BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
------------------------------------
NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYM
α – AMYLASE TỪ TRỰC KHUẨN CỎ KHÔ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh – 2009
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH
------------------------------------
NGUYỄN THỊ HOÀNG HẢI
trong y học và nghiên cứu,… là nhờ khả năng sinh các loại enzym thuỷ phân của
các chủng vi sinh vật này.
Enzym là những chất xúc tác sinh học, ngoài những tính chất của một chất
xúc tác nó còn có những tính chất ưu việt hơn như: có hiệu suất xúc tác rất cao ở
điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường, có tính đặc hiệu cao. Các tính chất này
vẫn được bảo tồn khi tách enzym ra khỏi hệ thống sống, hoạt động trong điều kiện
invitro. Vì vậy, enzym ngày càng được sử dụng rộng rãi trong thực tế, với quy mô
ngày càng lớn, dẫn đến việc hình thành và phát triển ngành công nghệ sản xuất
enzym. Việc sử dụng enzym trong thực tế không chỉ có ý nghóa về kinh tế mà còn
giải quyết nhiều vấn đề xã hội, các vấn đề bức xúc về môi trường.
Trước kia, enzym thường được thu nhận từ tế bào thực vật hoặc động vật
(chẳng hạn amylase được lấy từ hạt nảy mầm, protease từ nhựa đu đủ, dạ
dày,…). Tuy nhiên quá trình sinh tổng hợp enzym ở động vật và thực vật gắn liền
với sự trao đổi chất và nhu cầu của tế bào. Ngoài ra, người ta còn phải phá bỏ
các tổ chức tế bào để tách chiết và thu nhận enzym. Như vậy, việc dùng tế bào
động vật, thực vật làm nguồn nguyên liệu để thu nhận enzym là khá hạn chế,
thiếu tính kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu về số lượng enzym cần thiết
cho sản xuất.
Trong khi đó, ở vi sinh vật hầu như chứa đầy đủ các loại enzym và việc sử
dụng nguồn enzym từ vi sinh vật mang lại lợi ích lớn hơn, cụ thể như nguồn
nguyên liệu dùng để nuôi cấy vi sinh vật thường rẻ tiền hơn vì chúng thường là
phế phụ phẩm công nông nghiệp (như cám, trấu, bã mía, bã khoai mỳ,…) hoặc
nguồn nguyên liệu tự nhiên như dầu mỏ, khí đốt,… Mặt khác, điều kiện nuôi cấy
dễ dàng, và enzym có hoạt tính cao hơn. Vì thế, khoảng 50 năm gần đây các chế
phẩm enzym từ vi sinh vật đã dần thay thế các enzym có nguồn gốc thực vật,
động vật.
Chương I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giống vi khuẩn Bacillus [5], [16], [38], [39]
Bacillus là vi khuẩn Gram dương, hình que có kích thước khác nhau (0,5 –
2,5) ×(1,2 - 10) μm. Chúng phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong đất, nước,
không khí.
Là vi khuẩn dò dưỡng hoá năng, thu năng lượng nhờ sự oxi hoá các hợp chất
hữu cơ, có chùm tiên mao giúp chúng có khả năng di động, sống hiếu khí hoặc
hiếu khí tuỳ tiện.
Bacillus có khả năng sinh bào tử, bào tử được hình thành khi tế bào đã trải
qua giai đoạn phát triển mạnh nhất, hoặc khi thiếu chất dinh dưỡng. Mỗi tế bào
bệnh cho côn trùng như Bacillus thuringiensis, B. poplliae, B. lentimorbus, B.
cereus, B. anthracis (trong đó B. cereus và B. anthracis có thể gây bệnh cho
người)…đa số còn lại trong tự nhiên là có ích.
Bacillus có khả năng sinh enzym ngoại bào: α-amylase, protease kiềm,
cellulase… và các enzym này được ứng dụng rất nhiều trong công nghiệp, bảo vệ
môi trường, nông nghiệp…
Sau đây là một số loài Bacillus thường gặp trong tự nhiên
1.1.1 Bacillus subtilis
Bacillus subtilis được phát hiện và đặt tên vào năm 1872, nó phân bố phổ
biến trong đất và đặc biệt là ở cỏ khô nên Bacillus subtilis được gọi là trực
khuẩn cỏ khô.
Là những vi khuẩn hình que, ngắn, nhỏ, kích thước (3 -5) × 0,6 μm, nhiều
khi tế bào nối lại với nhau thành chuỗi dài ngắn khác nhau hoặc tế bào đứng
riêng rẽ.
Khuẩn lạc khô, không màu hoặc màu xám nhạt, hơi nhăn hoặc tạo ra lớp
màng mòn lan trên bề mặt thạch, có mép nhăn bám chặt vào môi trường thạch.
Nhiệt độ thích hợp cho Bacillus subtilis sinh trưởng là 30
0
C – 50
0
C, thường
nuôi cấy ở 37
0
C.
Bào tử hình bầu dục, kích thước 0,6 – 0,9 μm, phân bố lệch tâm, gần tâm
nhưng không chính tâm. Bào tử có thể sống vài năm đến vài chục năm. Đã có
những chứng cứ về việc duy trì sức sống bào tử B. subtilis trong 200-300 năm.
Vi khuẩn B. subtilis có màng nhày (giác mạc) giúp vi khuẩn có khả năng
nitơ và các sản phẩm giàu đường (bánh kẹo, hoa quả). Ngoài ra, chúng còn sinh
ra một loại hợp chất có hoạt tính kháng một số vi khuẩn khác gọi là bacterioxin,
ở Bacillus subtilis gọi là subtilin.
1.1.3. Bacillus cereus
Vi khuẩn này có mối quan hệ gần gũi với Bacillus anthracis, B. mycoides,
B. thuringiensis. Bào tử của chúng hình bầu dục, kích thước 0,9 × (1,2 – 1,5) μm,
nằm lệch tâm, phát tán khắp nơi, trong đất, trong không khí…Chúng thường sinh
sôi nảy nở trên thực phẩm như cơm và có thể sinh ra độc tố làm cho thực phẩm
hư hỏng và gây ngộ độc thực phẩm.
Tế bào của B. cereus dày, kích thước (1 -1,5) × (3 – 5) μm có khi dài hơn,
đứng riêng rẽ hoặc xếp thành chuỗi.
Khuẩn lạc của B. cereus phẳng, hơi lõm, bề mặt hơi xù xì (dạng bột, hoặc
dạng hạt nhỏ) trắng đục, mép lồi lõm.
1.1.4. Bacillus megaterium
Megaterium có nghóa là “con thú lớn”, tế bào của nó khá lớn khoảng gấp
hơn 2 lần tế bào của Bacillus subtilis, kích thước (1,2 – 1,5) × (3 – 12) μm. Ở các
ống nuôi già thì tế bào ngắn hơn, tròn hơn, đôi khi hình thoi với đầu hẹp lại. Tế
bào chứa nhiều hạt nhỏ và chất dự trữ (hạt mỡ, glycogen).
Bào tử lớn, hình ovan hay bầu dục, kích thước 1,5 × (0,7 – 1) μm, chúng
nằm lệch tâm thường theo chiều ngang hoặc chiều xiên của tế bào.
Khuẩn lạc tròn đều, lồi nhẵn nhưng thường có vòng viền quanh khuẩn lạc
hoặc các vòng đồng tâm trên bề mặt, không thuỳ, không nếp, mép tròn đều hay
lượn sóng, màu trắng sữa hay đục, có khi có màu nâu nhạt.
Sinh trưởng trên môi trường dinh dưỡng đơn giản không cần thêm bất kỳ
yếu tố dinh dưỡng nào khác.
1.1.5. Bacillus pumilus
Tế bào dày (1,0–1,2) × (3 –7) μm, đứng riêng rẽ hoặc xếp thành đôi. Bào
tử hình trụ hay hình kéo dài, kích thước 1,0 × (1,5–2) μm, nằm giữa tế bào. Khi
hình thành bào tử tế bào phồng lên một chút trông giống như dạng Clostridium.
Khuẩn lạc của B. aslersporus nhỏ, màu trắng hay màu lục nhạt, phẳng,
mềm, nhày, đồng chất.
1.2. Khái quát chung về enzym [1], [4], [15], [23], [49].
Sinh vật được xem như là một hệ thống mở có liên quan chặt chẽ đến quá
trình trao đổi chất trong tế bào của cơ thể, và giữa cơ thể với môi trường ngoài.
Quá trình trao đổi chất của sinh vật là biểu hiện sinh động nhất của sự sống. Khi
cơ thể không còn khả năng trao đổi chất thì cơ thể sẽ chết. Quá trình trao đổi
chất liên tục được xảy ra giữa trong và ngoài tế bào, tạo nên sự biến đổi liên tục
của vật chất trong thiên nhiên. Các phản ứng sinh học xảy ra thường xuyên
không chỉ ở trong tế bào sinh vật mà ở cả ngoài môi trường bao quanh tế bào.
Các phản ứng sinh học này được xúc tác bởi một loại protein đặc biệt được gọi
là enzym. Các enzym tham gia phản ứng trong tế bào gọi là enzym nội bào, còn
các enzym thuỷ phân có chức năng phân huỷ chất hữu cơ ngoài tế bào thành
chất dinh dưỡng có thể hấp thụ vào tế bào gọi là enzym ngoại bào. Cả hai loại
enzym này đều được tổng hợp trong tế bào.
1.2.1. Enzym cảm ứng.
Những enzym được tạo thành từ VSV không phải chỉ phụ thuộc vào loại
VSV mà còn phụ thuộc thành phần môi trường nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy.
Hiện tượng trên là do trong môi trường có chất khó đồng hoá, VSV tiết vào môi
trường một hoặc các enzym tương ứng để tạo thành chất có thể đồng hoá được.
Các enzym được tiết ra như thế được gọi là enzym cảm ứng và các cơ chất
kích thích quá trình tổng hợp enzym cảm ứng gọi là chất cảm ứng.
1.2.2. Bản chất sinh học của enzym.
thì các enzym không hoạt động, nên gọi chúng là chất cộng tác (cofactor). Các
chất hữu cơ đặc hiệu này có thể gắn rất chặt với phần protein bằng liên kết đồng
hoá trò được gọi là nhóm phụ (prosthetic), hoặc cũng có thể gắn lỏng lẻo và dễ
dàng tách chúng khỏi protein được gọi là coenzym.
Apoenzym quyết đònh tính đặc hiệu cao và làm tăng hoạt độ xúc tác của
enzym. Còn những chất hữu cơ đặc hiệu quyết đònh kiểu phản ứng, trực tiếp
tham gia phản ứng và làm tăng độ bền của apoenzym đối với các yếu tố gây
biến tính.
Ngoài ra, trong thành phần của enzym còn có sự hiện diện một số kim
loại, các kim loại này thường rất dễ tách ra khỏi enzym. Trong trường hợp
enzym mất kim loại chúng sẽ mất hoạt tính. Khi đưa trở lại các kim loại tương
ứng vào enzym thì hoạt tính của enzym lại được khôi phục, tính chất này mang
tính thuận nghòch. Vai trò của kim loại trong hoạt động của enzym vẫn chưa thực
sự làm sáng tỏ. Tuy nhiên các nhà khoa học cho rằng có thể kim loại đóng vai
trò liên kết giữa enzym và cơ chất, giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực
tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử như vai trò của sắt trong cytochrome và
peroxydase.
1.2.4. Tính chất hoá học của enzym.
Enzym có thể hoà tan trong nước, trong dung dòch muối loãng tạo thành
các dung dòch keo ưa nước, nhưng enzym không tan trong dung môi không phân
cực. Khi enzym được hoà tan vào nước, các phân tử nước lưỡng cực sẽ kết hợp
với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzym tạo
thành lớp vỏ hydrat. Lượng nước hydrat này khá lớn và có vai trò quan trọng làm
môi trường cho các phản ứng sinh hoá.
Enzym bò kết tủa bởi các tác nhân gây tủa protein như muối trung tính bão
hoà (NaCl, (NH
rất nhanh, đòi hỏi một ít năng lượng.
• Giai đoạn thứ hai: cơ chất bò thay đổi cấu hình không gian và mức độ
bền vững của các liên kết. Kết qủa là các liên kết trong cơ chất bò phá vỡ.
• Giai đoạn thứ ba: đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành
và tách khỏi enzym. Enzym được giải phóng dưới dạng tự do như ban đầu.
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzym được tóm tắt như sau:
E + S ↔ ES → E + P
Trong đó, E: enzym (enzyme); S: cơ chất (substrate); P: sản phẩm
(products).
1.2.7. Các yếu tố ảnh hưởng đến vận tốc phản ứng enzym.
• Nồng độ cơ chất
Khi phân giải một loại cơ chất nào đó, phần cơ chế tác dụng của enzym
cho thấy phản ứng khi có enzym tham gia sẽ trải qua ba giai đoạn:
Giai đoạn đầu nếu nồng độ cơ chất thấp thì vận tốc phản ứng (V) phụ
thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất.
Giai đoạn kế tiếp nếu V xấp xỉ giá trò cực đại thì V không phụ thuộc vào
cơ chất.
Giai đoạn tiếp theo nếu nồng độ cơ chất tiếp tục tăng cao thì hầu như V
không tăng nữa mà đạt giá trò gần với V
max
vì các enzym đã bão hoà cơ chất.
• Nồng độ enzym
Nếu thừa cơ chất, V phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ enzym: V = k[E]
Trong đó: V: vận tốc phản ứng
[E]: nồng độ enzym
k: hằng số vận tốc phản ứng.
hưởng đến độ bền của enzym. Đa số enzym bền ở pH = 5-9, độ bền của enzym
tăng nếu có mặt cơ chất, coenzym, hoặc Ca
2+
. Mỗi enzym có một giá trò pH tối
ưu (pH
opt
) tại đó V đạt V
max
.
Nhiều enzym hoạt động rất mạnh ở pH trung tính, cũng có enzym hoạt
động ở pH acid hoặc pH kiềm.
• Các chất kìm hãm (I)
Các chất kìm hãm hoạt động của enzym làm giảm hoạt tính enzym nhưng
lại không bò enzym làm thay đổi tính chất hoá học, cấu tạo hoá học và tính chất
vật lý của chúng. Các chất này bao gồm các ion, các phân tử vô cơ, các chất hữu
cơ và cả protein. Các chất kìm hãm có ý nghóa rất lớn trong điều khiển các qúa
trình trao đổi chất ở tế bào sinh vật.
Cơ chế kìm hãm của các chất kìm hãm có thể thuận nghòch hoặc không
thuận nghòch, đặc hiệu hoặc không đặc hiệu. Sau đây chúng ta chỉ xét các chất
kìm hãm thuận nghòch. Tuỳ thuộc vào bản chất tạo phức EI, bản chất của chất
kìm hãm người ta chia thành các loại chất kìm hãm sau:
Các chất kìm hãm cạnh tranh
Các chất này có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất vì thế chúng
có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzym. Kết quả là trung tâm
hoạt động của enzym bò chất kìm hãm chiếm mất, do đó cơ chất mất một phần
khả năng tương tác làm tốc độ phản ứng giảm.
Kìm hãm do thừa cơ chất
Khi ES được tạo thành có thể có một cơ chất gắn với ES làm chúng không
thể chuyển hoá tiếp được: ES + S ↔ ESS
• Chất hoạt hoá
Là những chất có tác dụng làm tăng hoạt tính enzym. Chất hoạt hoá enzym
có thể là anion, các ion kim loại, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp có nhiệm
vụ chuyển nhóm hydrogen hoặc phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzym
hoặc phục hồi các nhóm chức năng trong trung tâm hoạt động của enzym.
Các chất hoạt hoá chỉ có tác dụng hoạt hoá ở một nồng độ nhất đònh, vượt
quá nồng độ này chúng sẽ gây ức chế hoạt động của enzym.
1.3. Hệ enzym amylase [4], [8], [13], [16], [27], [44]
Amylase thuộc hệ enzym thuỷ phân (hydrolase) chúng thuỷ phân các liên
kết α-1,4 và α-1,6 glucoside của tinh bột. Từ xưa chủ yếu người ta thu nhận
amylase từ malt, nhưng ngày nay việc thu nhận chủ yếu từ nuôi cấy VSV.
Cũng như nhiều VSV khác, vi khuẩn Bacillus tạo ra rất nhiều enzym
ngoại bào như: amylase, protease, celullase,... Trong đó amylase rất quan trọng
vì chúng được sử dụng phổ biến và mang lại nhiều lợi ích cho nền sản xuất công
nghiệp. Các loại amylase thường gặp khi nuôi cấy VSV gồm: α – amylase, β-
amylase và γ-amylase.
1.3.1. Giới thiệu về enzym α – amylase.
• Cấu tạo:
α-amylase có cấu tạo gồm 3 tiểu đơn vò:
* A là tiểu đơn vò lõi có cấu trúc đặc trưng helix (α/β) 8 barel.
* Tiểu đơn vò C được nối với A có cấu trúc tám đoạn β-sheet song song.
* Tiểu đơn vò B gồm hai đoạn β-sheet được lồng vào giữa đoạn β-sheet thứ
ba và α-helix thứ ba của tiểu đơn vò A. Tiểu đơn vò B quyết đònh độ bền hoạt độ
pH tối thích cho hoạt động của α-amylase từ nấm sợi là 4,5-4,8 và của vi
khuẩn là 5,8-6,0. Nhìn chung pH tối ưu nằm trong khoảng acid yếu 4,8-6,9.
pH<4,0 α-amylase của vi khuẩn bò vô hoạt hoàn toàn, tuy nhiên một số α-
amylase chòu acid cao như của Bacillus acidocaldarious (pH tối thích là 3,5) và
chòu kiềm mạnh như B. licheniformis (pH tối thích là 9,0).
- Nhiệt độ
Nhìn chung α-amylase bền nhiệt hơn so với các amylase khác, đặc tính
này được cho rằng có liên quan đến hàm lượng ion canxi trong phân tử (α-
amylase của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa canxi nhiều hơn α - amylase của nấm
mốc 3 - 4 lần). α - amylase của vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn cả.
Bảng 1.1. Độ bền nhiệt của α-amylase từ các nguồn khác nhau
(theo Miller, Johson và Palmer)
Hoạt độ α-amylase, % so với hoạt độ ban đầu
Nhiệt độ (
o
C)
của nấm sợi của malt của vi khuẩn
65
70
75
80
85
90
95
100
52
3
-
-
-
1.3.2 Nguồn thu nhận enzym amylase.
Enzym có thể được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như động vật, thực
vật, vi sinh vật (VSV). Tuy nhiên việc khai thác enzym từ thực vật, động vật
thường gặp khó khăn vì nguồn nguyên liệu hạn chế, hiệu suất thấp nên giá
thành cao. Hiện nay phần lớn enzym đều được thu nhận từ vi sinh vật, vì có
những điểm nổi bật sau:
- VSV có tốc độ sinh trưởng, phát triển và sinh sản cực kỳ nhanh, từ đó
tổng hợp enzym với cường độ rất mạnh, nên trong một thời gian ngắn có thể thu
được một lượng enzym rất lớn.
- Hệ enzym của VSV rất phong phú, từ các chủng VSV khác nhau ta có
thể thu nhận được nhiều loại enzym khác nhau, trong đó có những enzym
chuyên biệt chỉ có ở VSV mà hầu như không thấy ở động vật, thực vật.
- Môi trường nuôi cấy VSV đơn giản, rẻ tiền, thường là những phế phụ
liệu của ngành công nghiệp nên giá thành enzym rẻ hơn và dễ áp dụng cho các
cơ sở sản xuất.
- VSV chòu ảnh hưởng rất lớn bởi thành phần dinh dưỡng, các tác động
của môi trường, do đó người ta có thể thay đổi thành phần dinh dưỡng hoặc các
yếu tố tác động để điều khiển quá trình tổng hợp enzym theo yêu cầu.
- Việc cải tạo giống VSV để tạo ra các chủng VSV có khả năng tổng hợp
ra các loại enzym theo ý muốn có thể thực hiện được và chỉ trong thời gian ngắn,
vì khả năng thích ứng với môi trường của VSV là rất mạnh.
- Sản xuất enzym từ VSV có thể thực hiện trên qui mô công nghiệp, tự
động hóa và cơ giới hoá.
Người ta đã biết nhiều loại VSV có khả năng tổng hợp amylase, trong đó
được sử dụng nhiều hơn cả là nấm sợi, giả nấm men và vi khuẩn, còn xạ khuẩn
thì ít hơn.
trọng như vậy mà nhiều nước trên thế giới đã đưa công tác này lên tầm cỡ quốc
gia và đã thành lập các trung tâm, chi nhánh giữ giống gọi là bảo tàng VSV.
Nguồn dinh dưỡng
Trong môi trường nuôi cấy VSV cần phải đảm bảo đầy đủ, thích hợp các
thành phần và tỉ lệ các chất dinh dưỡng cho từng VSV cụ thể.
• Ảnh hưởng nguồn cacbon
Thành phần và hàm lượng cacbon có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp
enzym. Theo số liệu của Grigorev về ảnh hưởng của nguồn cacbon tới cường độ
sinh tổng hợp amylase có thể xếp theo thứ tự sau:
Với α–amylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > lactozơ > glucozơ >
sacarozơ > galactozơ > manozơ > arabinozơ.
Với glucoamylase: tinh bột > dextrin > maltozơ > sacarozơ > glucozơ >
lactozơ > lactozơ > arabinozơ > galactozơ > manozơ.
Nồng độ nguồn cacbon cũng ảnh hưởng lớn đến sự tạo thành enzym. Mỗi
loài VSV chỉ có thể thích hợp với một nồng độ hydratcacbon nhất đònh.
• Ảnh hưởng nguồn nitơ
Nitơ cần cho sự hình thành các axit amin để cấu tạo nên các protein cấu
trúc cho các phân tử của enzym. Nguồn nitơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy có
thể là nitơ vô cơ hoặc nitơ hữu cơ. Nguồn nitơ thường dùng là nitrat amon, sunfat
amon, urê,… Các hợp chất hữu cơ là những nguyên liệu giàu đạm như cao ngô,
bột đậu tương, khô lạc, khô đậu,… Ngoài ra một số axit amin, bazơ purin,
pyrimidin cũng thường được bổ sung vào môi trường nuôi cấy VSV.
Ngoài hai nhân tố cơ bản trên, trong môi trường dinh dưỡng của VSV sinh
enzym nói chung cần phải có mặt nhiều nguyên tố khoáng ở dạng muối magiê,
photpho, kali,…và các nguyên tố vi lượng. Ví dụ ion Mg
2+
• Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy
Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng lớn đến sự hình thành enzym. Đối với đa số
nấm mốc khi nuôi ở môi trường xốp sự tạo thành amylase cực đại thường kết
thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh bào tử, thời gian kết thúc sự tạo thành amylase
thường từ 30-42 giờ. Còn đối với vi khuẩn sự tạo thành amylase tốt nhất từ
khoảng 40-50 giờ. Còn nuôi cấy chìm sinh trưởng của chủng giống đạt cực đại
tới pha ổn đònh trước, khoảng từ 5 đến 8 giờ sau thì hoạt độ enzym đạt cực đại.
1.3.4. Tách chiết enzym từ các nguồn nguyên liệu [4], [10], [12], [14]
- Đối với enzym ngoại bào: người ta tách sinh khối và các chất cặn bã khỏi
canh trường bằng phương pháp lọc hoặc ly tâm. Sử dụng thêm các chất trợ lọc
(diatomite, than hoạt tính…) hoặc các chất tạo kết tủa để các chất này dễ dàng bò
lắng cặn kéo theo sinh khối giúp quá trình lọc dễ dàng hơn.
- Đối với enzym nội bào: để thu nhận enzym cần phải phá vỡ tế bào bằng
các phương pháp sau:
▪ Phương pháp vật lý
Nghiền tế bào trong máy đồng hoá hoặc nghiền với bột thuỷ tinh hay cát
trắng sạch trong cối sứ. Thay đổi nhiệt độ đột ngột hoặc tạo áp suất thẩm thấu
cao để phá vỡ thành tế bào.
▪ Phương pháp hoá học
Sử dụng acid để thuỷ phân thành tế bào. Tuy nhiên cho acid quá nhiều có
thể làm biến tính enzym. Hoặc có thể dùng kiềm, nhưng nếu enzym có tính acid
thì không dùng được.
▪ Phương pháp sinh học
Phương pháp sinh học được sử dụng nhiều nhất là phương pháp enzym.
Dùng các enzym tương ứng với các cơ chất có trong thành tế bào để thuỷ phân,
như vậy thành tế bào sẽ bò phá vỡ.
Sau khi phá vỡ tế bào, các enzym được tách chiết bằng các dung môi
tăng thể tích của bánh và tạo màu sắc, hương vò của bánh.
Ngày nay, nguồn enzym amylase và protease được sử dụng chủ yếu từ
nấm mốc Aspergillus oryzae, và A. awamori.
Copyright: Tài liệu đại học ©