LỜI CẢM TẠ
CHÚNG TÔI CHÂN THÀNH CẢM ƠN
Công ty Bio – Rad đã tài trợ kinh phí cho chúng tôi thực hiện đề tài
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Bộ Môn Bảo vệ Thực vật, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh
Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ
Chí Minh
Đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong suốt thời gian thực tập để
hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
CHÚNG TÔI TRÂN TRỌNG BIẾT ƠN
Thầy Lê Đình Đôn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện giúp đỡ chúng tôi
hoàn thành khóa luận này.
Thầy Trần Nhật Phương đã giúp đỡ chúng tôi rất nhiều về kinh phí và hóa chất
để thực hiện đề tài này.
Thầy Bùi Cách Tuyến, thầy Bùi Minh Trí đã tạo điều kiện cho chúng tôi thực tập
tại Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh.
Chị Phan Thị Thu Hiền đã tận tình chỉ dạy chúng tôi các thao tác, kĩ năng phòng
thí nghiệm.
Anh Nguyễn Đức Thành và anh Phương (Trung tâm Y Tế Quận 9) đã nhiệt tình
chỉ dẫn chúng tôi trong kỹ thuật rửa phim X- quang.
Các anh chị ở Trung Tâm Phân Tích Thí Nghiệm Hóa Sinh, các anh chị ở bộ
môn Bảo Vệ Thực Vật, trường Đại Học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp
đỡ chúng tôi hoàn thành khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 27 đã động viên, giúp đỡ chúng tôi
trong thời gian thực tập.
i
TÓM TẮT
LÊ MINH KHA, NGUYỄN VĂN LẪM, Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Tháng 09/2005. “THIẾT LẬP QUI TRÌNH SOUTHERN BLOT”.
Giảng viên hướng dẫn:

Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU – PHƯƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT........3
2.1 Lịch sử phát triển của phương pháp Southern blot...................................................3
2.2 Nguyên tắc của phương pháp Southern blot.............................................................4
2.3 Một số ứng dụng của phương pháp Southern blot....................................................4
2.4 Sự khác nhau giữa Southern blot, Northern blot, và Western blot............................5
2.5 Một số phương pháp tách chiết DNA từ vi khuẩn ...................................................5
2.5.1 Phương pháp sử dụng SDS ................................................................................6
2.5.2 Phương pháp sử dụng CTAB.............................................................................7
2.5.3 Phương pháp sử dụng Phase Lock Gel
TM
(Jones và Bartlet, 1990)...................8
2.6 Một số phương pháp định tính và định lượng DNA.................................................9
2.6.1 Phương pháp định lượng bằng quang phổ kế.....................................................9
2.6.2 Điện di (Electrophoresis)....................................................................................10
2.6.3 Định lượng DNA bằng phân tử Mass.................................................................11
2.7 Enzyme giới hạn (Restriction enzyme)....................................................................12
2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn .............................................................................12
2.7.2 Các loại enzym giới hạn ....................................................................................13
2.7.3 Các kiểu cắt của enzym giới hạn........................................................................13
2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng.......................................................................15
2.8 Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)....................................................15
2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA Polymerase ..................16
2.8.2 Ứng dụng phản ứng PCR để phát hiện vi khuẩn Pseudomonas fluorescense
định cư trong đất và trong vùng rễ cây trồng............................................................16
2.9 Phương pháp tinh sạch DNA....................................................................................17
iii
2.9.1 Phương pháp tinh sạch DNA bằng phenol.........................................................17
2.9.2 Phương pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX .....................................................17
2.10 Các phương pháp chuyển DNA lên màng ...........................................................................19
2.10.1 Phương pháp mao dẫn hướng lên (Upward Capillary Transfer)......................19

3.3.2 Phương pháp tiến hành .......................................................................................43
3.3.2.1 Tăng sinh vi khuẩn Pseudomonas fluorescens trên môi trường LB.............42
3.3.2.2 Ly trích genomic DNA từ dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens..........42
3.3.2.3 Hiệu chỉnh nồng độ và định lượng DNA bằng phân tử Mass......................45
3.3.2.4 Thiết lập phản ứng cắt genomic DNA bằng ezyme giới hạn.......................46
3.3.2.5 Thực hiện phản ứng PCR trên hai cặp primer B2BF, BRR4........................48
3.3.2.6 Tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel...................................50
3.3.2.7 Thực hiện đánh dấu sản phẩm PCR của cặp primer B2BF, BRR4..............51
3.3.2.8 Tạo mẫu lai...................................................................................................52
3.3.2.9 Lai Southern.................................................................................................55
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN........................................................................57
4.1 Kết quả tăng sinh, ly trích và định lượng DNA........................................................57
4.1.1 Kết quả ly trích genomic DNA.........................................................................57
4.1.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ..............................................................................58
4.1.3 Kết quả định lượng bằng phân tử Mass............................................................59
4.2 Kết quả phản ứng cắt DNA bằng enzyme giới hạn..................................................59
4.3 Kết quả phản ứng PCR với hai cặp primer B2BF, BRR4 và phl- 2a, phl- 2b...........61
4.4 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR bằng phương pháp cắt gel ...................................62
4.5 Kết quả lai Southern..................................................................................................63
Phần 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...........................................................................69
5.1 Kết luận.....................................................................................................................69
5.2 Đề nghị......................................................................................................................72
TÀI LIỆU THAM KHẢO............................................................................................75
Phụ lục 1..........................................................................................................................77
Phụ lục 2..........................................................................................................................79
Phụ lục 3 .........................................................................................................................82
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
v