ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

VƯƠNG BẢO THY

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA
(PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số: 62540201

TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT

Tp. Hồ Chí Minh, 2014


Công trình được hoàn thành tại: Trường Đại học Bách Khoa
– ĐHQG-HCM

Người hướng dẫn khoa học 1: TS. TRẦN BÍCH LAM
Người hướng dẫn khoa học 2: GS.TSKH.VS. LƯU DUẨN

Phản biện độc lập 1: GS. TS. ĐẶNG THỊ THU
Phản biện độc lập 2: PGS. TS. TRANG SỸ TRUNG
Phản biện 1: GS. TS. TRẦN THỊ LUYẾN
Phản biện 2: PGS. TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Phản biện 3: PGS. TS. LÊ VĂN VIỆT MẪN

Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án họp tại
………………………………………………………………..


[6].

[7].

[8].

DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Preparation, purification
and properties of lipase from hepatopancreas of Tra (Pangasius
hypophthalmus) catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ,
NXB Đại Học Quốc Gia TP.HCM, tập 14, K3, trang 5-11, 2011
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Properties of digestive
enzymes from visceral organs of Tra (Pangasius hypophthalmus)
catfish”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại Học Quốc
Gia TP.HCM, tập 14, K4, trang 34-43, 2011
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Purification and
characterization of proteases from hepatopancreas of Tra (Pangasius
hypophthalmus) catfish”, Tạp chí Khoa Học và Công Nghệ, Bộ Khoa Học
và Công Nghệ, tập 49, 5A, trang 290-297, 2011
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Thông số động học và tính
chất của protease tinh sạch từ gan tụy cá Tra (Pangasius
hypophthalmus)”, Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn, Bộ Nông
nghiệp và phát triển nông thôn, kỳ 1 tháng 12/2013, trang 60-63, 2013
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Tính chất động học và đặc
điểm thủy phân của lipase tinh sạch từ gan tụy cá Tra (Pangasius
hypophthalmus)”, Tạp chí phát triển Khoa Học và Công Nghệ, NXB Đại
Học Quốc Gia TP.HCM, tập 16, K4, trang 85-91, 2013
Vương Bảo Thy, Trần Bích Lam, Lưu Duẩn. “Nghiên cứu tách lấy
pancreatin từ gan tụy cá Tra (Pangasius hypophthalmus)”, Tạp chí

về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay ngoài một số khảo sát chung về
protease nội tạng chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan
tụy cá tra.
Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất khẩu Thủy sản
Việt Nam) đến năm 2015 sản lượng cá tra nguyên liệu khoảng 1,8 triệu tấn
thì riêng phần nội tạng ước tính khoảng 100.000 tấn, đây là nguồn nguyên
liệu dồi dào, nhiều tiềm năng để thu nhận các chế phẩm enzyme tiêu hóa
ứng dụng trong y học, công nghệ thực phẩm.
Đề tài “Nghiên cứu thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra
(Pangasius hypophthalmus)” nhằm góp phần giải quyết các vấn đề trên.
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Xác định đặc tính phân bố, phân lập và xác định tính chất của các
enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus).


Xác định phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ nguồn
nội tạng cá tra sẵn có để đưa vào ứng dụng.
ĐỐI TƢỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU
Đối tƣợng nghiên cứu
Đối tượng nghiên cứu của luận án là các enzyme tiêu hóa có trong cơ
quan nội tạng của cá tra (Pangasius hypophthalmus) nhưng chủ yếu tập
trung vào enzyme lipase và protease.
Phạm vi nghiên cứu
Phạm vi nghiên cứu của luận án là nghiên cứu đặc điểm phân bố của
các enzyme protease, lipase và amylase trong các cơ quan nội tạng; thu
nhận, tinh sạch và xác định tính chất của lipase và protease từ nội tạng của
cá tra (Pangasius hypophthalmus).
PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương pháp nghiên cứu để thực hiện luận án là phương pháp nghiên
cứu thực nghiệm khoa học kết hợp với phương pháp phân tích lý thuyết và

Luận án gồm 120 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng
quan 28 trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14
trang; Chương 3: Kết quả và bàn luận 73 trang; Kết luận và kiến nghị 2
trang, 150 tài liệu tham khảo. Trong luận án có 24 bảng, 62 hình và đồ thị.
CHÖÔNG 1

TOÅNG QUAN

1.1. Tình hình nghiên cứu enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá
Hiện nay, các nghiên cứu về hệ tiêu hóa của các loài cá nói chung và cá
da trơn nói riêng chủ yếu tập trung vào việc khảo sát thói quen về ăn uống
của chúng. Ngoại trừ enzym pepsin từ dạ dày cá đã được nhiều tác giả trên
thế giới nghiên cứu thu nhận, tinh sạch, xác định tính chất và đưa vào ứng
dụng, các hiểu biết về hệ enzyme tiêu hóa từ tụy tạng cá vẫn còn khá hạn
chế. Nghiên cứu về protease tụy tạng cá cho thấy đây là các protease kiềm,
có hai loại protease là trypsin và chymotrypsin. Trypsin và các enzyme
giống trypsin có hoạt độ protease đã được tinh sạch và định tính ở một số


4
loài cá như: cá mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết đảo băng, cá tuyết Đại Tây
Dương, cá hồi trứng, cá hồi Đại Tây Dương, cá hồi bạc, cá trồng. Ngoài
trypsin và chymotrypsin, các nghiên cứu cũng đặc biệt quan tâm đến
protease kiềm từ nội tạng cá. Nghiên cứu về các enzyme protease trong hệ
tiêu hoá của các loài cá khác nhau đã cho thấy rằng các serine protease từ
cá cũng tương tự với các enzyme này ở động vật máu nóng về kích thước
phân tử, thành phần acid amin và sự nhạy cảm với các chất có tác động ức
chế các serine protease.
Một số lipase từ nội tạng cá khác đã được nghiên cứu như lipase cá mập,
cá tuyết, cá tráp, cá đối, cá rô. Jonh S. Patton tìm thấy hai loại lipase gan tuỵ

vì khơng sử dụng hóa chất là muối trung tính hay dung mơi hữu cơ như
aceton, ethanol, hoặc isopropanol (thể tích gấp 3 - 4 lần thể tích dịch
enzyme) để kết tủa enzyme. Nhược điểm của phương pháp lọc màng là
kích thước phân tử phân riêng giao động trong khoảng lớn, do đó phương
pháp lọc màng khơng tách riêng hồn tồn được các protein. Kỹ thuật lọc
màng vì vậy được ứng dụng hiệu quả trong cơng nghiệp thu nhận chế phẩm
thơ, nhưng kém hiệu quả trong việc thu nhận chế phẩm tinh khiết.
1.3. Ứng dụng của các enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá
Các enzyme tiêu hóa thu nhận từ nội tạng cá được nghiên cứu ứng dụng
trong xử lý thịt, trích ly dầu cá từ ngun liệu thơ, sản xuất acid béo ω-3
dạng concentrate, dùng làm enzyme chống oxy hóa, tách loại da cá, tinh sạch
trứng cá, tách bỏ vỏ của động vật có vỏ, sản xuất nước chấm từ cá, sản xuất
thức ăn gia súc từ cá, sản xuất protein thủy phân từ cá, tận thu các hợp chất
màu từ phế phẩm của động vật có vỏ, khử mùi ơi do oxy hố ở sữa.
CHƯƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Nội tạng cá tra (Pangasius hypophthalmus) do cơng ty chế biến thủy
sản ở Vĩnh Long cung cấp. Ngay sau khi giết mổ, nội tạng được bảo quản ở
0

-20 C để hạn chế sự biến tính enzyme.
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
Phương pháp xác định đặc điểm phân bố các enzyme trong nội tạng


6
Nguyên liệu nội tạng được chia thành 3 loại sau: (1) gan tụy, (2) ruột,
(3) nội tạng hỗn hợp. pH trích ly từ 6-11. Các enzyme khảo sát: lipase,
protease và amylase. Mục tiêu: chọn thành phần nội tạng, pH trích ly tối ưu

1
kết hợp 2-3 phương pháp tinh sạch 0mới tách riêng được các enzyme. Sử
dụng kết hợp các phương pháp như: (1) Thẩm tích để loại muối và các chất
có phân tử lượng nhỏ; (2) Sắc ký trao đổi ion; (3) Sắc ký lọc gel Sephadex.
Trong nghiên cứu này, enzyme được chọn tinh sạch bằng thẩm tích; sắc ký
trao đổi ion DEAE-cellulose; sắc ký lọc gel Sephadex G-75/ G-100. Mục
tiêu: thu nhận protease/ lipase tinh sạch từ hỗn hợp enzym ban đầu.
Phương pháp xác định tính chất các enzyme tinh sạch
Các enzyme tinh sạch được xác định thành phần cấu tạo, phân tử
lượng; xác định các thông số động học như pH tối ưu, nhiệt độ tối ưu, độ
bền pH, độ bền nhiệt theo thời gian, các chất làm tăng hoặc làm giảm hoạt
độ enzyme; xác định giá trị Km và Vmax.
Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme
Chế phẩm enzyme được ứng dụng trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa.
2.3 Công thức tính toán
Hoạt độ riêng là số đơn vị hoạt độ enzyme được tính trên 1mg protein
của chế phẩm. Hoạt độ tương đối là tỷ lệ phần trăm giữa hoạt độ enzyme
còn lại và hoạt độ enzyme ban đầu. Hiệu suất thu hồi là tỷ lệ giữa tổng hoạt
độ enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và tổng hoạt độ enzyme trong
mẫu trước khi đem tinh sạch. Độ tinh sạch được tính theo tỷ lệ giữa hoạt độ
riêng của enzyme thu được sau quá trình tinh sạch và hoạt độ riêng của mẫu
enzyme trước khi đem tinh sạch.
Sử dụng phần mềm Stargaphic Plus 4.0 để xử lý thống kê.
CHƢƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN

3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra
3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra
Nội tạng cá tra theo kết quả nghiên cứu, chiếm tỷ lệ khối lượng 5,83%,

(U/mg pr)

b

13,44

a

18,44

c

12,02

Nội tạng

8

491,33

Gan tụy

8

674,02

Ruột

8


Gan tụy

8

84,28

Ruột

10

9,86

c

b
a

0,37

c

Amylase
Hoạt độ

Hoạt độ riêng

(U/g ck)

(U/mg pr)


5,03

a

c

Các chữ số khác nhau trong cùng một cột thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa
thống kê ở mức p < 0,05; ck: chất khô nguyên liệu


Theo kết quả bảng 1, tại giá trị pH trích ly tối ưu, cho thấy trong các
thành phần nội tạng, mẫu gan tụy có hoạt độ enzyme lipase, protease và
amylase cao hơn mẫu nội tạng hỗn hợp và mẫu ruột, khác biệt có ý nghĩa
về mặt thống kê ở mức p < 0,05, có thể do tụy tạng là cơ quan chính sản
sinh các enzyme tiêu hóa. Hoạt độ riêng của các enzyme tiêu hóa từ gan tụy
cá tra là khá cao khi so sánh với các loài cá khác.
Trong nghiên cứu này chúng tôi quan tâm chủ yếu đến hai loại enzyme
chính là lipase và protease. Từ kết quả thí nghiệm này chọn nguyên liệu là
gan tụy, pH trích ly là pH8 cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2 Khảo sát quá trình trích ly enzyme
Kết quả nghiên cứu đã xác định điều kiện tốt nhất để trích ly enzyme
protease và lipase từ gan tụy cá tra như sau: với dung môi là đệm Tris-HCl
(0,05N) pH 8, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly là 1/2, nhiệt độ trích ly
0

5 C, thời gian trích ly là 1 giờ.
3.3 Khảo sát quá trình thu nhận enzyme bằng công nghệ lọc màng
Kết quả khảo sát cho thấy công nghệ lọc màng chỉ đạt hiệu quả cao
trong thu nhận lipase và không hiệu quả đối với protease. Nên từ dịch trích
enzyme, tiến hành các bước sau: (1) lọc thô; (2) ly tâm; (3) lọc MF với 2

sạch

xử lý

(mg pr/ml)

(U/ml)

(U)

(%)

(lần)

Pha
loãng
1 µm
0,1 µm

1,09

a

-

1,06

a

23,11


1,05

25,47

a

31636

72,85

1,23


13
Từ kết quả bảng 2 cho thấy độ tinh sạch lipase tăng sau khi lọc MF qua
2 màng kích thước 1 và 0,1 µm chứng tỏ quá trình lọc MF hiệu quả.
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi
và độ tinh sạch lipase sau lọc UF
Bảng 3: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo tỷ lệ pha loãng
Tỷ lệ

Nồng độ
protein
(mg pr/ml)

1:2

0,90



a

7040

87,34

b

24,89

b

34,07

a

7516

c

14,52

c

27,94

b

5159

Bảng 4: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành
Áp
suất
(psi)

Nồng độ
protein
(mg pr/ml)

4

0,37

6

0,41

8

0,44

Hoạt độ
Hoạt độ
Tổng
lipase riêng lipase hoạt độ
(U/ml)
(U/mg pr) lipase (U)

b


a

7216

89,52

43,70

b

5913

73,36

Độ tinh
sạch
(lần)

b

1,90

ab

a

2,01

b


18,67

120

0,42

ab

22,22

150

0,45

a

20,15

Tổng
hoạt độ
lipase (U)

Hiệu suất
thu hồi
(%)

bc

46,86


ab

1,84

b

a

2,07

b

1,75

a

b


14
Kết quả bảng 5 chọn thời gian lọc 120 phút.
Hiệu quả của quá trình lọc UF trong tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 6.
Bảng 6: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của lipase sau lọc UF
Công

Nồng độ

Hoạt độ

Hoạt độ


(%)

(lần)

0,1 µm

0,79

a

0,42

b

UF

20,15

b

22,22

a

25,47

b

8060

Kết quả nghiên cứu cho thấy với tác nhân kết tủa là amoni sunfate,
chọn nồng độ muối amoni sulfate bão hòa 60% cho hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease, lipase cao nhất. Với tác nhân kết tủa là ethanol, chọn tỷ
lệ ethanol/ dịch trích ly là 3/1 (v/v). Với tác nhân kết tủa là aceton, chọn tỷ
lệ aceton/dịch trích ly là 4/1. Với tác nhân kết tủa là isopropanol, chọn tỷ lệ
isopropanol/dịch trích ly là 4/1 cho hiệu quả kết tủa tốt nhất.


15
So sánh kết quả của các phương pháp kết tủa

90.0

88.0
86.3

b
a

86.0
2.97
84.0

b

2.15

c

81.71


cd
1.89

d

3
2.04

bc

2
1
0

SA

SA+
Ethanol
aceton
thẩ
m
tích tác nhân kết tủa

isopropanol

Hiệu suất thu hồi protease (%)
Độ tinh sạch

91.43

6

bc

88.80

ab

87.78

4

bc

cd

1.87

5

3

d
2

1

80.00
0


enzyme bao gồm các bước sau: (1) kết tủa phân đoạn bằng muối amoni
sunfate 60% nồng độ bảo hòa; (2) thẩm tích bằng màng cellophane 12
KDa; (3) tinh sạch bằng sắc ký trao đổi ion DEAE-cellulose; (4) kết hợp
sắc ký lọc gel Sephadex G-75. Kết quả sắc ký đồ thể hiện ở hình 3, 4.
6.0

Hàm lượng protein (mg/ml)

0.25
0.20
0.15
0.10

NaCl
0.3 M

5.0
4.0
3.0
2.0
1.0

0.05

0.00
1
43

4


Hình 3: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột
DEAE-cellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M
Từ kết quả hình 3 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất
thể hiện hoạt độ protease gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ


17
protease cao nhất là 4,86 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện
hoạt độ lipase, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên
gel SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử
lượng khác nhau (hình 5). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo
gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại
protease và một loại lipase. Các peak còn lại hầu hết chỉ là các protein tạp
thể hiện hoạt độ lipase, protease rất thấp.
Từ kết quả hình 4 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ protease
gồm 10 phân đoạn (ống 16-26) với hoạt độ protease cao nhất là 2,33 U/ml.
Vậy sau khi qua cột sắc ký lọc gel sephadex G75 đã tách được protease ra
khỏi lipase, kết quả kiểm tra độ tinh sạch và phân tử lượng protease thể
hiện ở hình 5.
2.5

Hàm lượng protein (mg/ml)

0.14
0.12
0.10
0.08
0.06

25

28

31

34

37

0.0

40
phân đoạn (3ml/ống)
Hàm lượng protein (mg/ml)
Hoạt độ protease (U/ml)

Hình 4: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên Sephadex G-75
Hiệu quả quá trình tinh sạch protease thể hiện ở bảng 7. Kết quả bảng
này cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận protease có hoạt độ riêng
28,59 U/mg, độ tinh sạch cao gấp 22,41 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu
suất thu hồi protease đạt 23,67%.


Bảng 7: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra
Công đoạn

Protein Tổng hoạt
tổng



Kết tủa

82,35

223,2

2,71

2,12

86,41

Thẩm tích

56,7

201,15

3,55

2,78

77,87

Sắc ký ion

4,59

122,81


Hình 5: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE
Cột b: thang protein chuẩn, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion
DEAE-cellulose, cột c: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G75
3.5.3 Xác định một số tính chất của protease gan tụy tinh sạch
3.5.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của protease


100
H
oạ
t
độ
tư
ơ
ng
đố
i
(%

80

35 độ C
45 độ C
50 độ C
55 độ C
60 độ C
70 độ C

60

0

hoạt độ protease giảm 43,16%. Khi nhiệt độ cao hơn 55 C tốc độ giảm hoạt
0

độ protease nhanh hơn, ở nhiệt độ 60 C sau 120 phút hoạt độ protease giảm
0

60,37%, ở nhiệt độ 70 C sau 15 phút hoạt độ protease giảm 86,42%.
3.5.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của protease
105
100

H
oạ
t
độ
tư
ơ
ng
đố
i

95

pH 7
pH 7.5
pH 8
pH 8.5
pH 9

2+

2+

2+

các ion kim loại nặng như Zn , Cu , Mg , kích thích khi có mặt ion Ca .
3.5.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của protease
Theo đồ thị Lineweaver- Burk, giá trị Km và Vmax của protease tinh sạch
khi thủy phân cơ chất BSA được xác định với Km = 897 mg/L và Vmax = 15,7
mg/L.phút.
3.5.3.5 Thành phần acid amin của protease gan tụy
Từ kết quả cho thấy protease tinh sạch có 14 loại acid amin với tỷ lệ
khác nhau, trong đó, các amino acid có hàm lượng cao là serine với 0,714
mg/g, aspartic với 0,651 mg/g, tiếp theo là glutamic với 0,416 mg/g,
glysine với 0,355 mg/g và leucine với 0,303 mg/g.
3.6 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
Khảo sát quá trình tinh sạch lipase bằng sắc ký trao đổi ion DEAEHàm lượng protein (mg/ml)

cellulose kết hợp sắc ký lọc gel Sephadex G-75
0.25
0.20
0.15
0.10

NaCl
0.3 M

5.0
4.0

31

34

37

40

43

0.0

phân đoạn (3ml/ống)
Hàm lượng protein (mg/ml)

Hoạt độ lipase (U/ml)

Hình 8: Sắc ký đồ trao đổi ion của lipase gan tụy cá tra trên cột DEAEcellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl 0-0,3M


Từ kết quả hình 8 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 3 peak lớn và một số peak nhỏ, trong đó peak có diện tích lớn nhất
thể hiện hoạt độ lipase gồm 15 phân đoạn (ống 15-29) với hoạt độ lipase
cao nhất là 5,67 U/ml; kiểm tra 15 phân đoạn này đều có thể hiện hoạt độ
protease, kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp chạy điện di trên gel
SDS-PAGE cho thấy phân đoạn này chỉ có hai loại protein có phân tử
lượng khác nhau (hình 10). Điều đó chứng tỏ phương pháp rửa giải theo
gradient nồng độ NaCl 0-0,3M đã thu nhận được hỗn hợp gồm một loại
lipase và một loại protease. Tiếp tục nghiên cứu tách riêng lipase ra khỏi
hỗn hợp bằng sắc ký lọc gel Sephadex G-75.

7Hàm10
16 (mg/ml)
19
22
lượng13protein
40

25
31 (U/ml)
34
Hoạt 28
độ lipase

37

0.0

phân đoạn (3ml/ống)

Hình 9: Sắc ký lọc gel của lipase gan tụy trên gel Sephadex G75
Từ kết quả hình 9 cho thấy mẫu enzyme sau khi qua cột đã phân tách ra
thành 2 peak lớn, trong đó có một peak diện tích lớn thể hiện hoạt độ lipase
gồm 9 phân đoạn (ống 4-12) với hoạt độ lipase cao nhất là 5,17 U/ml. Kết
quả kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng lipase bằng phương
pháp điện di trên gel SDS-PAGE thể hiện ở hình 10.
Hiệu quả quá trình tinh sạch lipase thể hiện ở bảng 8. Kết quả bảng này
cho thấy sau quá trình tinh sạch thu nhận lipase có hoạt độ riêng 509,71


U/mg, độ tinh sạch cao gấp 37,95 lần so với dịch enzyme thô. Hiệu suất thu

(U/mg pr)

(lần)

(%)

202,5

2719,8

13,43

1,0

100

Kết tủa

82,35

2493,45

30,28

2,25

91,68

Thẩm tích


40,08

Enzyme thô

DEAE-cellulose

SephadexG75
* Nguyên liệu gan tụy: 50g

** Kết quả trung bình 3 lần thí nghiệm

Kiểm tra độ tinh sạch và xác định phân tử lượng của lipase gan tụy
Kết quả điện di xác định lipase gan tụy tinh sạch và có phân tử lượng
57 KDa

Hình 10: Kết quả điện di trên gel SDS– PAGE
Cột c: thang protein chuẩn, cột b: phân đoạn thu từ sắc ký trao đổi ion
DEAE-cellulose, cột a: phân đoạn thu từ sắc ký lọc gel Sephadex G-75
3.6.3 Xác định một số tính chất của lipase tinh sạch
3.6.3.1 Nhiệt độ tối ưu và độ bền nhiệt theo thời gian của lipase


120
100

Ho
ạt
độ
tư
ơn


Hình 11: Độ bền nhiệt theo thời gian của lipase
0

Kết quả nghiên cứu cho thấy nhiệt độ tối ưu của lipase gan tụy là 50 C.
0

Enzym này bền ở nhiệt độ 35-55 C. Theo kết quả hình 11, tại nhiệt độ tối ưu
0

50 C sau thời gian 120 phút hoạt độ lipase giảm 44,7%. Khi nhiệt độ cao
0

0

hơn 55 C tốc độ giảm hoạt độ lipase nhanh hơn, ở nhiệt độ 60 C sau 120
0

phút hoạt độ lipase giảm 70,61%, ở nhiệt độ 70 C sau 15 phút hoạt độ lipase
giảm 78,68% .
3.6.3.2 pH tối ưu và độ bền pH theo thời gian của lipase
105
100

Ho
ạt
độ
tư
ơn
g

Hình 12: Độ bền pH theo thời gian của lipase
Lipase từ gan tụy cá tra họat động thủy phân ở pH tối ưu là pH 8. Mặt
khác, kết quả nghiên cứu độ bền pH của enzym này cho thấy lipase gan tụy
cá tra bền ở khoảng pH 7-9, trong thời gian 120 phút còn trên 70% hoạt lực,
rất thích hợp để nghiên cứu ứng dụng trong y học làm thuốc hỗ trợ tiêu hóa.


3.6.3.3 Ảnh hưởng của một số ion kim loại đến hoạt độ lipase
Kết quả nghiên cứu cho thấy lipase gan tụy cá tra bị kìm hãm bởi các
2+

2+

2+

ion kim loại nặng như Zn , Cu và Cd . Ngược lại, lipase gan tụy cá tra
2+

tăng hoạt độ khi môi trường phản ứng hiện diện ion Ca . Đặc tính này
giống lipase gan tụy các loài cá khác. Ngoài ra, ion Ca

2+

còn đóng vai trò

2+

khác trong phản ứng lipase. Vai trò chính của Ca là phản ứng với acid
béo tự do sinh ra trong phản ứng để tạo muối.
3.6.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất đến hoạt độ của lipase