i

MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN iv
MỞ ĐẦU 1
Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ SẢN PHẨM TỪ CHITIN 3
1.2. KHÁI QUÁT CHUNG VỀ ENZYME 8
1.3. ENZYME CHITINASE: PHÂN LOẠI VÀ CƠ CHẾ TÁC ĐỘNG 14
1.3.1. Phân loại hệ thống enzyme thủy phân Chitin: 14
1.3.2. Cơ chế tác động của enzyme thủy phân Chitin: 17
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE 18
1.4.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước. 18
1.4.2. Các công trình nghiên cứu trong nước. 18
1.5. PHÂN LOẠI VI KHUẨN THEO PHƯƠNG PHÁP CỔ ĐIỂN 20
Chương 2. ĐỐI TƯỢNG-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU21
2.1. ĐỐI T ƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 21
2.1.1. Đối tượng 21
2.1.2. Vật liệu 21
2) Môi trường: 21
2.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24
2.2.1 Phương pháp phân lập chủng vi khuẩn 24
2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính enzyme 25
2.2.3. Phương pháp xác định số lượng tế bào 26
2.2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định điều kiện nuôi cấy thích hợp 27
2.2.5. Bố trí thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố bên ngoài
đến hoạt tính enzyme 28
2.2.6. Phương pháp xác định hoạt độ của enzyme chitinase theo phương
pháp NELSON 29

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 50
KẾT LUẬN 50
ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO 51
PHỤ LỤC 54
MỘT SỐ HÌNH ẢNH LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH LÀM THÍ NGHIỆM
60
ivLỜI CẢM ƠN

Để hoàn thành luận văn này
Trước hết em xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc nhất đến cô giáo hướng dẫn: GS.TS.
Trần Thị Luyến đã tận tình hướng dẫn và động viên em trong quá trình thực hiện đề tài.

quả trong nhiều lĩnh vực đời sống. Và enzyme là một phần không thể thiếu được
của ngành công nghệ sinh học. Hiện nay, có rất nhiều loại enzyme được nghiên
cứu và ứng dụng của chúng ngày càng được mở rộng. Một trong số đó có enzyme
chitinase với dẫn xuất quan trọng là chitosan đang được ứng dụng vào vô số các
lĩnh vực khác nhau.
Việt Nam có nguồn lợi thủy sản rất dồi dào, ngành công nghệ nuôi trồng và
chế biến ngày càng phát triển mạnh. Nuôi tôm là một trong những nghề đã đem lại
hiệu quả kinh tế cao vì tôm là mặt hàng hải sản có giá trị không những cho nguồn
đạm động vật cao, mà còn là loại thực phẩm được nhiều người ưa thích và ngày
càng có giá trị trên thị trường thế giới. Tuy nhiên, dịch bệnh là nỗi ám ảnh và gây
thiệt hại lớn về kinh tế cho nghề nuôi tôm nói riêng và ngành thuỷ sản nói chung.
Nguyên nhân gây bệnh chủ yếu là do lượng thức ăn hữu cơ dư thừa trong nước sẽ
làm ô nhiễm, gây độc cho tôm, đồng thời vỏ tôm sau khi lột xác bị lắng đọng
xuống đáy ao tạo điều kiện phát triển cho các sinh vật có hại cho sự phát triển của
tôm. Trên thì trường đã xuất hiện nhiều chế phẩm vi sinh được nhập về nhưng quá
đắt cho người nông dân sử dụng và không kiểm soát được các vi sinh vật có trong
chế phẩm có ảnh hưởng gì đến sức khoẻ con người và môi trường không. Trong
khi đó, việc sử dụng các chế phẩm sinh học có nguồn gốc tự nhiên lại cho hiệu quả
hơn trong việc phòng và trị bệnh nhờ quá trình cạnh tranh sinh học. Khi ta thêm
các vi sinh vật có lợi như các vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao vào môi trường,
chúng sẽ phân giải nhanh các chất hữu cơ, lấn át và ức chế mầm bệnh phát triển, vì
thế sẽ ngăn ngừa được các mầm bệnh xảy ra.
Mặt khác một trong những dạng phế liệu chiếm phần lớn từ ngành thuỷ sản
là nguồn chitin từ vỏ loài giáp xác như tôm, cua. Tận dụng nguồn phế liệu này
không những giải quyết triệt để vấn đề ô nhiễm môi trường mà còn tạo ra các chế
phẩm mới có giá trị, làm tăng giá trị kinh tế cho ngành thủy sản. Để tạo ra các chế
phẩm có khả năng hòa tan trong nước từ chitin, chitosan có thể dùng phương pháp
hóa học, dùng các tia mang năng lượng cao và một số phương pháp khác để cắt
đứt mạch polymer của chúng. Các phương pháp trên thu được sản phẩm với hiệu

3

Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ SẢN PHẨM TỪ CHITIN
Năm 1811, giáo sư Henri Braconnott là người đầu tiên nghiên cứu về
Chitin, ông là người đã khám phá ra sự có mặt của chất này trong thành tế bào của
một số loài nấm. Vào những năm 30 của thế kỷ 19, chất này đã được tách riêng
biệt từ một loài côn trùng và được đặt tên là Chitin. Chitosan – một dẫn xuất của
Chitin đã được sản xuất vào năm 1859. Sau đó có rất nhiều công trình nghiên cứu
về đặc điểm và tính chất của Chitin và Chitosan nhằm áp dụng và phát triển chúng
theo hướng thương mại.
Chitin có ở nhiều nơi, trong thành tế bào của hầu hết các loại nấm (nấm sợi,
nấm men, …), biểu bì các loài thuộc lớp nhện, côn trùng, trong mai của lớp giáp
xác, các loài tảo cát, động vật nguyên sinh và giun tròn. Sự xuất hiện của Chitin ở
các đối tượng khác nhau được trình bày ở bảng 1 [20].
Bảng 01. Hàm lượng Chitin ở các sinh vật
Sinh vật
Hàm lượng
Chitin (%)

H
9
O
4
-NHCOCH
3
)
n
với tỉ lệ nitơ là 6,9%. Với sự tương
đồng trong cấu trúc phân tử mà đôi lúc Chitin được xem như sản phẩm phụ của
xenlulose. Chúng chỉ khác nhau ở vị trí cacbon C số 2 của đường glucose. Trong
xenlulose vị trí này liên kết với một nhóm (-OH), còn trong phân tử Chitin nhóm
(-OH) được thay thế bởi một nhóm phức acetylamin (-NH(CO)CH
3
).
Với rất nhiều cầu nối hydro giữa các nhóm N-acetyl của các chuỗi đã làm
cho Chitin rất dai và cực bền.
Chitin không hòa tan trong nước, trong dung môi hữu cơ, dung dịch kiềm
hay acid vô cơ loãng, nhưng Chitin hòa tan trong dung dịch kiềm đặc nóng.
Trong tự nhiên Chitin được phân giải bởi một hệ thống enzyme thủy phân
của cơ thể sinh vật.
Công thức cấu tạo chitin:

Hình 1: Cấu trúc hóa học của Chitin

Hình 2: Cấu trúc hóa học của xenlulose
5

vì vậy ngoài ý nghĩa của quá trình sinh trưởng, phát triển, thích nghi với môi
trường sống của cơ thể sinh vật, vỏ Chitin tham gia vào quá trình tạo phản ứng
miễn dịch chống lại các loài gây bệnh (nấm men, nấm mốc …).
Chitin đã được ứng dụng rất nhiều ở các lĩnh vực khác nhau.
Về lĩnh vực y học, từ rất sớm, người ta đã nhận ra chúng có khả năng chữa
lành các vết thương. Vào giữa những năm 50 của thế kỷ 20, các đường khâu vết
thương có phủ Chitin đã được sử dụng và đã làm tăng khả năng chữa trị vết
thương lên tới 35-50%. Năm 1970, trường đại học Delaware đã nghiên cứu về
phương pháp để tách các sợi Chitin tinh khiết. Các công ty của Nhật Bản đã mua
lại bằng sáng chế này, những sợi dùng khâu vết thương bằng Chitin tinh khiết vẫn
đang được sử dụng. Hơn nữa nguyên liệu này còn được sử dụng để bó các vết
bỏng, bề mặt vết thương, trên vết cắt da của người cho da. Phương pháp này làm
vết thương chóng bình phục hơn, giảm đau hơn so với các phương pháp điều trị
thông thường. Ngoài ra, Chitin còn được dùng để sản xuất gạc chống khuẩn, y
phục bệnh viện, túi đựng máu nhân tạo, thấu kính bằng chất dẻo, ức chế khối u,
ngăn ngừa mảng bám răng, điều chỉnh lượng cholesterol trong máu. Các sản phẩm
sử dụng trong gia đình có thể kể đến như: băng gạc, giấy vệ sinh, giấy ăn ….
Trong lĩnh vực sản xuất mỹ phẩm có hàng loạt các sản phẩm có chứa Chitin
như: phấn trang điểm, thuốc dưỡng móng tay, kem giữ ẩm da mặt, da tay, kem
dưỡng thể, kem đánh răng ….
Chitin được thêm vào hỗn hợp chứa nước sữa – một sản phẩm của ngành
công nghiệp sản xuất pho mát. Nhiều động vật sẽ thấy khó tiêu hóa do hàm lượng
lactoza trong nước sữa quá cao nhưng khi có mặt của Chitin, nó sẽ thúc đẩy sự
hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong bộ máy tiêu hóa sinh enzyme, kết quả là
làm cho quá trình tiêu hóa tốt hơn rất nhiều.
Các sản phẩm chuyển đổi từ Chitin có ý nghĩa thương mại rất cao nhất là
trong sản xuất Chitooligosaccarit (COS). Dẫn xuất quan trọng nhất của Chitin phải
kể đến là Chitosan.
- Loại ion kim loại.
- Làm đông hay ngưng tụ: protein, thuốc nhuộm,acid amin.
* Công nghệ thực phẩm:
- Loại bỏ thuốc nhuộm, các chất huyền phù.
- Chất bảo quản.
- Bền màu.
- Chất bổ sung thức ăn gia súc.
* Y tế:
- Băng y tế.
- Chất điều chỉnh cholesterol đường máu.
- Thuốc giảm béo. 8

- Kiểm soát sự thải loại của thuốc.
- Chữa bỏng.
- Kính áp tròng…
* Mỹ phẩm:
- Kem giữ ẩm da.
- Kem dưỡng thể, kem bôi mặt, tay.
- Sữa tắm…
* Bột giấy và giấy:
- Xử lý bề mặt.
- Giấy ảnh.
* Màng mỏng:
- Màng kiểm tra khả năng thấm.
- Màng thấm thấu ngược.
* Công nghệ sinh học:
- Cố định enzyme.

nhàng như ở áp suất và nhiệt độ bình thường của cơ thể hay ở môi trường bên
ngoài, pH thích hợp của enzyme gần pH sinh lý. Ngoài ra enzyme còn có khả năng
lựa chọn cao đối với kiểu phản ứng mà nó xúc tác cũng như đối với chất mà nó tác
dụng. Đó là tính đặc hiệu của enzyme [4].
Ví dụ: Chất xúc tác là acid không có tính đặc hiệu. Nó có thể xúc tác thủy
phân cắt đứt liên kết peptid của protein, liên kết glucosid của tinh bột, của agar,
carrageennan, chitin vv… trong khi đó enzyme protease chỉ xúc tác thủy phân cắt
đứt các liên kết peptid mà không xúc tác để cắt được liên kết glucosid.
Do là chất xúc tác đặc biệt, có nhiều ưu việt hơn so với các chất xúc tác
khác nên enzyme đang được nghiên cứu và ứng dụng rất mạnh mẽ trong đời sống
con người.
Enzyme bao gồm hai loại là enzyme một thành phần và enzyme hai thành
phần. Enzyme một thành phần (apoenzyme) là enzyme khi bị thủy phân thì sản
phẩm của quá trình thủy phân chỉ bao gồm các acid amin. Enzyme hai thành phần,
phân tử enzyme gồm phần protein (apoenzyme) kết hợp với nhóm khác không
phải protein gọi là nhóm ngoại hay coenzyme. Apoenzyme quyết định tính đặc
hiệu cao của enzyme và làm tăng hoạt tính xúc tác của coenzyme. Coenzyme
quyết định kiểu phản ứng mà enzyme xác tác, trực tiếp tham gia phản ứng và làm
tăng độ bền của apoenzyme đối với các yếu tố gây biến tính [4].
Tính chất của enzyme: Bản chất của enzyme là protein nên enzyme không
bền với nhiệt. Dưới tác dụng của nhiệt độ cao, enzyme bị biến tính mất khả năng
xúc tác. Môi trường acid, kiềm mạnh hay muối kim loại nặng cũng làm mất hoạt
tính của enzyme.
Enzyme có hai dạng biến tính là biến tính thuận nghịch và không thuận
nghịch. Nếu bị biến tính thuận nghịch, enzyme có khả năng phục hồi lại khả năng
xúc tác khi loại bỏ các tác nhân gây biến tính. Khi bị biến tính không thuận
nghịch, enzyme không thể phục hồi lại khả năng xúc tác khi loại bỏ các tác nhân
gây biến tính.
Do có kích thước lớn nên enzyme không đi qua màng bán thấm. Đây cũng
là một tính chất mà người ta sử dụng để tinh sạch enzyme.

do sự phối hợp giữa các nhóm chức tự do của acid amin. Ví dụ: nhóm SH
(sunfidryl) của cystein, nhóm NH
2
(amin) của lysin, nhóm OH (hydroxyl) của
serin, treonin, tyrosin, nhóm COOH (cacboxyl) của aspactic, glutamic, vòng
imidazol của histidin, indol của triptophan, guanilic của arginin.
Enzyme hai thành phần, trung tâm hoạt động của enzyme được hình thành
ngoài các nhóm chức của các acid amin còn có sự tham gia của coenzyme. Ví dụ:
vitamin, ion kim loại vv…
Yêu cầu của phản ứng hóa học xảy ra là các chất tham gia phản ứng phải va
chạm với nhau tại vị trí xảy ra phản ứng và các chất trên phải ở trạng thái hoạt
động tức là đã được hoạt hóa. Để hoạt hóa các phân tử thì cần cung cấp năng
lượng cho chúng, năng lượng này gọi là năng lượng hoạt hóa. 11Các chất xúc tác nói chung đều có khả năng làm giảm năng lượng hoạt hóa
mà phản ứng đòi hỏi bằng cách tiến hành qua các phản ứng tạo phức trung gian.
Qua đó tổng số năng lượng hoạt hóa của chúng sẽ nhỏ hơn so với trường hợp
không có chất xúc tác. Năng lượng hoạt hóa thường nhỏ đối với xúc tác bằng
enzyme và nhỏ hơn cả trường hợp có các chất xúc tác thông thường.
Ví dụ: Trong phản ứng thủy phân H
2
O
2
tạo thành H
2
O và O

giải phóng enzyme ở dạng tự do. Tốc độ phản ứng thủy phân tỷ lệ với nồng độ của
phức chất trung gian vì vậy nồng độ cơ chất có ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ của 12phản ứng có enzyme xúc tác. Theo phương trình Michaelis-Menten, khi nồng độ
cơ chất rất thấp vận tốc phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ
chất đã đủ lớn, nếu tăng lượng cơ chất vận tốc phản ứng sẽ không tăng.
Ảnh hưởng của các chất hoạt hóa: Các chất hoạt hóa có thể làm tăng hoạt
độ của enzyme có thể theo các cách khác nhau. Chúng có thể loại trừ các chất kìm
hãm ra khỏi phản ứng hoặc tác dụng trực tiếp vào trung tâm hoạt động của enzyme
hoặc làm biến đổi cấu hình không gian của enzyme tạo thuận lợi cho quá trình xúc
tác.
Ảnh hưởng của các chất kìm hãm: Vì enzyme có bản chất là protein nên
tất cả các yếu tố làm biến tính protein đều là các yếu tố kìm hãm hoạt động của
enzyme. Ngoài ra còn các yếu tố kìm hãm khác tuy không trực tiếp làm biến tính
protein nhưng có thể thế chỗ cơ chất, kết hợp vào ngay trung tâm hoạt động của
enzyme tạo thành phức chất trung gian (chất kìm hãm cạnh tranh) hoặc kết hợp
vào một vị trí nào đó của enzyme, làm thay đổi cấu trúc không gian của enzyme
theo chiều hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác (chất kìm hãm không cạnh
tranh). Có những trường hợp sản phẩm phản ứng hay dư thừa cơ chất cũng làm
kìm hãm phản ứng.
Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nhiệt độ là yếu tố quan trọng, ảnh hưởng trực
tiếp tới vận tốc phản ứng của enzyme. Nhiệt độ càng tăng thì vận tốc của phản ứng
có xúc tác enzyme càng tăng. Nhưng vì enzyme có bản chất protein nên nhiệt độ
chỉ tăng đến một mức độ giới hạn. Nếu vượt quá giới hạn này thì phản ứng sẽ
giảm hoặc dừng lại do bản thân enzyme bị biến tính. Nhiệt độ mà ở đó tốc độ phản
ứng đạt cực đại gọi là nhiệt độ tối thích.

làm sạch cho mọi enzyme. Khi nghiên cứu một loại enzyme cụ thể cần phải có
thực nghiệm để xác định phương pháp tách chiết và tinh sạch phù hợp nhất. Việc
phân tách và làm sạch enzyme rất phức tạp do lượng enzyme chiếm một tỉ lệ rất
nhỏ, luôn tồn tại đồng thời với các loại protein khác có tính chất hóa lý tương tự
như enzyme. Ngoài ra enzyme bản chất là protein nên cũng rất dễ biến tính, mất
khả năng xúc tác khi bị tác động bởi các yếu tố bên ngoài.
Trong các nguồn thu nhận enzyme, để thu enzyme từ thực vật người ta
thường chọn dung môi thích hợp để chiết rút enzyme ra khỏi nguyên liệu. Enzyme
từ vi sinh vật tồn tại ở hai dạng: enzyme ngoại bào là enzyme được tiết ra môi
trường bên ngoài và enzyme nội bào tồn tại bên trong tế bào. Enzyme ngoại bào
có thể dùng dung môi chiết ngay ra được. Đối với dạng enzyme nội bào, để tách
chiết dạng enzyme này trước hết phải phá vỡ cấu trúc tế bào bằng các biện pháp cơ
học như xay, nghiền. Tiếp đó enzyme được chiết ra bằng các dung môi thích hợp
như nước cất, các dung dịch đệm, dung dịch muối sinh lý vv…
Dịch chiết chứa không chỉ có enzyme mà còn có các protein tạp và các tạp
chất khác. Để tách các tạp chất làm tăng độ sạch, tinh khiết của enzyme phải sử
dụng kết hợp nhiều phương pháp khác nhau. Đối với muối, các tạp chất có phân tử
lượng thấp thường dùng biện pháp thẩm tích hoặc lọc qua cột gel sephadex. Để
loại các protein tạp và các tạp chất có phân tử lượng cao thường dùng kết hợp
nhiều biện pháp khác nhau : Phương pháp biến tính chọn lọc dưới tác dụng của
nhiệt độ hay pH môi trường: phương pháp này thích hợp đối với loại enzyme có
tính bền nhiệt hoặc bền acid. Giữ dịch chứa enzyme ở nhiệt độ cao 50 – 70
0
C hoặc
pH = 5 trong thời gian xác định các protein tạp bị biến tính và được loại bỏ bằng
lọc hay ly tâm. 14


aminoacid thì những acid amin có phần xúc tác mang trình tự acid amin tương tự
nhau sẽ được xếp vào cùng một họ. Nguyên lý cơ sở của sự phân loại này đó là
trình tự và cấu trúc của enzyme luôn có liên quan với nhau, trình tự aminoacid
chứa đựng những thông tin về cấu trúc và cơ chế phản ứng. Ngoài ra, trong hệ
thống enzyme glycosyhydrolase cũng xuất hiện một số enzyme có trình tự amino
acid tương tự nhau mà có khả năng phân giải những cơ chất khác nhau. Những họ
này chiếm 1/3 số lượng họ enzyme trong hệ thống enzyme glycosyhydrolasa. 15Hệ thống enzyme thủy phân được tìm thấy ở vi sinh vật, thực vật và động
vật. Hệ thống này hoạt động đòi hỏi sự tham gia của một chuỗi enzyme và các
protein liên kết phân giải Chitin. Ví dụ như ở chủng Serratia marcescens trong đất
sinh tổng hợp 5 protein có liên quan đến sự phân giải Chitin. [26]
Những enzyme họ 18 có ở phần lớn các loài sinh vật từ nhân sơ đến nhân
chuẩn (vi khuẩn, nấm, và động vật). Trong khi đó những enzyme họ 19 chỉ có ở
thực vật bậc cao là vi khuẩn Gram dương, Streptomyces.
Hai họ enzyme này đều gồm:
- EndoChitinase: enzyme phân cắt một cách ngẫu nhiên chuỗi Chitin.
- ExoChitinase: phân cắt Chitobiase [(NAG)
2
)] bởi enzyme Chitobiosidase;
hoặc phân cắt Chitotriose [(NAG)
3
)] bởi enzyme Chitotriodase, từ các đầu tận
cùng của chuỗi Chitin [23].
- Ngoài endoChitinase và exoChitinase, sinh vật phân giải còn có
Chitobiase, enzyme thủy phân Chitin hạng 3 nhằm biến đổi dimer NAG thành các


Lasobacter. Vi khuẩn Gr
–
sản xuất Chitinase một cách phổ biến. Chitinase của
Serratia marcescens gồm có 3 loại: ChiA, ChiB, ChiC đều chứa một vùng xúc tác
đặc trưng cho họ enzyme 18. Thêm vào đó mỗi enzyme chứa các vùng liên kết với
cơ chất. Chuỗi thẳng hàng của các vùng xúc tác được đặc trưng bởi xảy ra một số
lượng tương đối lớn quá trình gắn và tách chậm. Một số đặc điểm này liên quan
đến sự biến đổi trong cấu trúc và vị trí của vùng ngoài.
Enzyme thứ tư liên quan đến phân giải Chitin và Chitobiase khối lượng
phân tử là 95 kD, thuộc họ 20 của glycosyl hydrolase. Chitobiase chứa bốn vùng
xúc tác, một vài trong số đó chưa biết rõ chức năng. Vùng xúc tác giống toàn bộ
nếp gấp như Chitinase họ 18. Nhưng cấu trúc vị trí hoạt động là khác nhau. Dựa
trên sự cảm ứng với Chitin. S.marcescens sản xuất protein liên kết Chitin nhưng
không phải enzyme hoạt động. Các chủng S.marcescens thủy phân Chitin kháng
lại với nấm gây bệnh như: Botrytis spp, B.cinerea, Rhizostonia solani, Fusarium
oxysporum, Sclerotinia minor.
Gen mã hóa ChiA, ChiB từ S.marcescens được chuyển vào các chủng vi
khuẩn khác như Pseudomonas flurescens và E.coli nhằm tận dụng khả năng hạn
chế nấm gây bệnh thực vật, hoặc để tạo ra chất điều chỉnh sinh học mới. Hơn nữa
ChiA đã cho thấy khả năng giảm bệnh gây ra bởi Sclerotium rolfsii ở cây đậu và
Rhizotonia solani ở cây bông.
Vi khuẩn trong môi trường nước biển Aeromonas hydrophila sản xuất
ChiA. Vi khuẩn trong đất theo họ Bacillus sản xuất Chitinase trọng lượng phân tử
25-29 kDa. Ba đồng dạng của Chitinase (L, M, S) được tinh chế từ vi khuẩn ưa
nhiệt Bacillus sp. Thu được exochitinase chịu nhiệt từ B.steraothermopholus phân
lập từ phân compost chứa phế thải tôm của trong nông nghiệp. Phân lập bốn dạng
Chitinase chịu nhiệt từ B.licheniformis -70. B.circulant từ đất cũng sinh Chitinase.
Flavobacterium sp. sản xuất Chitinase 30 kDa. Alteromonas sinh Chitinase 87
kDa. Chitinase phổ rộng trọng lượng 25 kDa được tinh sạch từ B.subtilis DC121,

Hình 6: Cơ chế tác động của enzyme thủy phân Chitin
IM: Màng trong (Inner membrain)
OM: Màng ngoài (Outer membrain)
Nói chung, sự phân giải Chitin của các vi sinh vật đều bắt nguồn từ sự tiết
enzyme depolymease {EC 3.2.1.14; poly[1,4-(N-acetyl-D-glucosaminide)]}
glycanohydrolaza để phân giải chitin thành các chất GlcNAc, chitobiose và
chitooligosaccharit (hình 6). Sau đó, những chất này sẽ đi vào vùng chu chất – nơi
mà chitodextrinaza (EC 3.2.1.14) và N-acetylglucosamindaza (EC 3.2.1.52;
acetyl-D-hexosaminide N-acetylhexosaminohydroase) hoạt động để tạo 18thành các chất GlcNAc và chitobioza. Khi vào tới tế bào chất, GlcNAc và
chitobioza sẽ tham gia vào quá trình trao đổi chất hoặc bị biến đổi. Dựa vào đặc
điểm hoạt động của mỗi loại enzyme mà có thể khai thác chúng để sản xuất những
hợp chất có nguồn gốc từ Chitin nhằm thu lại lợi ích thực tiễn.
1.4. CÁC NGHIÊN CỨU VỀ CHITINASE
1.4.1. Các công trình nghiên cứu ngoài nước.
Theo nghiên cứu của Masaru Mitsutomi (1997) đã nghiên cứu chitinase 19
(chitinase C-1) được chiết rút từ vi khuẩn streptomyces griseus HUT 6037.
Enzyme chitinase C-1 là enzyme loại endo có thể cắt đứt được liên kết beta- 1,4-
N-acetylglucosaminidic và liên kết beta-1,4-glucosaminidic trong khi chitinase
chiết rút từ các loại vi sinh vật khác chỉ có thể cắt đứt được liên kết beta- 1,4- N-
acetylglucosaminidic của chitin. Chitinase thu được từ dịch chiết được tinh sạch
bằng sắc ký cho 2 enzyme chitinase C-1 và C-2 có khối lượng phân tử đều bằng 27
kDa, có điểm đẳng điện lần lượt 7.7 và 7.3. Chitinase C-1, C-2 có khoảng pH thích
hợp 4.5 đến 6 và bền trong khoảng pH rất rộng từ 6.5 đến 10. chitinase thu được
có khả năng thủy phân chitin, colloidal chitin, glycol chitin, cacboxymethyl chitin,

học thấp, nhiều tạp chất.
Trần Thị Luyến, Lê Thị Tưởng, Đặng Trung Thành, Nguyễn Ngọc Anh
(2007), bước đầu nghiên cứu sản xuất COS (chitoolygosaccharide) từ chitin,
chitosan bằng enzyme Hemicellulase thương mại, enzyme chitinase từ lá khoai
lang, enzyme papain từ đu đủ, enzyme cellulase từ xạ khuẩn.
Trang Sĩ Trung (2005), nghiên cứu ứng dụng chitosan làm chậm quá trình
phân rã của thức ăn tôm trong môi trường ao nuôi.
Một số nghiên cứu đã được triển khai như:Nghiên cứu thử nghiệm thu nhận
chế phẩm enzyme chitinase kỹ thuật từ Streptomyces griceus. Nghiên cứu enzyme
chitinase từ nấm mốc Trichoderma harzianum và ứng dụng chúng trong một số
lĩnh vực đời sống.
Năm 1999, Đinh Duy Kháng, Nông Văn Hải, Trương Nam Hải, Chikafusa
Fukazawa đã nghiên cứu tinh chế và xác định tính chất của chitinase từ đậu tương
(Báo cáo Khoa học Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, Hà Nội). Cũng trong
năm 1999, Nguyễn Thị Thu Trang, Nguyễn Lân Dũng đã nghiên cứu khả năng
sinh tổng hợp chitinase của chủng vi khuẩn Bacillus Q3 có hoạt tính kháng nấm
cao. Trong nghiên cứu đã phân lập được 22 chủng vi khuẩn có khả năng phân giải
chitin từ mẫu đất nông nghiệp lấy ở Hà Nội và tỉnh Thái Bình, Hoà Bình. Trong số
22 chủng này, có chủng Bacillus Q3 có hoạt tính chitinase và có khả năng sử dụng
chitinase để ức chế mạnh mẽ nhiều chủng nấm gây bệnh thực vật (Aspergillus
VN04-460; Trichoderma VN04-412; Eurotium amstelodami; Eurotium chevalieri;
Fusarium oxysporum).
Năm 2001, Đinh Minh Hiệp, Đại học Khoa học Tự nhiên đã nghiên cứu thu
nhận chitinase từ nấm mật Coprinus Fimentarius và các đặc tính của nó.
20

21Chương 2. ĐỐI TƯỢNG-VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU

2.1. ĐỐI T ƯỢNG VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU
2.1.1. Đối tượng
Chủng vi khuẩn dùng trong nghiên cứu được tuyển chọn từ nhiều chủng vi
sinh vật phân lập từ các mẫu đất trong đảo, vùng ven bờ biển thuộc Khánh Hoà:
Hồ cá Trí Nguyên, hòn Một, suối nước nóng Ninh Hoà, Trường Xuân - Ninh Hoà,
hòn Chồng, bãi Dương, trại nuôi trồng thuỷ sản - Cam Ranh.
2.1.2. Vật liệu
1) Hoá chất
 Các hóa chất thông thường: pepton, Chitin, cao men, thạch (agar), thuốc
thử lugol và hoá chất khác.
 Dụng cụ chủ yếu:
- Máy lắc thường và máy lắc ổn nhiệt (Nhật)
- Tủ ấm (CHLB Đức)
- Tủ sấy (CHLB Đức)
- Nồi hấp thanh trùng (Trung Quốc)
- Tủ cấy vô trùng (Việt Nam)
- Tủ lạnh DaeWoo ( Hàn Quốc)