1. MỞ ĐẦU
Công nghệ sinh học phát triển mạnh mẽ ở các nước công nghiệp vào những
năm đầu của thập niên 80, còn ở các nước đang phát triển thì chủ yếu từ những năm 90
trở lại đây. Có thể nói, hiện nay công nghệ sinh học được coi là lĩnh vực ưu tiên đầu tư
ở hầu hết các nước trên thế giới. Thành tựu của công nghệ sinh học trong những năm
gần đây đã làm thay đổi hẳn quan niệm của con người về khả năng tác động lên cơ thể
sống để làm ra những sản phẩm cần thiết cho cuộc sống.
Trong 50 năm qua, chọn giống thực vật truyền thống kết hợp với công nghệ
sinh học hiện đại đã góp phần lớn trong việc cải tạo cây trồng và sẽ tiếp tục mang lại
nhiều lợi ích trong tương lai. Theo dự đoán, dân số thế giới sẽ đạt 8 tỷ người vào năm
2010, để nuôi được thêm ba tỷ người trong vòng hai mươi năm tới đòi hỏi có sự tăng
vượt bậc về sản lượng nông nghiệp, một nhiệm vụ cực kỳ lớn.
Công nghệ sinh học thực vật tiếp tục mục tiêu cải tạo cây trồng với những
phương pháp chính xác hơn, cho phép chuyển các gen với những chức năng đã được
thiết kế vào cây trồng. Kỹ thuật di truyền cũng đã được kết hợp với các phương pháp
chọn giống truyền thống trong cải tạo cây trồng. Việc chuyển các gen từ các loài dị
dưỡng đã cung cấp các công cụ đưa các đặc tính mới, chọn lọc vào cây trồng và mở
rộng nguồn gen, vượt xa những gì mà chọn giống truyền thống có thể làm được. Vì
thế, các kỹ thuật công nghệ sinh học mới cùng với chọn giống truyền thống là đòi hỏi
cần thiết để nâng cao sản lượng cây trồng, đáp ứng được nhu cầu của xã hội.
Những khả năng có được đối với chuyển gen giữa các cơ thể sinh vật không cần
quá trình lai hữu tính đã mang lại cho các nhà chọn giống nhiều cơ hội mới để cải thiện
hiệu quả sản xuất và tăng hiệu quả sử dụng của cây trồng. Thực vật với những đặc tính
mới, chẳng hạn như kháng thuốc diệt cỏ, kháng côn trùng, kháng virus đã được tạo ra
bằng việc sử dụng các gen của các sinh vật khác loài. Tuy nhiên, cũng cần nhấn mạnh
rằng công nghệ sinh học hiện đại không thay thế chọn giống truyền thống, chỉ có thể
cải thiện các phương pháp cũ, truyền thống. Sự khác biệt giữa chọn giống truyền thống
và công nghệ sinh học hiện đại không phải là mục tiêu hay quá trình, mà là tốc độ, sự
chính xác, độ tin cậy và phạm vi áp dụng (Sharma & CS., 2005).
Mặc dù công nghệ sinh học hiện đại chủ chốt là kỹ thuật di truyền, tức ADN tái
tổ hợp, nó vẫn bao hàm các kỹ thuật khác nhau như nuôi cấy mô tế bào, vi nhân
bệnh ở ngời.
2.1.1. Gen kháng bệnh hại cây trồng
- Gen kháng virus: Bệnh virus gây hại cây trồng rất nghiêm trọng và là loại bệnh
không chữa đợc bằng việc áp dụng các chất hoá học . Do vậy, việc tạo ra cây trồng
kháng virus là rất quan trọng. Có nhiều phơng thức tạo cây kháng bệnh virus bằng kỹ
thuật chuyển gen: chuyển gen mã hóa protein vỏ, chuyển gen tạo các ribosyme
(enzyme phân giải virus), chuyển các gen đối bản (antisens) với RNA của virus. Các
đối bản này sẽ khoá lại sự sao chép và phiên mã của RNA virus. Trong đó, việc
chuyển gen mã hóa protein vỏ virus tơng đối phổ biến. Virus có cấu tạo gồm phần lõi
là các axit nucleic (DNA, RNA) và phần vỏ là protein. Khi có mặt gen mã hóa protein
vỏ trong tế bào sẽ gây hiệu ứng kìm hãm sự nhân lên của virus nhiễm vào. Ngời ta
cho rằng protein vỏ của virus đóng vai trò quyết định đối với tính kháng chéo, tuy
nhiên cơ chế của bảo vệ chéo còn cha đợc giải thích đầy đủ (Lê Trần Bình & CS.,
2003).
- Gen kháng nấm gây bệnh: Nhiều loài thực vật, động vật, vi sinh vật sinh ra những
protein độc đối với nấm. Gen mã hoá cho một số loại prtein này đợc phân lập với mục
đích tăng cờng khả năng chống nấm và côn trùng. Ví dụ, một loại protein của hạt lúa
3
mạch có khả năng làm mất hoạt tính của ribosome. Khi biểu hiện gen này ở cây thuốc
lá thì protein của gen biến nạp gây độc đối với nấm bệnh Rhizoctonia solani. Đây là
loại nấm gây bệnh bạc lá ở lúa.
- Gen kháng vi khuẩn gây bệnh: Ngời ta đã phân lập đợc các gen kháng bệnh vi khuẩn
tự nhiên để dùng cho công nghệ gen. Điển hình nhất là gen Xa21, đợc phân lập từ cây
lúa dại Oryza longisminata có tính kháng tự nhiên. Gen Xa21 mã hoá protein kinase
có chức năng làm thay đổi hoạt tính protein của vi khuẩn gây bệnh (Lê Trần Bình &
CS., 2003).
2.1.2. Gen kháng sâu hại
Công nghệ sinh học ngày nay đang phát triển một phơng pháp mới để chống lại
côn trùng gây bệnh. Đó là việc chuyển các gen đợc phân lập từ vi khuẩn Bacillus
thuringiensis (Bt) vào cây trồng. Cây trồng đợc chuyển gen Bt sẽ có khả năng tự tạo ra
nh sâu đục củ khoai tây (Phthrimea opercullelar), sâu đục thân ngô (Chilo partellus),
sâu khoang (Spodoptera litura), sâu tơ hại cải bắp (Plutella xylostella).
Gần đây, đã có các nghiên cứu sâu hơn về cơ chế tác động, hoạt lực diệt côn
trùng, phổ tác dụng của gen vip để tiến tới phân lập và thiết kế tạo vector chuyển gen
vào thực vật. Việc tìm ra các gen vip có hoạt tính diệt côn trùng mạnh và ứng dụng để
tạo ra cây chuyển gen có tính kháng sâu và phổ tác động rộng hơn là vấn đề đang đợc
nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới quan tâm (Lê Thị Thu Hiền, 2003).
Kết quả tơng tự cũng nhận đợc khi sử dụng gen mã hoá chất ức chế proteinase. Để có
hiệu quả, các gen này cần đợc biểu hiện trong bộ phận của cây mà côn trùng thích ăn.
Có những loại gen khác cũng làm tăng khả năng chống côn trùng, nh gen mã hoá chất
ức chế -amylase, mã hoá lectin và chitinase (bảng 1) (Schuler & CS., 1998). Trong
tự nhiên, các chất ức chế proteinase và -amylase thờng đợc tạo ra ở các vết thơng nh
một phản ứng tự vệ của cây chống lại côn trùng (Lê Trần Bình & CS., 2003).
Maqbool và Christou (1999) đã thiết kế gen gna, kháng dệp và côn trùng bộ cánh
giống, cùng với gen cry 1 Ac & cry2A. Gen Rag1 đợc phân lập từ giống đậu tơng
Dowling, có khả năng kháng rệp đậu tơng, một loại sâu bệnh gây hại cho cây trồng
(Hill & CS, 2006).
Bảng 1. Một số chất ức chế proteinase đã đợc chuyển vào cây trồng thông qua biến nạp gen
(Schuler & CS., 1998)
Chất ức chế proteinase Gen mã hoá Cây trồng đợc chuyển gen
Serine proteinase C-II; PI-IV Đậu tơng
Trypsin CpTI Đậu đũa
Cysteine proteinase OC-1 Lúa
Proteinase I, II Pot PTI, Pot PTII Cà chua, Khoai tây
Kunitz trypsin Kti
3
/ SKTI Đậu tơng
2.1.3. Gen kháng chất diệt cỏ
Nền nông nghiệp hiện đại, công nghiệp hóa gắn liền với việc sử dụng thuốc trừ cỏ.
Vấn đề đặt ra là khi phun thuốc trừ cỏ sẽ chỉ diệt cỏ mà không diệt cây trồng. Muốn
nhiên, để tạo dòng bất dục đực phải tốn nhiều thời gian, sức lực và công việc phức tạp.
Nhiều nhà chọn giống đề nghị một phơng pháp mới để làm mất chức năng của hạt
phấn qua đó tạo ra đợc dòng bất dục đực. Bằng công nghệ gen, ngời ta đang hy vọng
tạo ra đợc hệ thống nhân tạo điều khiển tính bất dục đực thuận nghịch do nhân tế bào
chi phối. Gen barnase mã hóa enyzme phân giải RNA đợc phân lập từ vi khuẩn
6
Bacillus amyloliquefaciens. Promoter TA29 chỉ hoạt động ở vùng hạt phấn. Do vậy,
khi gen này đợc gắn với promoter TA29 và đợc chuyển vào cây thì toàn bộ các vật
chất thông tin di truyền ở hạt phấn sẽ bị phá hủy trong khi đó ở các vùng ngoài hạt
phấn không bị ảnh hởng. Kết quả là tạo đợc các dòng bất dục đực. Các dòng bất dục
đực này sẽ đợc sử dụng làm mẹ trong tổ hợp tạo hạt lai F
1
.
Để khắc phục hiện tợng bất dục sẽ xảy ra ở hạt F
1
(khôi phục tính hữu thụ) ng-
ời ta lại phải chuyển gen barstar gây ức chế và điều hoà hoạt động của barnase vào
cây bố trong tổ hợp tạo hạt lai F
1
. Gen barstar cũng đợc gắn với promoter TA29, kết
quả hạt lai F
1
sẽ hữu thụ (Kempken, 2000; Lê Trần Bình & CS., 2003).
2.1.5. Gen chống chín nhũn và làm chín chậm, tạo sắc tố hoa
Phản gen (antisense) mở ra một hớng mới cho việc cải tiến giống cây trồng,
đặc biệt trong việc tăng cờng khả năng chống chín nhũn ở quả. Quá trình chín của quả
tạo ra sự thay đổi về màu sắc, kết cấu vỏ và mùi vị của quả. Nhiều gen liên quan đến
quá trình chín của quả đã đợc xác định. Gen mã hoá cho enzym polygalacturonase
(PG), liên quan đến sự phân huỷ thành phần của thành tế bào, là gen đợc phân lập đầu
tiên ở cà chua. Chuyển các cấu trúc sense hoặc antisense của các gen này vào hệ gen
Các gen sinh tổng hợp beta-carotene: psy (phytoene synthase) và lyc (lycopene
cyclase) đợc phân lập từ cây hoa thuỷ tiên (Narcissus pseudonarcissus); gen crt1 đợc
phân lập từ vi khuẩn đất Erwinia uredovora đã đợc chuyển vào hệ gen nhân của lúa d-
ới sự điều khiển của promoter đặc hiệu nội nhũ, vì thế chỉ biểu hiện ở nội nhũ
(Hirschberg, 2001). Sản phẩm cuối cùng của quá trình này là lycopene. Các enzym
nội bào của thực vật đã xúc tác cho quá trình biến đổi lycopene trong nội nhũ thành
beta-carotene, làm cho hạt lúa chuyển gen có màu vàng (Schaub & CS., 2005).
2.1.7. Gen tăng cờng khả năng miễn dịch, sản xuất protein động vật và các chất có
hoạt tính sinh học
Một trong những phát triển đầy hứa hẹn của công nghệ sinh học thực vật là sử
dụng cây chuyển gen để sản xuất các chất có hoạt tính sinh học nh: vitamin, các hợp
chất chữa bệnh, các hoá chất sử dụng trong công nghiệp, trong y tế nh: kháng nguyên,
kháng thể, interferon, vaccine....
Nhiều loại vaccine thú y cũng đợc quan tâm nghiên cứu. Ví dụ: Gen VP2 tổng
hợp protein vỏ của virus Gumboro đã đợc chuyển vào A. thailiana. Dịch chiết của cây
A. thailiana chuyển gen đợc sử dụng để gây miễn dịch cho gà qua đờng miệng, kết
quả cho thấy hiệu quả gây miễn dịch bằng cách này cũng giống nh gây miễn dịch
theo phơng thức truyền thống (dùng vaccin thơng mại) (Wu & CS., 2004).
Protein CD14 miễn dịch của ngời đã đợc biểu hiện trong tế bào cây thuốc lá.
Protein này tham gia vào phản ứng miễn dịch của ngời bằng cách phát hiện ra những
tác nhân gây bệnh. CD14 hoạt động nh những thể tiếp nhận, cùng với các tế bào
miễn dịch để tiêu diệt các mầm bệnh. CD14 có ở bề mặt màng nhầy và chất bài tiết
(nớc mắt, sữa mẹ, nớc bọt), rất quan trọng trong việc phòng chống các bệnh lây
truyền bởi vi khuẩn Gram âm (Blais & Altosaarm 2006).
2.1.8. Gen liên quan đến tính chống chịu các điều kiện bất lợi
Sự phát triển và sản lợng cây trồng phụ thuộc rất nhiều vào khả năng phản ứng
lại của chúng với các điều kiện của môi trờng, nh độ mặn cao, thiếu nớc... Một số cây
8
trồng có thể tạo ra các phân tử, các hoạt động với sự tham gia của rất nhiều gen để
chống chịu đợc những điều kiện này. Do một số loài cây trồng có khả năng chống
học).
Ngời ta đã xác định đợc các yếu tố dịch mã điều khiển biểu hiện của gen ABA trong
quá trình sinh trởng, phân lập đợc 4 yếu tố bZIP gắn với ABRE từ th viện cDNA
9
Arabidopsis (Choi & CS., 2000). Nghiên cứu của Cherian và cộng sự (2005) cho thấy
các gen quan trọng tham gia vào quá trình chống chịu các điều kiện hạn hán là các
gen sinh tổng hợp osmolyte, gen tạo ra các phân tử bảo vệ cây trồng. Khả năng cây
trồng chuyển gen có thể chống chịu đợc các điều kiện môi trờng bất lợi đã đợc chấp
nhận, tuy nhiên các cây trồng chuyển gen đơn chỉ mang lại những kết quả hạn chế.
Có một số kỹ thuật khác có thể mang lại hiệu quả cao hơn nh chuyển đồng thời nhiều
gen hay có sự can thiệp vào RNAi.
2.1.8.3. Gen liên quan đến tính chịu mặn
Một dòng cDNA liên quan đến tính chịu mặn của tế bào thuốc lá, các gen liên
quan đến sinh tổng hợp proline nh GAT đang đợc tập trung nghiên cứu với hy vọng
gia tăng sinh tổng hợp proline sẽ gia tăng tính chịu mặn. Hoạt động của gen ornithine
aminotransferase (OAT), đóng vai trò chủ yếu trong chu trình sinh tổng hợp proline
của cây Arabidopsis, tăng lên mạnh mẽ khi cây bị xử lý muối. Gen OAT đã đợc phân
lập cho các nghiên cứu chuyển gen (Lê Trần Bình & CS., 2003)
2.1.8.4. Gen liên quan đến tính chịu độc tố nhôm
Gen Alt1 sản sinh ra những protein liên quan đến hiện tợng tế bào đầu rễ cây chịu độc
tố nhôm tiết ra các chất hữu cơ. Các nghiên cứu phân lập và xác định gen Alt1 đã bớc
đầu đợc triển khai (Lê Trần Bình & CS., 2003).
2.8.5. Gen liên quan đến tính chịu ngập úng
Gen alcoledehydrogenase giúp cho cây có đợc năng lợng ATP trong điều kiện thiếu
oxy khi cây bị ngập nớc. Ngoài ra, các gen đặc trng nh gen làm cho lóng thân dài
nhanh khi bị ngập nớc (ở cây lúa nớc) cũng đang đợc nghiên cứu (Lê Trần Bình &
CS., 2003).
2.2. Các hớng chính trong tạo giống bằng biến nạp di truyền
2.2.1. Kháng thuốc diệt cỏ
Thuốc diệt cỏ đợc sử dụng để diệt trừ cỏ dại. Vấn đề cỏ dại nếu không kiểm
dơng, cà chua, lúa mỳ
Isoxazole Ngô, cải dầu, đậu tơng
Oxynil Bông, cải dầu
Sulfonylurea Củ cải đờng,
Sulfonamide Cải dầu
Bromoxynil Cải dầu, bông
Imidazolinone Cải dầu, ngô
Sethoxydim Ngô
(Nguồn: />2.2.2. Kháng côn trùng
Côn trùng tấn công cây trồng và đã làm giảm 10-40% sản lợng. Việc tạo ra các
giống cây trồng kháng côn trùng luôn đợc mong đợi nhằm mục đích tăng sản lợng và
giảm lợng các chất bảo vệ thực vật sử dụng trong quá trình trồng trọt (Muthukrishnan
& CS., 2001). Chế phẩm sinh học Bt diệt côn trùng đợc sử dụng khá rộng rãi, chiếm tới
90% thị trờng thuốc trừ sâu sinh học và 2% thị trờng thuốc trừ sâu toàn cầu. Mặc dù đ-
ợc coi là thuốc trừ sâu sinh học hiệu quả, một số hạn chế nhất định về phơng diện sinh
học đã phần nào ảnh hởng tới hiệu quả sử dụng chế phẩm Bt. Những điểm bất lợi này
hoàn toàn bị loại trừ khi sử dụng các giống cây trồng chuyển gen (Kaur, 2000).
11
Riazuddin và cộng sự (1996) đã sử dụng vectơ mang gen cryIA(c) dới sự điều
khiển của Ubi-P và gen hpt để chuyển vào lúa tạo khả năng kháng côn trùng ăn lá.
Komari và cộng sự (1996) đã sử dụng vectơ với 2 đoạn trình tự T-ADN mang 2 gen
khác nhau để chuyển vào lúa và đã thu đợc rất nhiều thể biến nạp, trong đó đã chứng
minh đợc sự xâm nhiễm và phân ly của T-ADN ở thế hệ Ro và Rl .
Sự biểu hiện của gen ức chế proteinase II trong các giống lúa Japonica cho thấy
thông qua khả năng kháng đối với sự tấn công của sâu đục thân hồng (Duan & CS.,
1996). Nayak và cộng sự (1997) cũng đã tổng hợp gen cryIA(c), thiết kế kết cấu Ubi1-
P để chuyển vào phôi giống lúa Indica IR64 và thu đợc 6 dòng lúa có khả năng kháng
sâu đục thân tồn tại bền vững ở thế hệ T2. Các cây ngũ cốc chuyển gen biểu hiện các
gen ức chế protease cũng đã nhận đợc ở 1 số phòng thí nghiệm. Các gen mã hoá
chitinase, kinase cũng đã đợc chuyển vào các cây ngũ cốc. Gen Xa21 đã đợc chuyển
Đột biến ASA2 của gen mã hoá cho enzym sinh tổng hợp Trp đã đợc chuyển
và biểu hiện trong các cây rau và đã nhận đợc hàm lợng Trp tự do tăng. Ngời ta cũng
đã chuyển gen OASA1 vào lúa và đã thu nhận đợc các mô sẹo và lá lúa chuyển gen có
hàm lợng Trp tăng 180 và 35 lần (tơng ứng) (Cho & CS., 2000). Gen mã hoá cho
enzyme phytase phân giải các phức phytat sắt (ferritin) đã đợc chuyển vào lúa nhằm
tạo ra các giống lúa có hàm lợng sắt cao (Goto & CS., 1999) (bảng 3).
Maruta & CS (2001) đã tạo ra các giống lúa japonica Tsukinohikari chuyển gen
có hàm lợng glutelin thấp bằng việc chuyển gen thông qua chủng Agrobacterium
LBA4404 mang gen glutelinA antisense. Đánh giá trên đồng ruộng các dòng lúa
chuyển gen thế hệ T4 cho thấy hàm lợng glutelin trong hạt đã giảm 20-40% và hàm l-
ợng prolamin tăng.
Vào năm 2000, ngời ta đã tạo ra cây lúa vàng (SGR1) bằng việc chuyển các
gen có khả năng sinh tổng hợp beta-carotene (tiền vitamin A) vào lúa (Oryza sativa).
Thành công này đã tạo ra bớc đột phá rõ rệt trong công nghệ sinh học. Lúa vàng
SGR1 đợc trồng trong điều kiện nhà kính có hàm lợng carotenoid 1,6ug/g (Ye & CS.,
2000).
Các nghiên cứu tiếp theo về lúa vàng đã đợc tiến hành tại Công ty Công nghệ
sinh học Syngenta và họ đã tạo ra giống lúa vàng mới gọi là Lúa vàng 2 (SGR2). Họ
đã kết hợp gen psy phân lập từ ngô với gen crt1 của giống lúa vàng gốc SGR1. Lúa
vàng 2 có hàm lợng carotenoid cao hơn gấp 23 lần so với giống gốc SGR1 (đạt
37ug/g) (Paine & CS., 2005). Thử nghiệm đồng ruộng đầu tiên đối với các giống Lúa
vàng đã đợc tiến hành vào năm 2004 bởi Trung tâm Nông nghiệp Đại học bang
Louisiana (Mỹ)
( />ce-10-13-04.asp).
Sắn là một loại cây trồng quan trọng, đặc biệt đối với ngời dân Châu Phi. Cây
sắn có thể chịu đợc hạn hán và nhiều điều kiện môi trờng bất lợi khác. Tuy nhiên, sản
lợng sắn đang giảm đi trong vài năm gần đây. Những công cụ sinh học hiện đại đã có
đóng góp quan trọng vào việc cải thiện chất lợng củ sắn nh: nâng cao hàm lợng
13
protein, giảm hàm lợng axit gây bệnh say sắn, hàm lợng tinh bột thấp phục vụ mục
thấp trong cây khoai tây và cũng có thể gặp khó khăn vì protein này có thể có các hoạt
tính sinh học khác dới tác dụng của nhiệt độ khi đun nấu khoai tây (Blais & CS.,
2005; Blais & Altosaar, 2006).
Hiện nay số lợng các tác nhân gây bệnh cho ngời và gia súc, gia cầm ngày
càng tăng, hiện tợng nhờn thuốc đối với các tác nhân gây bệnh cũ bắt buộc con ngời
14
Copyright: Tài liệu đại học ©