo, vi sinh vật và khử protein bằng
enzym, lên men… Đối với phương pháp này thì chất thải từ quá trình sản
xuất chitin không có hóa chất không gây ô nhiễm môi trường, chất lượng
chitin-chitosan cũng được nâng cao có thể dùng trong những lĩnh vực yêu
cầu chất lượng chitin-chitosan cao như y học, thuốc, các loại mỹ
phẩm…Tuy nhiên, thời gian sản xuất rất dài và chi phí cao nên chưa được áp
dụng phổ biến.
 Phương pháp sinh học kết hợp với hóa học: Để hạn chế việc sử dụng
hóa chất, cải tiến công nghệ theo hướng thân thiện với môi trường, ứng dụng
trong công nghệ sinh học trong chế biến chitin/chitosan là xu thế hiện nay
nhằm nâng cao chất lượng chitin/chitosan, tận thu các thành phần có giá trị
phi chitin (protein, khoáng và astaxanthin), giảm thiểu chất thải hóa học ra
môi trường, góp phần phát triển bền vững ngành công nghiệp sản xuất
chitin/chitosan. Phương pháp này sử dụng enzyme và vi sinh vật để khử

9

hướng nuôi trồng tạo điều kiện thuận lợi đảm bảo nguồn nguyên liệu cho xuất
khẩu.
Ở Việt Nam nguồn tôm rất dồi dào, khả năng khai thác từ 25÷30000
tấn/năm. Toàn vùng biển Nam Bộ có trữ lượng và khả năng khai thác lớn
nhất nước ta, ước tính khả năng khai thác bằng 50% sản lượng của cả nước.
Đặc biệt, nuôi tôm đã phát triển mạnh trong những năm gần đây và trở thành
ngành kinh tế mũi nhọn. Diện tích nuôi tôm đã tăng từ 250000 ha năm 2000
lên đến 478000 ha năm 2001 và 540000 ha năm 2003. Năm 2002, giá trị xuất
khẩu từ năm 2001- 2005, tốc độ tăng trưởng tổng sản lượng thủy sản tăng
bình quân 8,97%/năm, giá trị xuất khẩu thủy sản đạt hơn 2 tỷ USD, trong đó
xuất khẩu tôm đông lạnh chiếm 47%. Năm 2003 xuất khẩu thủy sản đạt 2,3
tỷ USD bao gồm các sản phẩm chính là tôm đông lạnh, cá đông lạnh, nhuyễn
thể chân đầu, mực khô, cá ngừ và một số mặt hàng khác. Năm 2004, xuất
khẩu thủy sản đạt 2,3 tỷ USD, chiếm 8,9% tổng giá trị xuất khẩu cả nước
trong đó tôm đông lạnh chiếm 53% tổng giá trị xuất khẩu thủy sản. Năm
2006 kim ngạch xuất khẩu thủy sản đã qua mốc 3 tỷ đạt 3,31 tỷ USD, tăng
gần 600 triệu USD so với năm 2005, trong đó mặt hàng tôm truyền thống
chiếm vị trí đầu bảng xấp xỉ 1,5 tỷ USD, chiếm 44,3% tổng kim ngạch xuất
khẩu. Năm 2007, tổng kim ngạch xuất khẩu thủy sản đạt 3,75 tỷ USD tăng
12% so với năm 2006[6]. Mục tiêu xuất khẩu thủy sản đến năm 2010, Việt
Nam phấn đấu đạt giá trị 4÷4,5 tỷ USD. Định hướng đến năm 2020, chế
biến thủy sản tiếp tục là động lực thúc đẩy phát triển nuôi trồng thủy sản,
khai thác thủy sản và mang lại nhiều lợi ích kinh tế ngành, nâng cao thu
nhập và đời sống lao động nghề cá. Trong cơ cấu mặt hàng thủy sản xuất
khẩu thủy sản xuất khẩu của Việt Nam từ trước đến nay nhất là tôm đông
lạnh chiếm tỷ lệ cao. Các sản phẩm chế biến từ tôm chủ yếu là: tôm tươi

xuất khẩu sẽ là sự tăng lượng phế liệu vỏ tôm. [15] 11

Nguồn phế liệu tôm rất quan trọng trong chế biến tôm công nghiệp nhất
là thành phần đầu tôm, nó chiếm khoảng 35-45% trọng lượng tôm (Meyers,
1986). Thông thường khối lượng tôm trong công nghiệp ở Trung Quốc
khoảng 550000 tấn, và phần phế liệu đầu tôm chiếm khoảng 63% tổng khối
lượng tôm trong công nghiệp (Cui, 2006). Và nó có thể cho khoảng hơn
150000 tấn đầu tôm thải ra từ các nhà máy hàng năm (Liu & Ye, 2007). Đầu
tôm có rất nhiều thành phần có giá trị như chitin, protein, astaxanthin và
khoáng hữu cơ. Vì vậy, việc tận dụng nguồn phế liệu này đang được quan tâm
những năm gần đây.
Theo thống kê Trung tâm Nghiên cứu Chế biến Thủy sản, Đại học
Thủy sản thì lượng phế liệu năm 2004 tại Việt Nam ước tính khoảng 45000
tấn phế liệu, năm 2005 ước tính khoảng 70000 tấn/ năm. Phế liệu tôm là
những thành phần phế thải từ các cơ sở chế biến tôm bao gồm, vỏ và đuôi
tôm. Ngoài ra, còn có tôm gãy thân, lột vỏ sai quy cách hoặc tôm bị biến
màu. Tùy thuộc vào phương pháp xử lý mà lượng phế liệu có thể vượt quá
60% khối lượng sản phẩm. Với sản phẩm tôm lột vỏ, rút chỉ lưng, lượng
đuôi và vỏ đuôi của tôm chiếm khoảng 25% trọng lượng tôm. Đỗi với tôm
thẻ, lượng phế liệu đầu tôm chiếm 28% và vỏ chiếm 9%, như vậy tổng
lượng phế liệu vỏ đầu tôm thẻ là 37%. Lượng phế liệu này có thể giảm ít
nhiều bằng cách nâng cao hiệu quả lột vỏ nhờ các thiết bị và công nghệ chế
biến tốt hơn. Giảm lượng phế liệu từ khâu chế biến hoặc tìm giải pháp tái sử
dụng chúng đang trở lên phổ biến như một phương cách giúp tăng lợi nhuận
cho ngành thủy sản. Nhiều công trình nghiên cứu cho thấy tỷ lệ của phế liệu
tôm từ 30-70% (Watkin và cộng sự, 1982; Evers và Carroll, 1996, trung
bình khoảng 50% so với khối lượng tôm chưa chế biến. Halanda và Netto


Đầu 53,5 8,9 11,1 22,6 7,2 1,69
Vỏ 53,5 0,4 27,2 11,7 11,1 3,16

 Protein: protein đầu tôm thường tồn tại ở 2 dạng chính là dạng tự do
(có trong nội tạng và cơ gắn với phần thân tôm) và dạng liên kết với chitin
hoặc canxicacbonat như một phần thống nhất của vỏ tôm.
 Hệ enzyme: Hệ enzyme của tôm thường có hoạt độ mạnh hơn đặc biệt
ở cơ quan nội tạng ở đầu tôm nên rất dễ bị hư hỏng. Hệ enzyme của tôm gồm: 13

 Protease: Là enzyme chủ yếu trong đầu tôm, chủ yếu phân giải protein
thành acid amin.
 Lipaza: Phân giải lipid thành glyxeryl và acid béo.
+ Tyrozinaza: Khi có mặt của oxi không khí thì sẽ biến tyrozin thành
melanin có màu đen ảnh hưởng đến giá trị cảm quan và chất lượng của sản
phẩm.
- Chitin: Chiếm khối lượng lớn, tồn tại ở dạng liên kết với protein,
canxicacbonat và nhiều hợp chất khác.
- Chất ngấm ra ở đầu tôm: Trymethylamin (TMA), Trimethylaminoyt (
TMAO), Betain, bazo purin, các acidamin tự do, ure….Ngoài các thành phần
trên trong đầu tôm còn có một lượng đáng kể lipid, một lượng nhỏ photpho và
sắc tố.
Như vậy phế liệu đầu tôm là nguồn giàu chitin (11% trọng lượng khô),
cũng là một nguồn protein tốt (50 - 65% trọng lượng khô), giàu chất dinh
dưỡng và nguồn enzyme.
1.2.3 Các hướng tận dụng phế liệu đầu tôm [7]
Phế liệu từ các khâu chế biến cần được thu hồi và bảo quản thích hợp,

chất ủ được làm thức ăn chăn nuôi. Phương pháp này có ưu điểm là chất
lượng tốt nhưng giá thành cao và phức tạp.
1.2.3.2 Sản xuất bột màu Astaxanthin
Thành phần hóa học của tôm rất giàu protein nên trước khi sản xuất
chitin chúng ta nên thu hồi protein lại. Và trong phần vỏ của phế liệu cũng
chứa sắc tố Astaxanthin, tuy nó có hàm lượng nhỏ nhưng giá thành lại cao
trên thị trường (2500USD/kg). Hơn nữa astaxanthin còn là một carotenoid có
tác dụng kích thích sinh trưởng, kháng một số bệnh. Nó là chất tạo màu nên
được sử dụng trong kỹ thuật nuôi trồng thủy sản, thực phẩm, công nghiệp. Vì 15

vậy hiện nay vấn đề tận dụng astaxanthin trong công nghiệp chế biến phế liệu
tôm là vấn đề đang được nhiều nước quan tâm.
1.2.3.3 Sản phẩm súp và canh
Có thể sử dụng các mẩu thừa của tôm chất lượng cao sau khi chế biến
làm món canh và súp tôm. Đầu tôm được sử dụng làm nguyên liêu tạo mùi
cho món súp tôm đặc biệt. Tôm vụn được sử dụng làm món canh tôm.
1.2.3.4 Làm các sản phẩm định hình
Thịt tôm vụn hoặc không đạt chuẩn có thể được chế biến thành các sản
phẩm định hình. Sản phẩm này được định hình lại thành hình con tôm hay các
hình dạng trang trí như bánh tròn, viên, khoanh tôm. Bằng cách tạo ra các
hình dạng khác nhau, ướp tẩm gia vị hay bao bột, ta có thể làm ra rất nhiều
sản phẩm tôm đẹp mắt. Các sản phẩm định hình này được làm chín trong các
là thường hoặc lò vi sóng giống như các sản phẩm được chế biến từ tôm khác.
1.3 TỔNG QUAN VỀ ENZYME PROTEASE VÀ PEPSIN
1.3.1 Các loại enzyme protease
Nhóm enzyme protease (peptid – hidrolase 3.4) xúc tác quá trình thủy
phân liên kết peptid (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptid đến sản

cathepsin, renin. Các aspartic protein có chứa nhóm carboxyl trong trung tâm
hoạt động và thường hoạt động mạnh ở pH trung tính.
- Metallo proteinase : Metallo proteinase là nhóm proteinase được
tìm thấy ở vi khuẩn, nấm mốc cũng như các vi sinh vật cao hơn. Các metallo
proteinase thường hoạt động vùng pH trung tính và hoạt độ giảm mạnh dưới
tác dụng của EDTA.
Ngoài ra, protease được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba
nhóm :
- Protease acid : pH 2-4
- Protease trung tính : pH 7-8
- Protease kiềm : pH 9-11 17

1.3.2 Nguồn thu nhận enyme protease:[18][10]
1.3.2.1 Nguồn động vật
- Tụy tạng: đây là nguồn enzyme sớm nhất, lâu dài nhất có chứa nhiều
enzyme nhất.
- Dạ dày bê: tồn tại enzyme thuộc nhóm protease tên là rennin. Enzyme
này từ lâu được sử dụng phổ biến trong công nghệ phomat
1.3.2.2 Nguồn thực vật
Có 3 loại protease thực vật như Bromelain, Papain và Ficin. Papain
thu được từ nhựa của lá, thân, quả đu đủ (Carica papaya) còn Bromelain thu
từ quả, chồi dứa, vỏ dứa (Pineapple plant). Các protease thực vật này là trong
công nghệ làm mề thịt và trong mục tiêu tiêu hóa. Ficin thu được từ nhựa cây
cọ (Ficus carica). Enzyme được sử dụng thủy phân protein tự nhiên.
1.3.2.3 Nguồn vi sinh vật
Enzyme protease phân bố chủ yếu vi khuẩn, nấm mốc và xạ
khuẩn…gồm nhiều loài thuộc Aspergillus, Bacillus, Penicillium, Clotridium,

Hầu hết các protease phân cắt protein ở các liên kết đặc hiệu, vì thế có
thể sử dụng các enzyme này theo chiều phản ứng tổng hợp để tổng hợp các
liên kết peptide định trước. Yếu tố tăng cường quá trình tổng hợp bao gồm
pH, các nhóm carboxyl hoặc nhóm amine được lựa chọn để bảo vệ, khả năng
kết tủa sản phẩm, phản ứng trong hệ hai pha lỏng. Có thể nói vi sinh vật là
nguồn nguyên liệu thích hợp nhất để sản xuất enzyme ở quy mô lớn dùng
trong công nghệ và đời sống.
1.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình thủy phân protein bằng enzyme
protease[1]
* Ảnh hưởng của nhiệt độ
Bản chất của enzyme là protein nên khi tăng hay giảm nhiệt độ thường
ảnh hưởng tới hoạt tính của enzyme và enzyme chỉ thể hiện hoạt tính cao nhất
ở một giới hạn nhiệt độ nhất định. Thông thường đối với đa số enzyme thì 19

nhiệt độ thích hợp nằm trong khoảng 40 ÷ 50
0
C

và nhiệt độ lớn hơn 70
0
C đa
số enzyme bị mất hoạt tính. Do vậy nhiệt độ 70
0
C gọi là nhiệt độ tới hạn của
enzyme.
Trong khoảng nhiệt độ thích hợp cho hoạt độ của enzyme, nếu nhiệt độ
tăng 10