1

MỞ ĐẦU

Trong những năm gần đây tại tỉnh Khánh Hòa, khi con tôm sú đang mất dần vị thế
do dịch bệnh, ô nhiễm môi trường thì đề tài nghiên cứu sinh sản cá chẽm (Lates
calcarifer) do các thầy, cô Khoa Nuôi trồng Thủy sản, Trường Đại học Nha Trang
thực hiện (2002-2006), thật sự đã tạo một bước ngoặt lớn trong việc đưa đối tượng cá
chẽm trở thành đối tượng nuôi có giá trị kinh tế cao tại nước ta. Với các ưu điểm như:
khả năng kháng bệnh cao, sinh trưởng nhanh, tiêu thụ tốt đã giúp cá chẽm dần “lên
ngôi” và được tiến hành nuôi thương phẩm tại nhiều địa phương trên cả nước như: Hà
Tĩnh, Quảng Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu…
[4]
. Tuy vậy, sản lượng hàng năm vẫn chưa
đáp ứng đủ nhu cầu tiêu thụ nội địa và phục vụ chương trình xuất khẩu qua các thị
trường chính như Úc, châu Âu và Mỹ.
Trước nhu cầu lớn như vậy, cùng với việc người dân tự động mở rộng diện tích
nuôi một cách thiếu quy hoạch; đồng thời chưa có sự phối hợp đồng bộ với các cơ
quan chức năng, cũng như không chú ý đảm bảo yếu tố môi trường là những điều kiện
để dịch bệnh bùng phát, gây thiệt hại lớn đến sản lượng thu hoạch, cũng như nguồn thu
kinh tế thủy sản của đất nước. Trong số các bệnh thường gặp ở cá chẽm có thể kể đến
bệnh Streptococcosis gây ra thiệt hại đáng kể đến nghề nuôi cá chẽm trên thế giới,
cũng như tại Việt Nam. Và khi sử dụng kháng sinh để chữa trị, nếu không đúng
nguyên tắc thì có thể để lại dư lượng, làm giảm giá trị sản phẩm. Do đó, các nhà khoa
học đã chú ý đến việc sử dụng vaccine phòng bệnh cho cá như một giải pháp tối ưu
nhất cho sự phát triển bền vững nghề nuôi thủy sản nói chung và nghề nuôi cá chẽm
nói riêng. Mặc dù, trên thế giới vaccine phòng bệnh trong nuôi trồng thủy sản đã được
bắt đầu nghiên cứu và phát triển từ năm 1973 và cho đến nay đã có những thành tựu
nhất định, nhưng tại Việt Nam vẫn chưa có nhiều bước chuyển trong lĩnh vực này, đặc
biệt là vaccine phòng bệnh ở đối tượng cá chẽm
[1]
3

PHẦN 1: TỔNG QUAN


1.1 Hệ thống phân loại của cá chẽm
Ngành: Chordata
Lớp: Actinopterygii
Bộ: Perciformes
Họ: Latidae
Giống: Lates Hình 1.1 Cá chẽm (Lates calcarifer)
Loài: Lates calcarifer (Bloch, 1790)

Tên tiếng Việt: Cá chẽm, cá vược
Tên tiếng Anh: Sea bass, Barramundi, Giant seaperch
[5]

1.2 Đặc điểm hình thái
Cá chẽm có thân hình thon dài và dẹp bên, cuống đuôi khuyết sâu. Chiều dài
thân bằng 2.7 - 3.6 lần chiều cao, thường từ 19-25 cm
[6]
. Đầu nhọn, nhìn bên cho
thấy phía trên hơi lõm xuống ở giữa và hơi lồi ở lưng. Miệng rộng và hơi so le,
hàm trên kéo dài đến phía dưới sau hốc mắt. Răng dạng nhung, không có răng
nanh, trên nắp mang có gai cứng, vây lưng gồm có 2 vi: vi trước có 7-9 gai cứng và

1.4.1 Trên thế giới
Streptococcosis là một bệnh truyền nhiễm xảy ra không chỉ ở cá nước ngọt, cá
nước mặn trong các trang trại nuôi mà còn thấy ở ngoài tự nhiên. Theo thống kê đã có
trên 27 loài cá nước ngọt và nước mặn nhiễm bệnh. Các đối tượng nuôi nước mặn
được báo cáo thấy xuất hiện bệnh như: yellowtail (Kitao 1982), cá chẽm (lates
calcarifer), Angullla japonica, Menhaden (Brevoortia patronus) (Plumb et al. 1974,
Cook & Lofton 1975), striped mullet (Mugi1 cephalus), bluefish (Pomatomus
saltatrix), striped bass (Morone saxatilis) (Baya et al. 1990)
[16]
và hybrid striped bass
(Evans et al, 2000)
[2]
. Bệnh cũng có thể xảy ra ở một số loài cá nước ngọt như: cá rô
phi (Press et al, 1998), cá hồi (Eldar & Ghittino 1999), cá ba sa (Pangasius bocourti),
cá chép (Cyprinus carpio)
[2]
. Các chủng Streptococci chính gây ra bệnh ở động vật
thủy sản là: Lactococcus garvieae, S. iniae và S. parauberis
[3]
. Các nhà khoa học phát
hiện bệnh Streptococosis xảy ra đầu tiên ở châu Á vào năm 1957 ở cá hồi vân tại Nhật
Bản (Hoshina et al, 1958) và bắt gặp lần đầu ở châu Âu vào năm 1993
.[26]
Hiện nay,
bệnh cũng đã thấy xuất hiện ở nhiều quốc gia trên thế giới: Nhật, Israel, Mỹ,
Indonesia, Malaysia, Thái Lan…. Bệnh Streptococosis cũng đã gây ra các vấn đề
nghiêm trọng cho nền kinh tế thủy sản ở Nam Phi và Nhật Bản. Ngoài ra cũng đã phát
5

hiện Streptococcus sp trong nước và trong dạ dày- ruột ở một số ít cá cảnh nhập khẩu


Kết quả của thử nghiệm cảm nhiễm chủng Streptococcus iniae ở cá chẽm cho
thấy tỉ lệ tử vong cao: 40% sau 48h thử nghiệm
[10].

Tiếp theo đó, vào năm 1985, đã có báo cáo về bệnh xảy ra ở đối tượng cá chẽm tại
Singapore (Foo et al, 1985) và tại Trung Quốc vào năm 1990. Chủng vi khuẩn gây
bệnh được xác định là Streptococcus iniae, với tỉ lệ tử vong 16,7%- 32,6% (Huang et
al, 1990)
[10]
. Ngoài ra còn có các báo cáo về bệnh xảy ra trên cá chẽm ở Port Hurt, đảo
Bathhurst (2005) với những dấu hiệu đặc trưng như đã nêu trên.
1.4.2 Tại Việt Nam
Chưa có nhiều nghiên cứu sâu về bệnh Streptococcosis xảy ra trên đối tượng thủy
sản, chỉ thấy có báo cáo đã phân lập được Streptococcus ininae gây bệnh xuất huyết ở
cá rô phi nuôi thâm canh
[2].
1.5 Khái quát đặc điểm hệ thống miễn dịch ở cá xương. Sơ lược các công trình
nghiên cứu có liên quan đến đáp ứng Miễn dịch đặc hiệu ở cá.
Hệ thống miễn dịch ở cá xương được ví như một “tấm chắn” hoàn hảo, tạo dựng
từ hai mảnh ghép lớn: Miễn dịch không đặc hiệu (MDKĐH) và Miễn dịch đặc hiệu
(MDĐH), nhằm mục đích bảo vệ cơ thể trước sự xâm nhập của các tác nhân lạ.
Có thể nói giữa MDKĐH và MDĐH có mối liên hệ mật thiết với nhau và tạo
thành hệ thống phòng thủ vững chắc bảo vệ cơ thể. Chẳng hạn, các đại thực bào có thể
bắt và nuốt các tế bào vi khuẩn, nhưng khả năng này được tăng lên rất lớn nếu các tế
bào vi khuẩn bị bao phủ bởi các kháng thể. Mặt khác, các kháng nguyên cần phải được
xử lý bởi các đại thực bào thì hệ thống lympho mới có thể đáp ứng theo phương thức
đặc hiệu. Tổng thể các nhân tố phòng vệ hình thành nên tính miễn dịch đối với một
căn bệnh cụ thể là một mối quan hệ tương hỗ hết sức phức tạp giữa các cơ chế đặc
hiệu và cơ chế không đặc hiệu

MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU
MIỄN DỊCH KHÔNG ĐẶC HIỆU C3b Tiểu thực bào
Fc (Kháng nguyên) Tc
Đại thực bào
Tế bào B Tế bào T
Bổ thể Thực bào
Phân tử gây viêm
Đường cổ điển
Kích thích

Trình KN
8

Từ trước đến nay, cũng đã có nhiều báo cáo nghiên cứu sâu về hệ thống miễn
dịch ở cá xương, đặc biệt là hệ thống đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Theo Thompson
(1995) thì đáp ứng MDĐH được hình thành trong cá thể cách đây 400 triệu năm và tồn
tại hầu hết ở cá, động vật lưỡng cư, bò sát, chim và động vật có vú. Đã có những báo
cáo về đáp ứng miễn dịch ở các loài cá khác nhau, bao gồm cá chép (Van Diepen et al,

ràng, có thể kể đến sự đáp ứng miễn dịch với các loài kí sinh trùng sau: Myxobolus
cerebralis (Hedrick et al., 1998), Myxobolus artus (Furuta và cộng sự, 1993.),
Tetracapsuloides bryosalmonae (Saulnier & Kinkelin, 1996), Ceratomyxa Shasta
(Bartholomew, 2001) và Enteromyxum scophthalmi (Sitjà-Bobadilla et al, 2004.),
nhưng tốc độ sản xuất kháng thể là tương đối thấp. Ví dụ, ở cá hồi cầu vồng khi nhiễm
M. cerebralis, sau 12 tuần vẫn chưa thấy xuất hiện kháng thể để chống lại kí sinh trùng
(Ryce, 2003).
Trong khi đó, trường hợp cá bơn được cảm nhiễm E. scophthalmi, sau 48 ngày đã
thấy sự có mặt của kháng thể đặc hiệu nếu trước đây cá đã tiếp xúc với loài này (Sitjà-
Bobadilla và cộng sự, 2007).
[20]

Một nghiên cứu khác của Chaves, cũng đi tìm hiểu một số nhân tố đáp ứng
MDĐH ở cá chim vây vàng (Trachinotus marginatus) nuôi tại phía nam Đại Tây
Dương với loài sán lá đơn chủ Bicotylophora trachinoti, có được kết quả như sau:
Sau 15 ngày thử nghiệm, tổng số bạch cầu ở nhóm cá đã nhiễm kí sinh trùng
ngoài tự nhiên hoặc được cảm nhiễm khi bắt đầu thực nghiệm tăng cao hơn đáng kể
so với lô đối chứng. Còn sau 30 ngày thử nghiệm thì chỉ thấy tổng số bạch cầu ở
nhóm được cảm nhiễm khi thực nghiệm là tăng cao hơn đáng kể so với các nhóm
khác
[12].
Bên cạnh đó, sau 15 ngày tiến hành điều trị ở những trường hợp cá bị nhiễm
Bicotylophora trachinoti, thì thấy đại thực bào phân lập được ở nhóm được cảm
nhiễm khi bắt đầu thực nghiệm cao hơn nhóm bị nhiễm kí sinh trùng ngoài tự nhiên.
Điều đó chứng tỏ, cơ thể cá chim vây vàng đã có cơ chế đáp ứng MDĐH khi bị
nhiễm kí sinh trùng .
b. Đối với vi khuẩn:
Tại Thổ Nhĩ Kỳ, trong nghiên cứu về đáp ứng miễn dịch ở cá hồi cầu vồng
(Oncorhynchus mykiss) với Yersinia ruckeri ( Unal Ispir, 2008) có kết quả như sau:
Trong tất cả các nhóm thử nghiệm, các chỉ số miễn dịch tăng đáng kể và có sự

trong bạch cầu tăng sau mỗi lần tiêm chủng: tăng từ 31.96%
(đối chứng) lên 37.49%, 38.36%, 42.9% và 51.63% ở mạch máu ngoại vi; từ 27.09%
lên 36.63%, 36.81%, 39.28% và 46.0% ở thận; từ 22.2% lên 28.99%, 29.21%, 32.83%
và 41.58% ở pronephros; từ 18.12% lên 22.1%, 22.45%, 25.69% và 31.68% ở
mesonephros. Kết quả có được qua phương pháp ELISA cũng trùng với kết quả trên.
Tổng số và mức kháng thể đặc hiệu tăng sau mỗi lần tiêm chủng. Mức kháng thể đặc
hiệu chống S. iniae tăng đáng kể sau lần tiêm vacxin đầu tiên. Mức kháng thể đặc hiệu
có sự tăng đáng kể ở lần vacxin cuối cùng, từ 0.333 lên 0.421 (P<0.01, so với lần tiêm
vacxin thứ 3). Báo cáo của Satoh et al (1995) cũng cho thấy vai trò quan trọng của
kháng thể trong việc bảo vệ cơ thể, chống lại sự nhiễm khuẩn ở cá.
Sự thay đổi hàm lượng kháng thể có thể thấy rõ trong nghiên cứu về đáp ứng kháng
thể ở cá chẽm (Dicentrarchus labrax) với HGG (Human – γ- globulin) của Cecchini
và Saroglia (Ý, 2002 )
[11]

Tại Việt Nam, vẫn chưa có những nghiên cứu sâu về đáp ứng miễn dịch ở cá.
11 1.6 Chất bổ trợ và những nghiên cứu về ảnh hưởng của chất bổ trợ đến đáp ứng
miễn dịch đặc hiệu ở cá
Có thể thấy, việc sử dụng vaccine cho các đối tượng nuôi thuỷ sản, đặc biệt là
các loài cá xương được nghiên cứu từ những năm 1960 và bắt đầu đưa ra thị trường từ
đầu những năm 1980. Bên cạnh đó, chiến lược phòng bệnh cho cá bằng vaccine ở quy
mô thương mại đã được thực hiện rất hiệu quả trong nghề nuôi cá hồi nhằm phòng
ngừa các bệnh do vi khuẩn: bệnh xuất huyết đường tiêu hoá (enteric redmouth –
ERM), bệnh do Vibrio (vibriosis), bệnh do Vibrio mùa lạnh (cold water vibriosis), và
bệnh lở loét (furunculosis) (Ellis 1997; Gudding et al. 1997).
[2]
Đến nay, việc sử dụng

pháp tiêm. Đáng tiếc là FCA có thể gây tác dụng phụ (hình thành các nốt sần cục bộ,
các bệnh tự miễn, và nhạy cảm với tuberculin) và không thể dùng trong các sản phẩm
vaccine dùng cho động vật có vú. Ở cá, FCA cũng gây tác dụng phụ là các vết lỡ loét
khi tiêm cơ; các nốt sần trong xoang bụng khi tiêm xoang bụng. Horn et al. (1986)
thông báo rằng việc sử dụng FCA nâng cao sức đề kháng cho cá thí nghiệm nhưng có
thể gây ức chế sinh trưởng cho cá nuôi.
Chất bổ trợ Freund không hoàn chỉnh (incomplete Freunds’ adjuvant - FIA) có
bản chất là dầu khoáng thường được dùng trong các sản phẩm vaccine thương mại tuy
nhiên sản phẩm này thường tạo ra phản ứng phụ với việc hình thành nên các nốt sần ở
mô bị tiêm vaccine.
+ Các chất bổ trợ dùng cho ăn và ngâm
Một số chất bổ trợ khác, về nguyên lý, có thể được dùng trong các loại vaccine sử
dụng theo phương pháp ngâm hoặc cho ăn trong ngành nuôi trồng thuỷ sản bao gồm
hydroxit nhôm, các muối nhôm, các loại dầu thực vật và glucans (Midtlyng et al.
1996; Anderson et al. 1997). Tuy nhiên, nghiên cứu sâu về việc sử dụng các chất này
vẫn còn khá hạn chế.
Udey và Fryer (1984) thông báo rằng việc xử lý vaccine kháng vibriosis dùng
cho phương pháp ngâm với muối Kali sulphate nhôm giúp gia tăng khả năng tiếp thụ
kháng nguyên ở cá thí nghiệm, và do đó được xem là có ý nghĩa trong việc gia tăng
đáp ứng miễn dịch của cá. Trong một nghiên cứu khác, Agius et al. (1983) cũng thông
báo rằng khi gây miễn dịch đối với bệnh vibriosis bằng cách cho ăn, đáp ứng bảo vệ
13

của cá đối với Vibrio tăng lên đáng kể khi xử lý vaccine với chất bổ trợ muối nhôm
này, mặc dù thời gian hình thành đáp ứng bảo vệ (8 tuần) có chậm hơn so với phương
pháp tiêm vaccine (2 tuần). Mức độ đề kháng bệnh của nhóm cá cho ăn vaccine kết
hợp muối nhôm (tỷ lệ sống 70% so với 0% ở nhóm cá đối chứng) tuy có thấp hơn so
với phương pháp tiêm, nhưng các số liệu này cũng đáng được chú ý do ý nghĩa thực
tiễn quan trọng của việc xử dụng vaccine bằng cách cho ăn ít gây tốn kém về nhân lực
và thiết bị hơn nhiều.

có tác dụng nâng cao đáp ứng miễn dịch nhiều hơn bao nhiêu so với nhóm cá chỉ được
tiêm mỗi vi khuẩn. Kết quả tương tự cũng được quan sát thấy ở cá hồi cầu vồng khi
được tiêm văcxin Vibrio anguillarum bởi Ward et al
[17].

Trong nghiên cứu về đáp ứng MDĐH ở cá Bơn (Psetta maxima) với formalin-
killer scuticociliates, người ta cũng sử dụng chất bổ trợ - Montanide ISA 763A
(MON). Kết quả có được: Lượng huyết thanh kháng thể tăng ở những con cá được
tiêm chủng sau liều tiêm nhắc và đặc biệt là sau khi cảm nhiễm. Thêm vào đó, sự bảo
vệ chắc chắn đã có được ở nhóm được tiêm chủng so với nhóm đối chứng hoặc nhóm
cá chỉ nhận một mình MON và lượng kháng thể đặc hiệu cũng là cao nhất ở nhóm
được tiêm chủng. Ở mẫu sau khi tiêm chủng, kháng thể đặc hiệu được phát hiện trong
10% số cá nhận kháng nguyên +adjuvant (Ag-MON), nhưng không thấy xuất hiện ở cá
nhận chỉ mỗi kháng nguyên (Ag). Sau khi tiêm nhắc lại, tỷ lệ phần trăm cá dương tính
tăng ở nhóm được tiêm chủng (70% ở nhóm Ag, 60% ở nhóm Ag-MON), ngoài ra ở
những mẫu thu được sau khi cảm nhiễm cũng dươg tính.
Sự khác biệt đáng kể mang tính thống kê giữa các nhóm đã được phát hiện ở các
mẫu thu được sau khi tiêm nhắc lại và sau khi cảm nhiễm, mức kháng thể ở nhóm Ag
và Ag-MON tăng cao hơn so với nhóm CTRL và MON. Ở các nhóm đã tiêm chủng,
mức Ab-Tri tăng cùng với thời gian tiến hành thử nghiệm, chủ yếu là sau khi cảm
nhiễm, sự khác biệt đáng kể mang tính thống kê giữa các nhóm đã được ghi nhận
[16]
.
MON được dùng ở những nghiên cứu hiện nay, đã được đánh giá ở những mẫu động
vật khác nhau, cũng như ở cá. Một vài trường hợp cho thấy sự tương quan tốt giữa
mức kháng thể và sự bảo vệ; và những tác dụng phụ cũng đã được so sánh với các
chất bổ trợ khác. ở Plecoglossus altivelis, thời gian tồn tại của MON được báo cáo là 4
đến 8 tuần, mặc dù chất bổ trợ được dùng trong trường hợp này.
[17]
Ở nghiên cứu này,
16

PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
 2.1 Đối tượng nghiên cứu: cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch)
2.2 Thời gian thực hiện: Từ ngày 21/02/2011 đến ngày 19/6/2011
2.3 Địa điểm thực hiện:
- Thí nghiệm được bố trí tại Trung tâm nghiên cứu Giống và Dịch bệnh
Thủy sản, Trường ĐH Nha Trang
- Phân tích mẫu tại Phòng thí nghiệm, Bộ môn Bệnh học Thủy sản, Khoa
NTTS, Trường ĐH Nha Trang
2.4 Mục tiêu của đề tài:
Xác định một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (Lates calcarifer,
Bloch) sau khi chủng ngừa nhắc lại vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt, làm cơ sở
khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo để tìm được vaccine phòng bệnh
Streptococcosis ở cá chẽm khi nuôi thương phẩm.


Ranh, Khánh Hòa, được vận chuyển sống (có sục khí) đến Trung tâm nghiên cứu
Giống và Dịch bệnh Thủy sản. Sau đó, cá được giữ trong các bể composite, với hệ
thống sục khí. Số lượng cá được dùng cho toàn bộ nghiên cứu khoảng 130 con cá.
Cá được nuôi thuần ở 27
0
C, khoảng 2 tuần.
Hình 2.1 : Sơ đồ khối của đề tài
Tìm hiểu một số đáp ứng miễn dịch đặc hiệu của cá chẽm (Lates calcarifer, Bloch)
sau khi tiêm chủng vi khuẩn Streptococcus iniae đã được bất hoạt bằng formalin
Tiêm nh
ắc lại
vi khuẩn
S. iniae bất hoạt

Tiêm nh
ắc lại
vi
khuẩn
S. iniae bất hoạt +
incomplete adjuvantTiêm PBS

Bơm nh
ắc lại
vi
khuẩn
S. iniae bất hoạt +
incomplete adjuvant

ào

Huyết
thanh

18

Nghiên cứu bao gồm hai thí nghiệm
* Thí nghiệm 1: 6 nghiệm thức
- Nghiệm thức 1: mẫu cá tiêm vi khuẩn Streptococcus iniae bất hoạt
- Nghiệm thức 2: mẫu cá tiêm vi khuẩn S. iniae bất hoạt + incomplete adjuvant
- Nghiệm thức 3: mẫu cá tiêm PBS
- Nghiệm thức 4: mẫu cá bơm vi khuẩn S. iniae bất hoạt
- Nghiệm thức 5: mẫu cá bơm vi khuẩn S. iniae bất hoạt + incomplete adjuvant
- Nghiệm thức 6: mẫu cá bơm PBS
* Thí nghiệm 2: mẫu cá được tiêm nhắc lại vi khuẩn bất hoạt, 28 ngày sau liều tiêm
đầu tiên.
Cá được tiêm vi khuẩn S. iniae bất hoạt bằng formalin 0,5% và thu mẫu tiền thận
để phân tích hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào sau mỗi 12h cho đến 96h. Mỗi
lần thu 3 con cá ở mỗi nghiệm thức. Trong tất cả các nghiệm thức thí nghiệm, tiến
hành thay nước các bể hàng ngày và cho cá ăn 2 lần/ ngày với cùng một chế độ ăn
trong suốt thời gian nghiên cứu. Không có sự khác biệt đáng kể về kích thước cá
giữa các nghiệm thức thí nghiệm.
2.5.3 Chuẩn bị kháng nguyên
Vi khuẩn Streptococcus được nuôi tăng sinh khối trong 300 ml môi trường
TSA ở 27
0
C trong 24h. Sau đó, tiến hành ly tâm ở 400g. Bỏ phần dịch nổi, giữ lại
bacteria pellet. Rửa 2 lần với PBS (phosphate buffered saline, pH 7.4). Cuối cùng
giữ vi khuẩn trong PBS, thêm vào 0,5 % formalin để làm bất hoạt vi khuẩn. Pha 2.5.6 Phân lập đại thực bào và hoạt tính thực bào
2.5.6.1 Phân lập đại thực bào từ thận
Vật liệu:
PBS 380, pH 7,3 (1 viên/lít)
Leibovitch medium (L-15; Sigma)
Huyết thanh
Falcon có lưới lọc cỡ 100uL
Percoll (Percoll 1,06 và Percoll)
Máy ly tâm
FPS (Fetal calf serum)
Trypan blue
Haemocytometer

Hình 2.2 Máy phân tích Lysozyme

Hình 2.3 Máy ly tâm
20

Cách tiến hành:
Đập chết cá. Rồi mổ lấy tiền thận đặt vào ống có chứa 500 µl L-15 chứa 2%FCS. Sau
đó, đặt mẫu thận trên đá lạnh. Tiếp theo, ép nhẹ mô thận qua falcon 100µm trong quá
trình ép cho thêm 3 lần L-15 chứa 2%FCS, mỗi lần 500µl (tổng cộng cho thêm 1,5ml)
Phương pháp ly tâm
Cho 4ml Percoll 1,075 vào đáy ống ly tâm. Tiếp theo, dùng pipette Pasteur nhẹ
nhàng cho 3ml Percoll 1,060 lên phía trên. Rồi tiếp tục dùng Pipette Pasteur cho 2ml
mẫu tiền thận đã được chuẩn bị ở trên vào trên cùng của ống. Sau đó, ly tâm trong 35’


21

Cách tiến hành:
Cho 50µl đại thực bào ủ với 100ul tế bào nấm đã nhuộm bằng thuốc nhuộm
Congo vào giếng có nuôi đại thực bào sau khi đã được phân tách sự kết dính bằng
Tween 20, ủ ở 22
o
C trong 2h sau đó đếm dưới độ phóng đại 400 lần.
2.5.7 Xác định hiệu giá kháng thể sau khi tiêm nhắc lại vi khuẩn đã bất hoạt
Vật liệu: - Đĩa 96 giếng
- Micropipet
- Dung dịch PBS
Cách tiến hành:
Pha loãng mẫu huyết thanh cần kiểm tra bằng dung dịch PBS theo cấp số chia là
2 trên 1 hàng của đĩa 96 giếng. Trong đó giếng đầu chứa 100 µL huyết thanh. Các
giếng sau chứa lượng huyết thanh lần lượt giảm còn 50, 25, 12,5 µL và bổ sung PBS
cho đủ 100 µL. Tiếp theo, cho 50 µL dịch huyền phù vi khuẩn S. iniae vào tất cả các
giếng. Lắc nhẹ và quan sát sự kết tủa trong các giếng.
2.5.8 Xử lý số liệu và phân tích thống kê
Số liệu thu được từ nghiên cứu được xử lý thống kê bằng phần mềm SPSS và
Excell. Các giá trị trung bình được so sánh theo phương pháp phân tích phương sai
một yếu tố (one-way ANOVA). So sánh sự khác nhau giữa các giá trị trung bình sau
phân tích phương sai (post hoc test) theo kiểm định Duncan với độ tin cậy 95%. Và so
sánh sự khác nhau giữa 2 giá trị trung bình theo phương pháp giới hạn sai khác nhỏ
nhất (LSD) với độ tin cậy 95%.


p<0.05). Trong đó, Lysozyme đạt giá trị cao nhất tại thời điểm 96h sau khi tiêm
liều nhắc, 19.27 (µg/ml). Tiếp theo, trong nghiệm thức tiêm vaccine: nồng độ
Lysozyme cũng có xu hướng tăng liên tục sau khi tiêm nhắc lại vi khuẩn bất hoạt.
Từ 5.92 (µg/ml) ở thời điểm 0h sau khi tiêm lên 20.02 (µg/ml) tại thời điểm 96h
(p<0.05).
23

Nồng độ enzyme Lysozyme trong huyết thanh cá chẽm (µg/ml) Nghiệm thức đối chứng Nghiệm thức vaccine
0h 6.38
a
±1.57 5.92
a
±2.51
12h 9.56
ab
±1.42 8.72
ab
±2.18
24h 9.42
ab
±1.84 9.28
ab
±2.34
36h 10.2

d
±1.73

Bảng 3.1 Nồng độ enzyme Lysozyme trong huyết thanh cá chẽm ở các nghiệm thức
thí nghiệm sau khi tiêm nhắc lại vi khuẩn Streptococcus bất hoạt.
Giá trị trung bình ± Độ lệch chuẩn. Ký tự mũ ở cùng cột khác nhau chỉ sự sai khác có
ý nghĩa (p<0,05) với kiểm định Duncan.
Từ kết quả thu được, có thể thấy nồng độ enzyme Lysozyme trong huyết thanh cá
chẽm có xu hướng tăng liên tục sau khi tiêm vaccine. Enzyme Lysozyme đóng vai trò
quan trọng trong hệ thống miễn dịch không đặc hiệu, còn ở hệ thống miễn dịch đặc
hiệu thì có lẽ vai trò của nó không được thể hiện rõ lắm. Phải nói Lysozyme là một
enzyme quan trọng trong việc tiêu diệt vi khuẩn (phân giải vỏ bọc của vách tế bào vi
khuẩn), được sản sinh bởi bạch cầu, đặc biệt là bạch cầu đơn nhân, đại thực bào và
bạch cầu trung tính. Bên cạnh đó, Lysozyme còn có tác dụng củng cố hệ thống miễn
dịch thể dịch, đồng thời tham gia vào các phản ứng kháng viêm do có tác động kháng
histamine. Kết quả có được về nồng độ Lysozyme trong huyết thanh cá chẽm sau khi
24

tiêm vi khuẩn Streptococcus đã bất hoạt cũng tương tự như kết quả trong nghiên cứu
của Crosbie và Nowak (2004), khi tiêm Vibrio harveyi vào cá Chẽm: không có sự thay
đổi đáng kể về hoạt tính Lysozyme
[13]
.
3.2 Xác định sự thay đổi về hoạt tính thực bào và chỉ số thực bào của đại thực bào
3.2.1 Hoạt tính thực bào
Nhìn chung, hoạt tính thực bào ở cá chẽm không có sự chênh lệch đáng kể
sau khi tiêm nhắc lại vi khuẩn (so sánh giữa nghiệm thức tiêm vaccine và nghiệm thức
đối chứng) (Hình 3.2).
0
10

0.5
1
1.5
2
2.5
3
3.5
0 12 24 36 48 60 72 84 96
Thời điểm sau khi tiêm vaccine (h)
Chỉ số thực bào
Nghiệm thức đối chứng
Nghiệm thức tiêm vaccineHình 3.4 Chỉ số thực bào ở cá chẽm trong các nghiệm thức thí nghiệm sau khi tiêm
nhắc lại vi khuẩn Streptococcus bất hoạt. Xét riêng nghiệm thức đối chứng: chỉ số thực
bào tăng từ 1.95 tại thời điểm 0h sau khi tiêm lên 3.25 tại thời điểm 12h sau khi tiêm.
Sau đó, giảm dần ở các thời điểm còn lại của nghiên cứu (p<0.05). Chỉ số thực bào
trong nghiệm thức đối chứng ở thời điểm 12h đạt giá trị cao nhất, sau đó giảm nhẹ ở
thời điểm 24 nhưng điều này không có ý nghĩa (p>0.05). Trong nghiệm thức tiêm
vaccine cũng có kết quả tương tự vậy. Sự chênh lệch về chỉ số thực bào giữa thời điểm
Hình 3.3 Đại thực bào bắt nấm
men, độ phóng đại 400x
Mũi tên đen chỉ đại thực bào
Mũi tên trắng chỉ nấm men