ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

VƯƠNG BẢO THY

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

LUẬN ÁN TIẾN SỸ KỸ THUẬT

TP. HỒ CHÍ MINH, 2015


ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP. HCM
TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA

VƯƠNG BẢO THY

NGHIÊN CỨU THU NHẬN ENZYME TIÊU HÓA
TỪ NỘI TẠNG CÁ TRA (PANGASIUS HYPOPHTHALMUS)

Chuyên ngành: Chế Biến Thực Phẩm và Đồ Uống
Mã số: 62540201

Phản biện độc lập 1: GS.TS. ĐẶNG THỊ THU
Phản biện độc lập 2: PGS.TS. TRANG SĨ TRUNG

Phản biện 1: GS.TS. TRẦN THỊ LUYẾN
Phản biện 2: PGS.TS. ĐỒNG THỊ THANH THU
Phản biện 3: PGS.TS.LÊ VĂN VIỆT MẪN
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC

Bộ môn Công nghệ sinh học trường Đại Học Bách Khoa TP.HCM- Quý Thầy, Cô
trong Bộ môn Sinh hóa, phòng thí nghiệm Công nghệ enzyme, phòng thí nghiệm Công
nghệ sinh học trường Đại học Khoa Học Tự Nhiên TP.HCM- Quý Thầy, Cô Bộ môn
Công nghệ thực phẩm trường Đại Học Cần Thơ luôn giúp đỡ tôi trong suốt thời gian
làm thí nghiệm với điều kiện tốt nhất.
Tôi sẽ luôn nhớ ơn Ban Giám Đốc Công ty TNHH Thủy Sản Hùng Vương- Vĩnh
Long, các anh chị phòng KCS – đã nhiệt tình hỗ trợ tôi toàn bộ nguyên liệu thí nghiệm
trong suốt quá trình thực hiện luận án cũng như tinh thần hợp tác triển khai nghiên
cứu ứng dụng tại nhà máy.
Xin cảm ơn các bạn đồng nghiệp- Thầy, Cô Bộ môn Công nghệ thực phẩm
Trường Đại học Cửu Long, Đại học Công nghệ Sài Gòn cùng bạn bè đã hỗ trợ tôi rất
nhiều trong suốt thời gian thực hiện luận án.
Đặc biệt, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến gia đình và ba mẹ - chính gia
đình là nguồn động lực giúp tôi kiên trì vượt qua mọi khó khăn, quyết tâm hoàn thành
luận án.
Luận án này là món quà vô giá tôi xin trân trọng dành tặng cho Gia đình, Thầy
Cô – những người luôn yêu thương, bên cạnh tôi trong cuộc sống cũng như trong sự
nghiệp.
TPHCM, ngày 15 tháng 01 năm 2015
VƯƠNG BẢO THY


TOM TAẫT LUAN AN
Cỏ tra (Pangasius hypophthalmus) l mt trong nhng sn phm thy sn xut
khu ch lc ca nc ta. Theo d bỏo ca VASEP (Hip hi Ch bin v Xut
khu Thy sn Vit Nam) n nm 2020 sn lng cỏ tra nguyờn liu khong 1,8
triu tn thỡ riờng phn ni tng cỏ tra c tớnh khong 100.000 tn/nm, õy l
ngun nguyờn liu di do, nhiu tim nng thu nhn cỏc enzyme tiờu húa. Do
ú, lun ỏn Nghiờn cu thu nhn enzyme tiờu húa t ni tng cỏ tra (Pangasius
hypophthalmus) ó c thc hin nhm xỏc nh c im phõn b, tớnh cht ca

6- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease từ gan tụy cá
tra: là một serine protease có phân tử lượng 31 kDa, có tỷ lệ cao của serine,
aspartic và glutamic, pH tối ưu 8,5, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 550C, kích
thích khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cu2+, Zn2+, với cơ chất
BSA có Km = 897mg/L và Vmax = 15,7 mg/L.phút.
7- Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của lipase từ gan tụy cá tra:
là một lipase có hoạt độ cao và ổn định, phân tử lượng 57 kDa, có tỷ lệ cao
nhất là aspartic và glutamic, pH tối ưu 8, bền ở pH 7-9, nhiệt độ tối ưu 500C,
tăng hoạt độ khi có mặt ion Ca2+ và bị kìm hãm bởi các ion Cd2+, Zn2+, hoạt
động tốt nhất ở nồng độ muối mật NaTC 0,015M, thủy phân liên kết ester vị
trí 1,3 của glyceride, với cơ chất triolein có Km = 1,381mg/L và Vmax = 0,063
mg/L.phút.
8- Chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra có khả năng ứng dụng sản xuất
pepton trên cơ chất thịt bò và cá thác lác, đạt tỷ lệ Namin/ Ntổng lần lượt là
22,15% và 20,97%, đạt yêu cầu của loại pepton-pancreatic (theo Dược điển
Việt Nam); chế phẩm enzyme từ gan tụy cá có đặc tính thủy phân các loại
protein và chất béo tương đương pancreatin từ tụy lợn nên có thể sử dụng
làm dược liệu bào chế thuốc hoặc ứng dụng trong phòng chống suy dinh
dưỡng ở trẻ em.
Nghiên cứu đã đóng góp dẫn liệu khoa học về hệ enzyme tuyến tụy cá tra
(Pangasius hypophthalmus) đồng thời góp phần giải quyết thực tế sản xuất của
ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm giá trị gia tăng từ phế liệu cá. Kết quả nghiên
cứu là đóng góp lý thuyết và thực tiễn cho ngành công nghiệp thủy sản của Việt
Nam.


.................................................................................................................. I
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ...................................................................IV
DANH MỤC BẢNG ................................................................................................. V
DANH MỤC HÌNH .................................................................................................VI


2.2.8 Phương pháp nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme ....................... 43
2.3 Các phƣơng pháp phân tích .......................................................................... 43
2.4 Công thức tính toán ....................................................................................... 45
2.5 Phƣơng pháp xử lý số liệu ............................................................................. 45
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN.............................. 46
3.1 Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong nội tạng cá tra ..................................... 46
3.1.1 Tỷ lệ khối lượng các thành phần trong nội tạng cá tra ........................ 46
3.1.2 Sự phân bố của lipase, protease và amylase trong các cơ quan nội tạng
........................................................................................................................ 47
3.2 Khảo sát quá trình trích ly thu nhận dịch enzyme thô .............................. 51
3.2.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/dung môi trích ly ............................. 51
3.2.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ trích ly ........................................................... 54
3.2.3 Ảnh hưởng của thời gian trích ly .......................................................... 56
3.3 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp lọc màng ......... 59
3.3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ pha loãng dịch enzyme thô đến hiệu suất thu hồi và
độ tinh sạch lipase sau lọc UF........................................................................ 64
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của áp suất vận hành đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase sau lọc UF............................................................................. 66
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian lọc đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase sau lọc UF .................................................................................... 68
3.4 Khảo sát quá trình tinh sạch enzyme bằng phƣơng pháp kết tủa ............ 71
3.4.1 Kết tủa bằng amoni sunfate ................................................................. 71
3.4.2 Kết tủa bằng ethanol ........................................................................... 74
3.4.3 Kết tủa bằng aceton ............................................................................. 76
3.4.4 Kết tủa bằng isopropanol .................................................................... 78
3.4.5 So sánh hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch enzym từ các tác nhân kết tủa
........................................................................................................................ 79
3.5 Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra ......... 85
3.5.1 Thử nghiệm quá trình tinh sạch protease bằng sắc ký lọc gel Sephadex

3.6.3.6 Ảnh hưởng của muối mật đến hoạt độ lipase gan tụy ............... 114
3.6.3.7 Ảnh hưởng của loại cơ chất đến hoạt độ lipase gan tụy ............ 115
3.7 Nghiên cứu ứng dụng chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra ...................... 116
3.7.1 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong sản xuất pepton ........................... 116
3.7.2 Ứng dụng chế phẩm enzyme trong hỗ trợ tiêu hóa ............................. 118
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ ..121
DANH MỤC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ CỦA TÁC GIẢ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC

III


DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN ÁN
ck

Chất khô

cknl

Chất khô nguyên liệu

cp

Chế phẩm

ĐTS

Độ tinh sạch


Hoạt độ amylase

HĐRA

Hoạt độ riêng amylase

HSTH

Hiệu suất thu hồi

MF

Micro filtration (vi lọc)

nl ướt

Nguyên liệu ướt

nl khô

Nguyên liệu khô

mg pr

mg protein

S.A

Amoni sunfate



DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Tính đặc hiệu cơ chất của lipase ................................................................... 13
Bảng 1.2: Ảnh hưởng của các ion kim loại đến hoạt độ lipase ..................................... 14
Bảng 1.3: Phân tích khả năng thu nhận enzyme tiêu hóa từ nội tạng cá tra .................. 20
Bảng 3.1: Tỷ lệ khối lượng các thành phần nội tạng cá tra(Pangasius hypophthamus) 46
Bảng 3.2: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong nội tạng cá tra ............................. 47
Bảng 3.3: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong gan tụy cá tra ............................. 48
Bảng 3.4: Hoạt độ lipase, protease và amylase trong ruột cá tra ................................... 48
Bảng 3.5: Hoạt độ enzym lipase, protease và amylase tại pH trích ly tối ưu ................. 50
Bảng 3.6: Kết quả thu được sau quá trình ly tâm ........................................................... 61
Bảng 3.7: Kết quả thu được sau quá trình lọc MF.......................................................... 61
Bảng 3.8: Kết quả thu lipase trong dòng retentate sau lọc UF thay đổi theo tỷ lệ
pha loãng ....................................................................................................... 65
Bảng 3.9: Kết quả thu lipase trong dòng retentate theo áp suất vận hành...................... 66
Bảng 3.10: Kết quả thu được trong dòng retentate theo thời gian lọc............................ 68
Bảng 3.11: Thất thoát lipase theo dòng permeate ở các chế độ khảo sát ....................... 69
Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi và độ tinh sạch của enzyme lipase sau lọc UF ................ 70
Bảng 3.13: Hiệu suất thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra ................. 82
Bảng 3.14: Tóm tắt quá trình tinh sạch protease gan tụy cá tra .................................... 90
Bảng 3.15: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ protease gan tụy cá tra ......... 96
Bảng 3.16: Kết quả phân tích thành phần acid amin protease tinh sạch ........................ 97
Bảng 3.17: Tóm tắt quá trình tinh sạch lipase gan tụy cá tra ...................................... 105
Bảng 3.18: Ảnh hưởng của một số tác nhân đến hoạt độ lipase gan tụy cá tra ........... 112
Bảng 3.19: Kết quả phân tích thành phần acid amin lipase tinh sạch .......................... 113
Bảng 3.20: Hàm lượng nitơ tổng và nitơ amin của các pepton .................................. 117
Bảng 3.21: So sánh hoạt độ protease, lipase của chế phẩm enzyme và Enzyplex ....... 118

V


Hình 3.16: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch protease ................................................................................................................ 75
Hình 3.17: Ảnh hưởng của tỷ lệ aceton/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ tinh
sạch lipase .................................................................................................................... 75
Hình 3.18: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch protease ......................................................................................................... 76

VI


Hình 3.19: Ảnh hưởng của tỷ lệ isopropanol/dịch trích ly đến hiệu suất thu hồi và độ
tinh sạch lipase ............................................................................................................. 77
Hình 3.20: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch protease ......................................................................................... 78
Hình 3.21: So sánh khả năng kết tủa của các tác nhân khác nhau đến hiệu suất thu
hồi và độ tinh sạch lipase ............................................................................................. 78
Hình 3.22: Chế phẩm enzyme tiêu hóa thu nhận theo phương pháp kết tủa ............... 80
Hình 3.23: Qui trình công nghệ thu nhận chế phẩm enzyme từ gan tụy cá tra……... 83
Hình 3.24: Sắc ký đồ lọc gel Sephadex G-75 dung dịch enzym sau thẩm tích .......... 85
Hình 3.25: Kết quả điện di sau sắc ký lọc gel Sephadex G-75 ................................... 86
Hình 3.26: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAEcellulose với dãy nồng độ NaCl .................................................................................. 86
Hình 3.27: Sắc ký đồ trao đổi ion của protease gan tụy cá tra trên cột DEAEcellulose với gradient nồng độ dung dịch NaCl ........................................................... 87
Hình 3.28: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-100............ 88
Hình 3.29: Sắc ký lọc gel của protease gan tụy cá tra trên gel Sephadex-75.............. 89
Hình 3.30: Kết quả điện di trên gel SDS–PAGE ........................................................ 91
Hình 3.31: Qui trình tinh sạch protease gan tụy cá tra từ dịch trích ly enzyme……. . 92
Hình 3.32: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ protease .......................................... 93
Hình 3.33: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ của protease tinh sạch theo thời
gian ................................................................................................................................ 93
Hình 3.34: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ protease ................................................. 94

VIII


1

MỞ ĐẦU
TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI
Cùng với sự tiến bộ của khoa học, công nghệ enzyme trở thành ngành mũi nhọn
được phát triển nhanh trên thế giới. Trong đó, nghiên cứu enzyme tiêu hóa của các
loài cá được đặc biệt quan tâm trong vài thập kỷ vừa qua. Do cá sống trong môi
trường nhiệt độ thấp nên để duy trì sự sống, chúng cần phải có hệ enzyme tương đối
mạnh. Ưu điểm của các enzyme cá là có hoạt độ cao hơn tại các giá trị nhiệt độ thấp
hơn so với enzyme tương ứng từ động vật máu nóng.
Trong các enzyme nội tạng cá, lipase ngày càng được quan tâm do có khả năng
ứng dụng cao trong y học và công nghệ thực phẩm. Một số lipase từ nội tạng cá đã
được thế giới nghiên cứu như lipase cá mập, cá tuyết, cá mòi, cá hồi, cá tráp, cá ngừ
vây xanh, cá đối, cá rô...Riêng lipase cá tra (Pangasius hypophthalmus), hiện nay
chưa có nghiên cứu nào được công bố. Trong khi đó, về lý thuyết, ở cá tra có mô mỡ
rất phát triển so với các loại cá da trơn khác, như vậy ở loài cá này enzyme lipase
phải đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất. Vì vậy việc nghiên cứu
tính chất của lipase gan tụy cá tra có giá trị khoa học và cần đặc biệt quan tâm. So
với lipase thì protease nội tạng cá đã được nghiên cứu ở nhiều loài như protease cá
mòi, cá ốt vảy nhỏ, cá tuyết, cá hồi trứng, cá hồi bạc, cá trồng, cá thu…Tuy nhiên,
về cá da trơn ở Việt Nam cho đến nay, ngoài một số khảo sát chung về protease nội
tạng, chưa có công bố nào phân tích riêng tính chất protease gan tụy cá tra. Vì thế,
cần thiết phải có những công trình nghiên cứu chuyên sâu, cung cấp đầy đủ dẫn liệu
khoa học về hệ enzyme tiêu hóa ở cá tra.
Mặt khác, trong ngành công nghiệp chế biến cá tra tại Việt Nam, phi lê cá chiếm
khoảng 30%, phần còn lại là phế phụ phẩm, trong đó, phần nội tạng chiếm khoảng
5-6% trọng lượng cơ thể cá. Theo dự báo của VASEP (Hiệp hội Chế biến và Xuất

1. Khảo sát hệ enzyme tiêu hóa trong các cơ quan nội tạng cá tra
2. Nghiên cứu thu nhận chế phẩm enzyme tiêu hóa từ gan tụy cá tra
3. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất protease gan tụy cá tra
4. Nghiên cứu tinh sạch và xác định tính chất lipase gan tụy cá tra
5. Nghiên cứu khả năng ứng dụng chế phẩm enzyme tiêu hóa


3

Ý NGHĨA KHOA HỌC VÀ THỰC TIỄN
Ý nghĩa khoa học
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu một cách có hệ thống, phân tích
chuyên sâu về hệ enzyme protease, lipase từ gan tụy cá tra (Pangasius
hypophthalmus), đóng góp những dẫn liệu khoa học quan trọng về hệ enzyme tiêu
hóa từ nội tạng cá tra.
Đã xác định được đặc điểm cấu tạo và tính chất của protease và lipase từ gan tụy
cá tra; đưa ra điều kiện trích ly và phương pháp thu nhận chế phẩm enzyme gan tụy
cá tra bằng phương pháp lọc màng và phương pháp kết tủa; đề xuất phương pháp
tinh sạch protease và lipase từ gan tụy cá tra.
Ý nghĩa thực tiễn
Là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu thu nhận, tinh sạch các enzyme
tiêu hóa từ nguồn phế liệu nội tạng của ngành chế biến cá tra, góp phần làm phong
phú thêm nguồn thu các chế phẩm enzyme nói chung và protease, lipase nói riêng.
Chế phẩm enzyme từ nội tạng cá tra bước đầu khảo sát ứng dụng có hiệu quả cao
trong sản xuất pepton, hỗ trợ tiêu hóa. Kết quả nghiên cứu là giải pháp thiết thực từ
thực tế sản xuất của ngành chế biến cá tra, tạo sản phẩm có giá trị gia tăng từ nguồn
phế liệu cá, góp phần phát triển bền vững công nghiệp cá tra của Việt Nam.
BỐ CỤC CỦA LUẬN ÁN
Luận án gồm 122 trang bao gồm: Mở đầu 3 trang; Chương 1: Tổng quan 28
trang; Chương 2: Nguyên liệu và phương pháp nghiên cứu 14 trang; Chương 3: Kết

nhóm serine-protease, có nhóm –OH của gốc serine trong trung tâm hoạt động, có
vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme. Các protease
tuyến tụy thường hoạt động mạnh ở vùng kiềm tính và thể hiện tính đặc hiệu cơ
chất tương đối rộng [2].
Trypsin [E.C.3.4.21.4]
Nghiên cứu trypsin của lợn cho thấy đây là một chuỗi polypeptide có 249 acid
amin, trọng lượng phân tử 22.680 - 23.400 Da. Trypsin thủy phân liên kết peptide
giữa gốc carboxyl của lysine và arginine với nhóm amine của các acid amin khác.
pH tối ưu cho hoạt động của trypsin là 8 và pH thích hợp là 7,8 - 9,5. Nhiệt độ thích


5

hợp cho hoạt động của trypsin trong khoảng 30 - 400C, ở nhiệt độ này và pH 8,5 - 9
trypsin có khả năng thủy phân mạnh các cơ chất như casein, hemoglobin hay
gelatin. Ion Ca2+ được xem như là chất bảo vệ cho enzyme khỏi bị biến tính và bảo
vệ chống lại sự tự phân protein. Ngược lại, Cu2+, Ag2+, Hg2+ có tác dụng ức chế
enzyme. Ngoài ra trypsin còn bị ức chế bởi các chất kháng-trypsin tự nhiên có trong
tuyến tụy, đậu tương, đậu ván, các cây họ đậu, mướp đắng. Trung tâm hoạt động
của trypsin có thứ tự các acid amin -Gly-Asp-Ser-Gly-Pro- [2].

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của trypsin crayfish khi liên kết với chất kháng
trypsin Schistocerca gregaria (SGTI) [3]
Chymotrypsin [E.C.3.4.21.1]
Chymotrypsin là một protease hoạt động trong điều kiện môi trường có pH kiềm
nên được xếp vào nhóm protease kiềm tính tương tự như trypsin. Chymotrypsin
hoạt động trong điều kiện pH 7 - 9 và pH tối ưu là 8 - 9, điểm đẳng điện pI = 5,4;
pH 5 không thuận tiện cho hoạt động của chymotrypsin nhưng ở pH này
chymotrypsin lại bền vững hơn trong môi trường pH 8. Chymotrypsin là một chuỗi
polypeptide có 245 acid amin, trọng lượng phân tử 22.500 Da. Chymotrypsin hoạt

phosphate. Từ minh chứng trên, lipase tụy được xem như thuộc nhóm serineprotease. Các phân tích cấu trúc gần đây cho thấy ở lipase tụy hiện diện cấu trúc
Ser…His…Asp, cấu trúc này có mặt ở tất cả các serine protease mặc dù các thành
phần acid amin còn lại khác nhau. Cấu trúc tương đồng ở trung tâm hoạt động của
serine protease và lipase tụy như sau [4].
SERINE PROTEASE
Trypsin chuột

QGDSGGPVVC

Chymotrypsin chuột

MGDSGGPLVC

LIPASE
Lipase tụy lợn

VHVIGHSLGSHAA

Lipase tụy chó

VQLIGHSLGAHVA

Lipase tụy ngựa

VHIIGHSLGSHAA

Lipase tụy người

VHVIGHSLGAHAA


nếp này có phần trung tâm là 8 chuỗi xếp song song cùng chiều, chỉ có chuỗi β2
ngược chiều. Các chuỗi β3 đến β8 nối lại với nhau bằng các đoạn xoắn . Sự khác
biệt giữa các cấu trúc này là số chuỗi trên gấp nếp β, sự hiện diện của nhóm phụ và
cấu trúc của tiểu phần sẽ liên kết với cơ chất [7].


8

Cấu trúc lập thể của lipase được làm sáng tỏ vào năm 1990, các nghiên cứu cho
thấy vùng hoạt động của enzyme lipase bị che chắn khỏi dung môi bằng một cấu
trúc di động [8]. Theo Winkler, F.K. và cộng sự, cấu trúc di động cần di chuyển trên
bề mặt liên pha cơ chất và nước để tạo ra cấu trúc hoạt động của enzyme với trung
tâm xúc tác có thể tiếp xúc với cơ chất. Cấu trúc tinh thể của lipase hay cấu trúc
dạng phức đã tạo điều kiện cho việc làm sáng tỏ sự thay đổi cấu trúc của lipase.
Lipase sẽ chuyển từ trạng thái bất hoạt sang trạng thái hoạt động khi cấu trúc di
động chuyển từ đóng sang mở [9]. Cơ chế đóng mở nắp có thể khác nhau giữa các
lipase nhưng chúng đều tạo điều kiện cho trung tâm hoạt động của lipase thông suốt
để có thể liên kết với lipid [10].

Hình 1.2: Cấu trúc không gian lipase tụy của cá hồi (Salmo Salar) [11]
Cấu trúc di động
Lipase sẽ có sự thay đổi hình dạng để ổn định hoạt độ khi tương tác với bề mặt
liên pha nước và cơ chất. Ở trạng thái đóng, cái nắp sẽ che phủ trung tâm hoạt động
của enzyme, làm cho phân tử cơ chất không gắn kết được vào đó. Khi chuyển sang
dạng mở, trung tâm này trở thành con đường hầm để cơ chất đi vào và tham gia
phản ứng. Trong những năm gần đây, chức năng của cấu trúc nắp đã được làm sáng
tỏ nhiều hơn. Nó không chỉ đơn thuần là cái cổng đi vào trung tâm hoạt động. Nắp
có cấu trúc của một phân tử vừa có tính kỵ nước vừa có tính ái nước: khi đóng nắp,
phần mặt ưa nước hướng ra ngoài dung môi và mặt kỵ nước hướng vào lõi protein;


Trung tâm hoạt động
Trung tâm hoạt động của lipase gồm ba gốc acid amin: serine; aspartate hay
glutamate và một histidine.


10

Hình 1.3: Vùng tiếp xúc của lipase dạng mở và đóng.
Nhóm kỵ nước màu trắng, nhóm ưa nước màu vàng, các nhóm mang điện tích
dương màu xanh và các nhóm mang điện tích âm màu đỏ [15]
Sự hoạt hóa enzyme lipase thường xảy ra ở bề mặt tiếp xúc giữa enzyme và cơ
chất ở dạng hạt nhũ (miccelar substrates), do dịch chuyển một hoặc nhiều nắp (lid)
của enzyme. Sự tác động này tương đối khác nhau tuỳ loại cơ chất [15]
Hình 1.4 mô tả cơ chế tác động của lipase theo Jaeger và cộng sự (1999)

Hình 1.4: Phản ứng tổng quát ở mặt tiếp xúc của lipase với cơ chất [16]
Trong đó, phản ứng 1 mô tả quá trình chuyển từ dạng enzyme hòa tan sang dạng
enzyme hoạt hóa kết hợp cơ chất. Quá trình này bao gồm các giai đoạn: (1) kết gắn,
(2) định hướng, (3) hoạt hóa và cuối cùng (4) gắn cơ chất vào vị trí hoạt hóa. Phần
còn lại (phản ứng 2) là phản ứng xúc tác giữa enzyme và cơ chất phù hợp, tạo ra
dạng trung gian (Ea*S). Cơ chế xúc tác thủy phân cơ chất gồm hai bước: Độ ái
nhân của serine được tăng cường bằng việc chuyển proton đến histidine tạo thành
oxyanion tấn công vào carbon của nhóm carbonyl trên liên kết ester. Một hình tứ


11

diện được hình thành mang điện tích âm của nguyên tử oxy trong nhóm carbonyl và
nó được giữ ổn định nhờ liên kết hydro với nhóm NH của mạch chính. Proton trên
histidin sau đó được chuyển đến oxy trên liên kết ester. Liên kết ester này sau đó bị