LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu
của riêng tôi. Các số liệu và kết quả nêu trong luận án là
trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ
công trình nào khác.

Tác giả luận án Vương Bảo Thy
LỜI CẢM ƠN
Ngành công nghiệp enzyme phát triển ngày càng mạnh, mở ra những cơ hội và
thách thức lớn, đặc biệt là enzyme từ nguồn phế liệu nội tạng ngành chế biến cá tra ở
nước ta. Trước hiện trạng đó, vấn đề nghiên cứu cấp thiết được đặt ra và sau không ít
những khó khăn, trở ngại nhưng với sự nỗ lực của bản thân cùng sự hỗ trợ của Thầy
Cô, gia đình, đồng nghiệp và bạn bè, luận án đã hoàn thành.
Tôi xin gửi lời tri ân sấu sắc đến Thầy, Cô hướng dẫn khoa học là TS. Trần Bích
Lam và GS.TSKH.VS. Lưu Duẩn – những người đã tận tình hướng dẫn, định hướng và
hỗ trợ tôi rất nhiều từ những ngày đầu tiên thực hiện đề tài cho đến tận ngày hôm nay.
Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Cửu Long- nơi tôi
đang công tác giảng dạy- đã luôn tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình thực
hiện đề tài.
Tôi xin gửi lòng biết ơn đến quý Thầy, Cô trong Bộ môn Công nghệ thực phẩm,
Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM- Quý Thầy, Cô
trong Bộ môn Sinh hóa, phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM- Quý Thầy, Cô Bộ môn

U/g cht khụ, protease 84,28 U/g cht khụ v amylase 419,69 U/g cht khụ.
2- iu kin tt nht trớch ly enzyme tiờu húa t gan ty cỏ tra: t l nguyờn
liu/dung mụi 1/2(w/v) vi dung mụi trớch ly l dung dch m Tris-HCl
0,05N, pH8, nhit 5
0
C, thi gian 1 gi.
3- S dng phng phỏp lc mng cú th thu nhn ch phm lipase t gan ty
cỏ tra theo qui trỡnh: ln lt lc dch trớch enzyme qua mng MF 1àm v
0,1àm, lc mng UF 10 kDa thu enzyme vi t l pha loóng dch enzyme
thụ 1/3, ỏp sut lc 6 psi, thi gian lc 120 phỳt. Hiu sut thu hi lipase sau
lc UF 90,6%, tinh sch 2,07 ln. Ch phm cú hot tớnh lipase: 22,22
U/ml, hot tớnh riờng lipase: 52,70 U/mg protein.
4- sn xut ch phm enzyme, tt nht l s dng phng phỏp kt ta bng
ethanol theo t l vi dch trớch enzyme l 3/1 (v/v). Ch phm cú hot tớnh
lipase: 587,85 U/g, hot tớnh riờng lipase: 16,91 U/mg protein, hot tớnh
protease: 49,26 U/g, hot tớnh riờng protease 1,42 U/mg protein. Hiu sut
thu nhn ch phm 8,3% so vi nguyờn liu ban u (w/w).
5- ó xut phng phỏp tinh sch protease v lipase t gan ty cỏ tra: t dch
trớch ly enzyme thụ, kt ta enzyme bng mui amoni sunfate 60% bóo hũa,
thẩm tích bằng màng cellophane 12 kDa loại muối. Dùng cột sắc ký trao đổi
ion DEAE-cellulose thu phân đoạn chứa hai enzyme protease và lipase. Tách
riêng protease và lipase qua sắc ký lọc gel Sephadex G-75.
Protease tinh sạch có hoạt tính riêng 28,59 U/mg protein, độ tinh sạch 22,41
lần, hiệu suất thu hồi 23,67%. Lipase tinh sạch có hoạt tính riêng 509,71
U/mg protein, độ tinh sạch 37,95 lần, hiệu suất thu hồi 40,08%.
6- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease từ gan tụy cá
tra: là một serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao của serine,
aspartic và glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 55
0
C, kích

max
= 0,063
mg/L.phút.
8- Chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng sản xuất
pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt tỷ lệ N
amin
/ N
tổng
lần lượt là
22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển
Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân các loại
protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có thể sử dụng
làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng chống suy dinh
dưỡng ở trẻ em.
Nghiên cứu đã đóng góp dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tuyến tụy cá tra
(Pangasius hypophthalmus) đồng thời góp phần giải quyết thực tế sản xuất của
ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá. Kết quả nghiên
cứu là đóng góp lý thuyết và thực tiễn cho ngành công nghiệp thủy sản của Việt
Nam.
I I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT IV
DANH MỤC BẢNG V
DANH MỤC HÌNH VI
MỞ ĐẦU 1
CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 4
1.1 Các enzym tiêu hóa từ nội tạng cá da trơn 4
1.1.1 Protease 4

3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra 46
3.1.2 Sự phân bố của lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng
47
3.2 Khảo sát quá trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô 51
3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly 51
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly 54
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly 56
3.3 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp lọc màng 59
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi và
độ tinh sạch lipase sau lọc UF 64
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase sau lọc UF 66
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase sau lọc UF 68
3.4 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phương pháp kết tủa 71
3.4.1 Kết tủa bằng amoni sunfate 71
3.4.2 Kết tủa bằng ethanol 74
3.4.3 Kết tủa bằng aceton 76
3.4.4 Kết tủa bằng isopropanol 78
3.4.5 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzym từ các tác nhân kết tủa
79
3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra 84
3.5.1 Thử nghiệm quá trình tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex
84
3.5.2 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose kết hợp sắc
ký lọc gel Sephadex 85
3.5.2.1 Tinh sạch protease bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose 85
3.5.2.2 Kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex -G75 hoặc Sephadex-G100 87
3.5.2.3 Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng protease 90


PHỤ LỤC
IV
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN

ck Chất khô
cknl Chất khô nguyên liệu
cp Chế phẩm
ĐTS Độ tinh sạch
EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid
HĐ Hoạt độ
HTR Hoạt độ riêng
HĐL Hoạt độ lipase
HĐRL Hoạt độ riêng lipase
HĐP Hoạt độ protease
HĐRP Hoạt độ riêng protease
HĐA Hoạt độ amylase
HĐRA Hoạt độ riêng amylase
HSTH Hiệu suất thu hồi
MF Micro filtration (vi lọc)
nl ướt Nguyên liệuhoạt độ ướt
nl khô Nguyên liệu khô
mg pr mg protein
S.A Amoni sunfate
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfat- Polyacryamide gel
THĐ Tổng hoạt độ
THĐL Tổng hoạt độ lipase
UF Ultra filtration (siêu lọc)
V Thể tích
v/v Tỷ lệ tính theo thể tích
w/v Tỷ lệ tính theo khối lượng/thể tích

Hình 1.1: Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng
trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) 5
Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) 8
Hình 1.3: Hình tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng 9
Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất 10
Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase 11
Hình 1.6: Phương pháp xác định tính đặc hiệu vị trí của enzyme lipase 13
Hình 1.7: Cá tra (Pangasius hypophthamus) 19
Hình 2.1: Nội tạng cá tra 32
Hình 3.1: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hàm lượng protein trích ly 50
Hình 3.2: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ protease 51
Hình 3.3: Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi đến hoạt độ lipase 51
Hình 3.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hàm lượng protein trích ly 53
Hình 3.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ protease 53
Hình 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly đến hoạt độ lipase 54
Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian đến hàm lượng protein trích ly 55
Hình 3.8: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ protease 56
Hình 3.9: Ảnh hưởng của thời gian trích ly đến hoạt độ lipase 56
Hình 3.10: Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng đến hiệu suất thu hồi lipase sau lọc MF 63
Hình 3.11: Ảnh hưởng của áp suất đến độ phân riêng protein trong dịch enzyme 65
Hình 3.12: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease 70
Hình 3.13: Ảnh hưởng của độ bảo hòa amoni sunfate đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase 71
Hình 3.14: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease 73
Hình 3.15: Ảnh hưởng của tỷ lệ ethanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase 73
Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease 75

Hình 3.38: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 99
Hình 3.39: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose
với dãy nồng độ NaCl 100
Hình 3.40: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAE-cellulose
với gradient nồng độ dung dịch NaCl 101
Hình 3.41: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100 102
Hình 3.42: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75 103
Hình 3.43: Kết quả điện di trên gel SDS- (PAGE) 105
Hình 3.44: Qui trình tinh sạch protease/ lipase gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme
106
Hình 3.45: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase 106
Hình 3.46: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian 107
VIII
Hình 3.47: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ lipase 108
Hình 3.48: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ lipase tinh sạch theo thời gian 109
Hình 3.49: Đồ thị Lineweaver- Burk của lipase tinh sạch trên cơ chất triolein 111
Hình 3.50: Ảnh hưởng của muối mật (NaTC) đến hoạt độ lipase tinh sạch 112
Hình 3.51: Ảnh hưởng của cơ chất đến hoạt độ lipase tinh sạch 113
Hình 3.52: Sự tương quan giữa hàm lượng nitơ amin và thời gian thủy phân 115
Hình 3.53: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme với Enzyplex trên
một số protein thực phẩm 117
Hình 3.54: So sánh khả năng thủy phân của chế phẩm enzyme so với Enzyplex đối
với một số loại dầu thực vật 117

1

MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cùng với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ enzyme trở thành ngành mũi nhọn
được phát triển nhanh trên thế giới. Trong đó, nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các

Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các enzyme tiêu
hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus).
Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn nội tạng cá
tra sẵn có để đưa vào ứng dụng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ quan nội
tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập trung vào enzyme
lipase và protease.
Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu đặc điểm phân bố của các enzyme
protease, lipase và amylase trong các cơ quan nội tạng; thu nhận, tinh sạch và xác
định tính chất của lipase và protease từ nội tạng của cá tra (Pangasius
hypophthalmus).
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên cứu thực
nghiệm hóa sinh học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và tổng hợp tài
liệu.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
1. Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra
2. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra
3. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra
4. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
5. Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa
3

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, phân tích
chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius

Ở động vật bậc cao các enzyme tiêu hóa của tuyến tụy (pancreatin) được tiết ra
từ các tế bào ngoại tiết của tuyến tụy, gồm chủ yếu là lipase, protease và amylase.
Đến nay, chỉ có enzyme tuyến tụy của lợn, bò được sản xuất dưới dạng chế phẩm để
đưa vào ứng dụng. Các dạng chế phẩm hỗn hợp đa enzyme rất phổ biến, ngoài ra
cũng có các chế phẩm mặc dù gồm vài enzyme nhưng hoạt động ưu thế trên một
loại cơ chất. Điển hình như: pancreatic protease là chế phẩm hỗn hợp giữa trypsin
và chymotrypsin. Pancreatic lipase là chế phẩm hỗn hợp có chứa cả esterase,
protease, amylase và các zymogen [1].
Ngoài chế phẩm hỗn hợp, một số enzyme tuyến tụy cũng đã được thu nhận dưới
dạng tinh sạch như trypsin, chymotrypsin, lipase tụy.
1.1.1 Protease
Protease tuyến tụy bao gồm chủ yếu là trypsin và chymotrypsin, chúng thuộc
nhóm serine-protease, có nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, có
vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các protease
tuyến tụy thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ
chất tương đối rộng [2].
Trypsin [E.C.3.4.21.4]
Nghiên cứu trypsin của lợn cho thấy đây là một chuỗi polypeptide có 249 acid
amin, trọng lượng phân tử 22.680 - 23.400 Da. Trypsin thủy phân liên kết peptide
giữa gốc carboxyl của lysine và arginine với nhóm amine của các acid amin khác.
pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp là 7,8 - 9,5. Nhiệt độ thích
5

hợp cho hoạt động của trypsin trong khoảng 30 - 40
0
C, ở nhiệt độ này và pH 8,5 - 9
trypsin có khả năng thủy phân mạnh các cơ chất như casein, hemoglobin hay
gelatin. Ion Ca
2+
được xem như là chất bảo vệ cho enzyme khỏi bị biến tính và bảo

ở đáy túi liên kết thay vào vị trí của lysine. Do sự khác nhau này, cơ chất protein
hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là arginyl và lysyl mới có thể kết hợp với
trung tâm hoạt động của trypsin để thủy phân liên kết peptide. Ở chymotrypsin, cơ
chất protein hoặc chuỗi peptide có các gốc acid amin là tyrosyl, phenylalanyl và
tryptophanyl mới có thể kết hợp với trung tâm hoạt động của chymotrypsin [2].
Sự tƣơng đồng về cấu trúc của trypsin và lipase tuyến tụy
Trung tâm hoạt động của trypsin là chuỗi pentapeptide Gly-Asp-Ser-Gly-Gly,
tương đồng với trung tâm hoạt động của lipase tụy với chuỗi pentapeptide Gly-X-
Ser-X-Gly. Mặt khác, lipase tụy sẽ bị mất hoạt độ khi có mặt các chất kìm hãm
serine-protease như diisopropylphosphofluoridate và diethyl-p-nitrophenyl
phosphate. Từ minh chứng trên, lipase tụy được xem như thuộc nhóm serine-
protease. Các phân tích cấu trúc gần đây cho thấy ở lipase tụy hiện diện cấu trúc
Ser…His…Asp, cấu trúc này có mặt ở tất cả các serine protease mặc dù các thành
phần acid amin còn lại khác nhau. Cấu trúc tương đồng ở trung tâm hoạt động của
serine protease và lipase tụy như sau [4].
SERINE PROTEASE
Trypsin chuột QGDSGGPVVC
Chymotrypsin chuột MGDSGGPLVC
LIPASE
Lipase tụy lợn VHVIGHSLGSHAA
Lipase tụy chó VQLIGHSLGAHVA
Lipase tụy ngựa VHIIGHSLGSHAA
Lipase tụy người VHVIGHSLGAHAA
1.1.2 Lipase tụy [E.C.3.1.1.3]
7

Các enzyme lipase hay các acylglycerol acylhydrolase (E.C. 3.1.1.3) được định
nghĩa như là các enzyme thuỷ phân các liên kết ester giữa các acid béo mạch dài và
glycerol trong dầu béo tại bề mặt phân pha dầu-nước. Các enzyme lipase thủy phân
triacylglycerol (TAG) không tan trong nước thành các diacylglycerol, các


Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các nghiên cứu cho
thấy vùng hoạt động của enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu
trúc di động [8]. Theo Winkler, F.K. và cộng sự, cấu trúc di động cần di chuyển trên
bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc hoạt động của enzyme với trung
tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất. Cấu trúc tinh thể của lipase hay cấu trúc
dạng phức đã tạo điều kiện cho việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase.
Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di
động chuyển từ đóng sang mở [9]. Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các
lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt
để có thể liên kết với lipid [10].

Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) [11]
Cấu trúc di động
Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề mặt
liên pha nước và cơ chất. Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt động
của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó. Khi chuyển sang
dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham gia
phản ứng. Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm sáng
tỏ nhiều hơn. Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động. Nắp
có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng nắp,
phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi protein;
9

khi enzyme chuyển sang trạng thái mở, mặt kỵ nước sẽ lộ ra ngoài làm tăng diện
tích bề mặt kỵ nước, tăng khả năng liên kết với cơ chất. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra
rằng cấu trúc phần nắp còn ảnh hưởng đến hoạt độ và tính chọn lọc của lipase. Ví
dụ, cùng trong một nhóm lipase, lipase tụy người và lipase tụy heo, nhưng 2 lipase
lại cho thấy tính đặc hiệu khác nhau. Lipase tụy người chỉ có hoạt độ cao với
triglyceride, trong khi lipase tụy heo còn thể hiện hoạt độ của phospholipase và

Sự hoạt hóa enzyme lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ
chất ở dạng hạt nhũ (miccelar substrates), do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp (lid)
của enzyme. Sự tác động này tương đối khác nhau tuỳ loại cơ chất [15]
Hình 1.4 mô tả cơ chế tác động của lipase theo Jaeger và cộng sự (1999) Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất [16]
Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang dạng
enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất. Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn,
(2) định hướng, (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa. Phần
còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo ra
dạng trung gian (Ea*S). Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái
nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành
oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester. Một hình tứ
11

diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và
nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính. Proton trên
histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester. Liên kết ester này sau đó bị
cắt đứt và một liên kết cộng hóa trị trung gian mới được hình thành giữa acid béo
mới giải phóng với serine. Bước 2 của quá trình là việc deacyl hóa enzyme nhờ
phân tử nước đến thủy phân liên kết cộng hóa trị trên. Trong bước này, proton từ
nước sẽ chuyển đến serine trên tạo thành ion hydroxide. Ion này sẽ gắn với nguyên
tử carbon của carbonyl trên cơ chất [17].
Acyl hóa Ea*S Ea*Ac+P1 và đề acyl hóa Ea*Ac Ea*+P2
(Ea*: adsorbed and activated enzyme – enzyme hoạt hóa kết bám)
Cơ chế phân tử của phản ứng xúc tác bởi lipase được mô tả ở hình 1.5 Hình 1.5: Cơ chế thủy phân của enzyme lipase [17]

nối đôi (polyunsaturated fatty acid, PUFA) [19].
Đặc hiệu cơ chất
Dầu và mỡ động thực vật là những cơ chất thích hợp của enzyme lipase. Tuy
nhiên, đối với các loại cơ chất khác nhau thì hoạt độ của enzyme cũng không giống
nhau [20].
13

Bảng 1.1: Tính đặc hiệu cơ chất của lipase [20]
Cơ chất
Hoạt độ tƣơng đối (%)
Dầu dừa
142
Dầu hạt cotton
112
Dầu đậu phộng
34,5
Dầu olive
105
Dầu hướng dương
121
Triacetin
0
Tributirin
35,7
Triolein
100

Đặc hiệu vị trí hay đặc hiệu vùng (sn-1,3)
Tính đặc hiệu này có thể được xác định qua quá trình transester hóa triolein
(OOO) với palmitic acid (P), xúc tác bởi enzyme lipase. Sự tạo thành tripalmitin