Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
LỜI CẢM ƠN
Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn
đến TS. Đoàn Văn Thược – giảng viên Bộ môn Công nghệ Sinh học – Vi sinh,
Khoa Sinh học, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội – người đã tận tâm hướng dẫn,
giúp đỡ và động viên tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Sinh
học – Vi sinh, Khoa Sinh học,Trường Đại học Sư phạm Hà Nội đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới chị Dung, chị Bình, các anh chị cao
học, bạn Vóc, bạn Ninh, các bạn, các em sinh viên đang làm thí nghiệm tại bộ
môn và người thân, những người đã động viên, khích lệ tôi rất nhiều trong
thời gian vừa qua.
Tôi xin trân trọng cảm ơn !
Hà Nội, tháng 10 năm 2013
Người viết
Vũ Hồng Vân
1
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
MỤC LỤC
2
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CÁC TỪ VIẾT TẮT TRONG KHÓA LUẬN
CDW (cell dry weight) : Khối lượng tế bào khô
HA : Hydroxyalkanoate-Đơn phân cấu tạo nên PHA
mcl (medium-chain-length) : Mạch trung bình
OD (Optical Density) : Mật độ quang
PHA : Polyhydroxyalkanoate
PhaC : PHA synthase
PhaP : Phasin protein
PhaR : Protein điều hòa quá trình sinh tổng hợp PHA
tích lũy PHA xảy ra khi môi trường sống của vi sinh vật dư thừa nguồn cacbon và
thiếu một nguyên tố dinh dưỡng nào đó như O, N, P, S hay Mg [28, 29]. Có khoảng
hơn 150 loại PHA khác nhau, mỗi loại có những tính chất đặc trưng riêng phù hợp
với các hướng ứng dụng khác nhau trong nông nghiệp, công nghiệp và y tế, Trong
đó có 2 loại PHA là poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) và poly (hydroxybutyrate-co-
hydroxyvalerate) (PHBV) đang được sản xuất và ứng dụng trên quy mô công nghiệp
[28, 29].
Điểm hạn chế ảnh hưởng đến tiềm năng ứng dụng của PHA là giá thành của
PHA đắt hơn so với các loại plastic có nguồn gốc từ mỏ đang sử dụng hiện nay. Rất
nhiều yếu tố có khả năng ảnh hưởng đến giá cả của PHA, ví dụ như: hiệu suất sản
xuất PHA, hàm lượng PHA tích lũy trong tế bào, hiệu suất chuyển hóa nguồn
cacbon thành PHA, giá của các nguyên liệu dùng trong lên men, và giá của quy
trình tách chiết, tinh sạch PHA [14]. Chính vì vậy việc lựa chọn chủng dùng cho sản
xuất PHA trên qui mô công nghiệp cần phải chú ý đến nhiều yếu tố. Ví dụ như khả
4
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
năng sử dụng các nguồn cacbon rẻ tiền, tốc độ sinh trưởng và tốc độ tổng hợp PHA,
hàm lượng PHA có khả năng tích lũy trong tế bào [14].
Sản xuất nguồn nhiên liệu sinh học trong đó có diesel sinh học nhằm thay thế
dầu mỏ trong lĩnh vực nhiên liệu đang là một định hướng phát triển của các nước
trên thế giới. Quá trình sản xuất diesel sinh học sẽ tạo ra một lượng glycerol khá lớn
(khoảng 10% (w/w)) [15]. Cùng với sự phát triển của ngành sản xuất diesel sinh
học thì lượng glycerol tạo ra ngày càng nhiều. Làm thế nào để sử dụng hiệu quả
nguồn glycerol này là một câu hỏi mà nhiều nhà khoa học đang đi tìm câu trả lời.
Một trong những hướng nghiên cứu hiện nay là chuyển hóa glycerol thành
polyhydroxyalkanoate.
Với những lý do trên,chúng tôi đã tiến hành đề tài “Nghiên cứu chuyển hóa
glycerol thành polyhydroxyalkanoate (PHA) nhờ một số chủng vi khuẩn phân lập từ
đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh”
Mục tiêu
1 Poly(3-hydroxybutyrate) P(3HB)
C
2
H
5
1 Poly(3-hydroxyvalerate P(3HV)
C
3
H
7
1 Poly(3-hydroxyhexanoate) P(3HHx)
H 2 Poly(4-hydroxybutyrate) P(4HB)
CH
3
2 Poly(4-hydroxyvalerate) P(4HV)
1.1.1 Sinh tổng hợp PHA trong tế bào vi khuẩn
PHA được tổng hợp bởi rất nhiều cơ thể sống, trong đó vi khuẩn và thực vật là
hai đối tượng đáng quan tâm nhất. Tế bào thực vật có thể tổng hợp PHA từ nguồn
carbon là CO
2
tuy nhiên hàm lượng PHA tích lũy được là rất thấp (nhỏ hơn 10%
khối lượng tế bào khô). Trong một số trường hợp, thực vật tích lũy hàm lượng PHA
cao (từ 10-40% khối lượng tế bào khô) nhưng điều này lại gây ảnh hưởng xấu tới sự
sinh trưởng và phát triển của chúng và hiện tại các nhà khoa học vẫn chưa tìm ra
biện pháp nào để khắc phục nhược điểm này. Trong tế bào vi khuẩn thì PHA có thể
tích lũy tới 90% khối lượng khô của tế bào [30].
6
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Tích lũy PHA là cách thức tự nhiên mà vi khuẩn sử dụng để dự trữ carbon và
năng lượng khi hàm lượng các nguyên tố dinh dưỡng trong môi trường sống mất
synthease (PhaC), protein phasing (PhaP), enzyme PHA depolymerase (PhaZ),
protein điều hòa (PhaR) và một số protein khác chưa rõ chức năng [28] (hình 1.4).
Kích thước của hạt PHA tăng lên khi enzyme PHA synthase không ngừng tiếp xúc
để liên kết các monomer có trong tế bào chất, làm mạch polyester dài ra. Khi tích
lũy PHA đạt đến cực đại, các hạt PHA sẽ choán hết thể tích bên trong tế bào [28].
Ngoài con đường tổng hợp trong các cơ thể sống, PHA cũng có thể được
tổng hợp bằng con đường hóa học. Con đường sinh tổng hợp tạo ra các polymer có
khối lượng phân tử lớn hơn so với polymer tạo ra từ con đường tổng hợp hóa học,
tuy nhiên trong con đường tổng hợp sinh học chúng ta khó có thể điều khiển các
monomer cấu trúc tham gia kiến tạo PHA vì điều này được quy định bởi loại PHA
synthase đặc trưng của tế bào [13].
1.1.2 Phân loại và tích chất của PHA
PHA có thể là polymer của một loại monomer hoặc của hai hoặc nhiều loại
monomer. PHA được chia thành hai nhóm phụ thuộc vào số lượng các phân tử
carbon có trong các đơn phân monomer: những PHA dạng mạch ngắn (scl-PHAs)
có khoảng 3-5 phân tử carbon trong một monomer, những PHA dạng mạch trung
8
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
bình (mcl-PHAs) có khoảng 6-16 phân tử các bon trong một monomer. PHA mạch
ngắn có tính chất giống với các loại plastic thông thường (giòn và cứng), trong khi
đó các PHA có mạch trung bình mềm dẻo, có nhiệt độ sôi và hàm lượng tinh thể
thấp, có khả năng đàn hồi [22]. Một số vi khuẩn có khả năng tổng hợp PHA có chứa
cả hai loại mạch ngắn và mạch trung bình [22].
PHA có thể được trùng hợp từ một loại monomer hoặc được đồng trùng hợp
từ hai hay nhiều loại monomer. Dựa theo cách trùng hợp có hai loại polymer là
homopolymer (đồng polymer) và heteropolymer (dị polymer) hay polymer hỗn hợp
(co-polymer). Homopolymer điển hình là polyhydroxybutyrate (PHB) được tổng hợp
từ một loại monomer duy nhất là hydroxybutyrate. Trong điều kiện môi trường thiếu
hụt các yếu tố dinh dưỡng và dư thừa carbon, tế bào vi khuẩn thường chuyển hóa
nguồn carbon thành monomer 3-hydroxybutyrate (3HB) và tổng hợp nên PHB [15].
)
(1)
Tinh thể hóa
(%)
(2)
Độ đàn hồi
(MPa)
(3)
P(3HB) 175-179 60-80 40
P(4HB) 53 34 104
P(3HB-co-3 mol% 3HV) 169-170 69 38
P(3HB-co-14 mol% 3HV) 150 56 35
P(3HB-co-20 mol% 3HV) 145 50 32
P(3HB-co-25 mol% 3HV) 137 40 30
P(3HB-co-16 mol% 4HB) 150 45 26
P(3HB-co-64 mol% 4HB) 50 15 17
P(3HB-co-90 mol% 4HB) 50 28 65
P(3HB-co-6 mol% 3HA) 133 45 17
P(3HB-co-10 mol% 3HHx) 127 34 21
P(3HO-co-11 mol% 3HHx) 61 30 10
Polypropylene 176 50-70 34.5-38
Ghi chú:
(1)
T
m
(melting temperature) : nhiệt độ mà ở đó polymer chuyển từ
trạng thái rắn sang trạng thái lỏng.
(2)
Crystallinity: là tỷ lệ tinh thể có trong toàn bộ
mẫu polymer (polymer = tinh thể + chất vô định hình).
trọng trong ngành y tế, ví dụ các sản phẩm như chỉ phẫu thuật, đĩa xương, ống ghép
mạch, van tim đều có thể làm từ PHA [6]. Một trong những ứng dụng đặc biệt của
PHBHV trong ngành nông nghiệp là sự giải phóng một cách có kiểm soát của thuốc
diệt côn trùng. Thuốc diệt côn trùng được tổ hợp với các hạt PHBHV và được gieo
cùng với hạt cây trồng. Thuốc diệt côn trùng có thể được giải phóng với một tỷ lệ
nhất định phụ thuộc vào mức độ hoạt động của dịch hại tính từ khi vi khuẩn phá vỡ
chuỗi polymer bị tác động bởi điều kiện môi trường tương tự như điều kiện môi
trường đã tác động lên các dịch hại sống trong đất [22],[30].
Những ưu điểm của polymer sinh học so với các loại nhựa thông thường
trong việc hạn chế ô nhiễm môi trường là không thể phủ nhận, tuy nhiên do giá
thành hiện tại của PHA đắt hơn khá nhiều so với giá của plastic có nguồn gốc từ dầu
mỏ đang sử dụng hiện nay nên việc ứng dụng rộng rãi sản phẩm từ PHA vào đời
sống vấp phải nhiều khó khăn. Các nhà khoa học đang nỗ lực nghiên cứu nhằm
giảm giá thành của PHA, trong đó các hướng nghiên cứu chủ yếu là: tìm ra các
chủng vi sinh vật mới có khả năng tích lũy PHA mạnh, tạo ra sản lượng PHA lớn
khi lên men trên các nguồn cơ chất rẻ tiền hoặc tái sử dụng các nguồn phế, phụ
phẩm công nghiệp và nông nghiệp, tối ưu hóa quy trình sản xuất và quy trình tách
chiết, tinh sạch để đạt được hiệu suất cao hay tạo ra các dòng sinh vật chuyển gen
có khả năng sinh trưởng, phát triển tốt và tích lũy PHA với hàm lượng cao [Error:
Reference source not found].
Việt Nam cũng là một trong số các quốc gia trên thế giới đang phải đối mặt
với vấn nạn ô nhiễm môi trường do việc sử dụng tràn lan các sản phẩm nhựa không
phân hủy, đặc biệt là túi nilon và các sản phẩm đồ gia dụng. Theo kết quả điều tra
11
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
khảo sát của Cục kiểm soát ô nhiễm năm 2010 đối với 263 người tại 5 tỉnh/thành
phố đại diện cho 3 vùng miền của Việt Nam cho thấy: gần 50% số hộ sử dụng 8 bao
bì nilon trở lên trong một ngày, trong đó 35,1% số hộ sử dụng trên 10 bao bì/ngày.
Trung bình mỗi hộ sử dụng 223 bao bì/tháng (khoảng 7,5 bao bì/hộ/ngày), tương
đương 1kg bao bì nilon/hộ/tháng, trong đó 98,7% là bao bì nilon không tự phân hủy
3
)], là một chất không màu, không mùi, nhớt. Glycerol có ba nhóm hydroxyl
nên có khả năng hòa tan trong nước và hút ẩm tự nhiên. Glycerol có vị ngọt và
thường được coi là không độc hại. Glycerol là một sản phẩm phụ của quá trình sản
xuất dầu diesel sinh học.
Hình 1.3 Công thức cấu tạo của Glycerol
1.3.1 Tình hình sản xuất glycerol trên thế giới và ở Việt Nam
Sự gia tăng đáng kể trong nhu cầu vận chuyển nhiên liệu và vấn đề ô nhiễm
môi trường ngày càng trầm trọng, cùng với suy giảm dự trữ dầu thô là nguyên nhân
hướng tới tăng sự tập trung vào năng lượng tái tạo. Dầu diesel sinh học - một trong
những lựa chọn đầy hứa hẹn về nhiên liệu tái tạo. Mặc dù sản xuất dầu diesel sinh
học trên thế giới đã được dự kiến sẽ đạt công suất cao nhưng trên thực tế nó ít hơn
so với mục tiêu đề ra và tăng với tốc độ chậm hơn. Lý do chính là chi phí sản xuất
dầu diesel tương đối cao, tái sử dụng các sản phẩm phụ như glycerol trong quá trình
này đang là một trong những lựa chọn đầy hứa hẹn cho việc giảm chi phí sản xuất.
Sản xuất dầu diesel sinh học sẽ tạo ra khoảng 10% (w/w) glycerol. Nói cách khác,
mỗi gallon (tương đương ~ 4,4L) dầu diesel sinh học sản xuất tạo ra khoảng 1,05
pound (~0,476 kg) glycerol. Điều này cho thấy mỗi năm nhà máy sẽ tạo ra 30 triệu
gallon (~ 132 triệu L) dầu diesel sinh học khoảng 11.500 tấn glycerol tinh khiết
99,9% [15].
Hiện nay, ở nước ta có rất nhiều cơ sở sản xuất sử dụng dầu mỡ động thực
vật làm nhiên liệu sinh học (biodiesel), ước tính lên tới 60.000 tấn/năm trong vài
năm tới. Trong đó, sản phẩm phụ của quá trình này là glycerol thô, trong vài năm
tới sản lượng glycerol thô ở nước ta đạt khoảng 6.000 tấn. Nhưng các cơ sở sản xuất
nhiên liệu sinh học lại chưa có phương án sử dụng nguồn sản phẩm phụ này ngoài
việc làm chất đốt hoặc bán với giá 4.000đ/lít. Điều này sẽ rất lãng phí bởi hiện tại,
giá glycerol tinh chế 98% dao động trong khoảng 35.000-40.000đ/lít và nước ta
13
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
thành phần thức ăn cho động vật đã được biết đến từ những năm 1970. Glyxerol
14
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
được bổ sung trong khẩu phần ăn của động vật không nhai lại có tỷ lệ hấp thụ cao.
Sau khi hấp thụ, nó có thể được chuyển đổi thành glucose sản xuất năng lượng
trong gan động vật bằng các enzyme glycerol kinase. Các phương pháp điều chỉnh
chế độ ăn uống có bổ sung glycerol không có ảnh hưởng đáng kể về chất lượng thịt.
Khi glyxerol thô đã được thêm vào khẩu phần ăn của heo con cai sữa, tại mức 10%
hiệu suất thức ăn được nâng cao. Glyxerol thêm vào lên đến 15% chất khô trong
chế độ ăn của con cừu có thể cải thiện hiệu suất vỗ béo, đặc biệt là trong 14 ngày
đầu tiên. Glycerol tinh khiết được bổ sung lên tới 15% trong khẩu phần chất khô
của bò đang cho sữa không có tác hại về lượng thức ăn, khả năng sản xuất sữa và
năng suất của chúng [15].
Glycerol còn được sử dụng trong y tế, dược phẩm và chăm sóc cá nhân: chủ
yếu được dùng như một chất làm trơn và chất giữ ẩm. Nó cũng được dùng trong
chất miễn dịch dị ứng, si rô trị ho, kem đánh răng, nước súc miệng, các sản phẩm
chăm sóc da, kem cạo râu, các sản phẩm dưỡng tóc, xà phòng. Glycerol tinh khiết
hoặc gần như tinh khiết là một phương pháp điều trị hiệu quả cho bệnh vẩy nến,
bỏng, vết cắn, vết cắt, phát ban và cả những cục chai.
Chất chống đông: Giống ethylene glycol và propylene glycol, glycerol hình
thành liên kết hydro mạnh đối với các phân tử nước, làm giảm đi liên kết hydro giữa
các phân tử nước với nhau. Nhiệt độ đông đặc thấp nhất có thể đạt được vào khoảng
-37.8
o
C tương ứng với 60-70% glycerol trong nước.
Hóa chất trung gian: Glycerol được sử dụng để sản xuất nitroglycerine hoặc
glycerol trinitrate (GTN) là một thành phần thiết yếu của thuốc súng không khói và
một số loại thuốc nổ khác GNT còn được dùng trong một số loại thuốc chống tức
ngực.
Sản xuất PHA: Glycerol có thể thay thế carbohydrate truyền thống trong sản
17
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
carbon là glycerol .
Trước tiên, Glycerol đi vào tế bào vi khuẩn bằng một quá trình khuếch tán thụ
động được xúc tác bởi một protein tách rời màng tế bào [32]. Dưới tác động của
enzyme glycerol kinase, glycerol sẽ chuyển đổi thành glycerol-3-phosphate, sau đó bị
oxi hóa bởi enzyme glycerol-3-phosphate dehydrogenase tạo ra dihydroxyaceton
phosphate. Dihydroxyaceton phosphate sẽ đi vào quá trình đường phân để tạo ra
pyruvate. Các pyruvate này bị oxi hóa dưới tác dụng của enzyme pyruvate
dehydrogenase để tạo ra Acetyl-CoA sử dụng cho quá trình tích lũy PHB của vi khuẩn.
18
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
2.1.1 Đối tượng
Các chủng vi khuẩn được phân lập từ đất rừng ngập mặn ở huyện Yên Hưng,
tỉnh Quảng Ninh. Các chủng vi khuẩn này được lưu giữ trong bộ sưu tập giống vi
sinh vật rừng ngập mặn tại Bộ môn CNSH – Vi sinh, khoa Sinh học, trường Đại học
Sư phạm Hà Nội.
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất pha chế môi trường (bảng 2.1) và một số hóa chất khác: ethanol
(Merck, Đức), methanol (Merck), chloroform (Merck, Đức), H
2
SO
4
(Merck, Đức),
glycerol,
Bảng 2.1: Công thức của các loại môi trường sử dụng trong nghiên cứu
STT Thành phần
Môi trường hoạt
4
- 0.25
7
Pepton
5 -
8
Cao nấm men
- 2
10
Glycerol
- 20
11 Cao thịt 5 -
Ghi chú: Các thành phần môi trường được hòa tan trong 1000ml nước cất, pH
của môi trường được điều chỉnh đến 7 bằng dung dich NaOH 5M và HCl 5M. Môi trường
đặc được bổ sung 2% agar (20 g/l).
2.1.3. Dụng cụ và thiết bị
Tủ ấm, tủ sấy (Binder, Đức); nồi hấp thanh trùng (Tommy, Nhật); máy đo pH
(MP200R, Thụy Sĩ); máy ly tâm (Sorvall, Mỹ), cân phân tích (Pracisa XT 320M,
19
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
Thụy Sỹ), máy lắc ổn nhiệt (BR300LF, Nhật), và các dụng cụ thông dụng khác của
phòng CNSH- Vi Sinh, khoa sinh học, Đại Học Sư Phạm Hà Nội.
2.2. Phương pháp nghiên cứu
2.2.1 Phương pháp thu mẫu [4]
Các mẫu đất được lấy ở lớp đất bề mặt ở các vị trí khác nhau. Mỗi mấu đất lấy
khoảng 30g cho vào túi nilon đã vô trùng, trên túi ghi rõ địa điểm thu mẫu và độ sâu
lấy mẫu. Mẫu được bảo quản trong đá lạnh và chuyển về phòng thí nghiệm, bảo quản ở
nhiệt độ 4-5
o
C và tiến hành phân lập ngay trong 48h.
Nuôi cấy các chủng vi khuẩn giống trên môi trường MPA đặc đến khi mọc
tốt, dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn cho vào eppendorf có chứa sẵn 1ml dịch 15%
glycerol vô trùng, ghi tên chủng vào eppendorf, bọc kín miệng eppendorf bằng
parafilm và giữ trong tủ lạnh -80ºC.
20
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
2.2.4 Phương pháp mô tả hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn [4]
Cấy vi khuẩn theo hình dic dắc trên môi trường MPA đặc, để trong tủ 35
o
C
trong 24h để vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc. Quan sát, lựa chọn các khuẩn lạc mọc
riêng rẽ mô tả các đặc điểm hình thái của khuẩn lạc. Làm tiêu bản nhuộm Gram,
nhuộm đơn, quan sát và mô tả đặc điểm hình thái tế bào của chủng vi khuẩn được
tuyển chọn trên kính hiển vi quang học.
2.2.5 Phương pháp tuyển chọn chủng vi khuẩn có tích lũy PHA bằng thuốc
nhuộm Nile blue A để phát hiện các hạt dự trữ [1].
Chuẩn bị môi trường MPA đặc có bổ sung 0.5µg/ml dung dịch thuốc nhuộm
Nile blue A tan trong DMSO (Dimethylsulfoxide), chia đều môi trường vào các hộp
petri. Cấy chuyển vi khuẩn từ hộp Petri giữ giống sang hộp Petri chứa môi trường
có thuốc nhuộm đã được đánh số tương ứng, đặt các hộp Petri này trong tủ ấm 32-
35
O
C. Sau 24- 48h khi vi khuẩn đã mọc tốt, soi các hộp Petri này dưới tia UV bước
sóng 254nm và quan sát, phát hiện các chủng vi khuẩn phát huỳnh quang màu vàng
cam sáng (bright orange) [25].
2.2.6 Phương pháp lên men thu sinh khối khô của tế bào [7]
Chuẩn bị môi trường MA lỏng theo công thức bảng 2.1, bổ sung 5% (v/v)
giống vi khuẩn đã hoạt hóa 13 -15h vào trong bình tam giác100 chứa 25ml môi
trường trên. Đặt các bình tam giác trong tủ lắc 180 vòng/phút ở nhiệt độ 35
o
2.2.8.1. Hoạt hoá chủng nghiên cứu
Cấy chủng vi khuẩn trên môi trường MPA đặc ở nhiệt độ 35ºC trong 24h, cấy
chuyển sang môi trường MPA lỏng, nuôi trong máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở
nhiệt độ 35ºC trong 13-15h, lúc này chủng vi khuẩn đã được hoạt hóa xong (giống
vi khuẩn) sẵn sàng sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. Các thí nghiệm được lặp
lại 2 lần và lấy kết quả trung bình.
2.2.8.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến sự sinh trưởng
của chủng vi khuẩn được chọn [6]
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn được chọn đã hoạt hóa sau 13-15h vào trong
các bình tam giác chứa 25ml môi trường MA lỏng với các nồng độ NaCl khác nhau
(g/l): 0, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 nuôi trong tủ lắc với tốc độ 180
vòng/phút ở nhiệt độ 35
o
C trong 30h. Thu dịch nuôi cấy, pha loãng 10 lần, đo mật độ
quang (OD) ở bước sóng 600nm. Dựa vào kết quả thu được để đánh giá sự ảnh hưởng
của hàm lượng NaCl đến sự sinh trưởng của chủng vi khuẩn nghiên cứu.
2.2.8.3 Ảnh hưởng của pH [6]
Chuẩn bị môi trường MA lỏng có nồng độ 4% NaCl, 2% (w/v) nguồn carbon
là glycerol và có độ pH khác nhau 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8 . Bổ sung 5% (v/v) giống vi
khuẩn vào các bình tam giác 100 ml chứa 25 ml môi trường trên, nuôi lắc 180
vòng/phút ở nhiệt độ 35ºC trong 30h. Xác định mật độ quang ở bước sóng 600nm
để thấy được sự sinh trưởng và phát triển của chủng tuyển chọn.
22
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
2.2.8.4. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của các nguồn nitơ khác nhau đến sự
sinh trưởng của các chủng vi khuẩn được chọn [Error: Reference source not
found]
Bổ sung 5% (v/v) giống vi khuẩn đã hoạt hóa 13-15h vào trong bình tam giác
chứa 25ml môi trường MA lỏng có nồng độ 40g/l NaCl với các nguồn nitơ khác
nhau (2g/l): cao men, NH
bình tam giác 250ml có chứa 50ml môi trường MPA dạng lỏng, đem nuôi lắc ở
32
o
C - 35
0
C với tốc độ 180 vòng/phút trong 13-15h.
Lên men: Cho toàn bộ giống cấp 1 vào nồi lên men chứa môi trường MA. Nuôi
lắc 24h ở 35
0
C với tốc độ lắc 200 vòng/phút, pH 7.
Trong quá trình lên men: kiểm tra điều chỉnh pH luôn ở giá trị 7, nhiệt độ
luôn ở giá trị 35
o
C trong nồi lên men. Cách 6h thu mẫu 1 lần, ly tâm thu sinh khối,
đo OD kiểm tra mật độ tế bào. Sau 24h, cứ 3h thu sinh khối 1 lần.
23
Khóa luận tốt nghiệp Vũ Hồng Vân
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn
Từ những mẫu đất rừng ngập mặn huyện Yên Hưng, tỉnh Quảng Ninh chúng
tôi đã tiến hành phân lập được hơn 200 chủng vi khuẩn, từ các chủng đó chúng tôi
đã tuyển chọn được 17 chủng vi khuẩn có khả năng tích lũy PHA bằng phương
pháp nhuộm với Nile Blue, ký hiệu lần lượt là 31, 32, 38, 56, 57, 58, 74, 75, 84, 85,
91, 94, 97, 98, 123, 124, 129. Sau đó chúng tôi đã tiến hành làm thí nghiệm nuôi
cấy, lên men, thu sinh khối, thủy phân và sắc ký khí phân tích PHA 17 chủng này
trên môi trường MA có nguồn carbon là glycerol ở 30
o
C và 35
o
C chúng tôi thu được
giảm nhiệt độ môi trường, chính vì vậy người ta thường chọn các chủng phát triển
tốt ở nhiệt độ 35-40
o
C. Chính vì vậy chúng tôi đã lựa chọn 3 chủng 32, 56, 75 để
tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
25
Copyright: Tài liệu đại học ©