57
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

4.1 KẾT QUẢ TĂNG SINH , LY TRÍCH, VÀ ĐỊNH LƢỢNG GENOMIC DNA
4.1.1 Kết quả tăng sinh và ly trích
Các dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens được tăng sinh trên môi trường LB
48 giờ ở 27
o
C. Sau 48 giờ nuôi cấy, các dòng đều cho sinh khối. Chúng tôi đã ly trích
được 34 dòng (phụ lục) trong tổng số 51 dòng từ bộ mẫu (phụ lục).

Hình 4. 1 Kết quả ly trích DNA từ các dòng Pseudomonas fluorescens sau 48 giờ
nuôi cấy trên môi trƣờng LB ở nhiệt độ 27
o
C.

Kết quả điện di (hình 4.1) cho thấy, hai mẫu 18, 128 không thu được DNA. Các
mẫu 23, 65, 149, 154, 121, 123,127, 150 cho sản phẩm DNA tổng số ít lẫn tạp chất.
Các mẫu 28, 129, 70 có sản phẩm DNA còn lẫn nhiều tạp chất. Các vệt sáng kéo dài
phía dưới DNA tổng số có thể là RNA hoặc DNA bị đứt gãy. Lỗi này có thể do thao
tác, khi thu phần dịch nổi chứa DNA , chúng tôi đã hút lẫn phần cặn bên dưới, hoặc do
thao tác quá mạnh nên làm đứt gãy DNA. Mặt khác, trong qui trình này chúng tôi


Để có được kết quả này, chúng tôi đã thực hiện nhiều thí nghiệm pha loãng dựa
trên một mẫu làm chuẩn. Mẫu chuẩn cũng là mẫu gốc ly trích được có nồng độ loãng
Hình 4.2 Kết quả hiệu chỉnh nồng độ DNA ly trích từ các dòng
Pseudomonas fluorescens khác nhau.
59
hơn các mẫu còn lại. Mẫu làm chuẩn phải có nồng độ thực nghiệm, nghĩa là có thể tiến
hành các phân tích tiếp theo, không nên có nồng độ quá loãng.
4.1.3 Kết quả định lƣợng bằng phân tử Mass
Chúng tôi sử dụng mẫu 130 làm mẫu đại diện để định lượng.

Mẫu 130 sau khi được pha loãng 8 lần có độ sáng của band sau khi điện di tương
đồng với band 200 bp của phân tử Mass (hình 4.3). Theo chuẩn của phân tử Mass, thì
band 200 bp có nồng độ tương đương là 20 (ng / µl). Vậy mẫu 130 đạt được nồng độ
tương đương 20 ng / µl sau khi đã thực hiện pha loãng 8 lần. Từ đây tính được nồng
độ mẫu 130 trước khi pha loãng là 160 (ng / µl). Như vậy, các mẫu genomic DNA sau
khi hiệu chỉnh đạt nồng độ tương đương 160 (ng / µl).

4.2 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG CẮT DNA GENOMIC BẰNG ENZYME GIỚI HẠN
Trong 34 dòng vi khuẩn Pseudomonas fluorescens ly trích được, chúng tôi chọn ra
các mẫu số 4, 16, 28, 67, 73, 123, 124, 127, 130, 152, 154 để thực hiện phản ứng cắt,
nhằm chuẩn bị mẫu lai cho quá trình lai.
61
trọng lượng thấp gần tương đương nhau dồn xuống đáy, hình thành nên một band đậm
sau khi chạy điện di. Những mẫu cắt không hoàn toàn và những mẫu cắt quá vụn như
vậy sẽ không có ý nghĩa trong quá trình tạo mẫu lai.
Những mẫu sản phẩm cắt có thể được dùng chuyển lên màng tạo mẫu lai là các mẫu
4, 154, 130, 28, 152 ở hình 4.4c và hình 4.4d. Tuy nhiên, những mẫu ở hình 4.4d có
nồng độ mẫu quá thấp và không đều nhau, do đó cần phải tính toán lượng mẫu sao cho
phù hợp trước khi chuyển lên màng.
Khi sử dụng từng enzyme giới hạn, cần có các điều kiện nhiệt độ, độ pH và dung
dịch đệm thích hợp. Nếu mẫu được cắt với nhiều loại enzyme khác nhau và có cùng
dung dịch đệm thì lần lượt thực hiện phản ứng cắt ở từng enzyme đơn ở nhiệt độ thích
hợp, sau đó làm bất hoạt enzyme đó và thực hiện phản ứng cắt cho enzyme kế tiếp.
Nếu các enzyme sử dụng không cùng dung dịch đệm thì phản ứng cắt sẽ phức tạp hơn.
Nhiệt độ phản ứng cắt phải luôn luôn ổn định, tránh có sự dao động lớn, nên ủ phản
ứng trong bồn ổn nhiệt có nắp đậy. Bảo quản enzyme ở - 20
o
C.

4.3 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG PCR VỚI HAI CẶP PRIMER B2BF, BRR4 VÀ Phl -
2a, Phl - 2b
Kết quả tinh sạch trên các dòng 4, 28, 129, 130, 154 đạt độ tinh khiết cao (Hình
4.6). Chúng tôi chọn dòng số 4 để thực hiện phản ứng đánh dấu, kết quả đánh dấu sẽ
được thể hiện trên kết quả lai.

Hình 4.6 Kết quả tinh sạch sản phẩm PCR các mẫu 4, 28,
130, 129, 154 bằng phƣơng pháp cắt gel.
sản phẩm PCR trước
khi tinh sạch
M 4 28 129 130 154 M
sản phẩm PCR
sau khi tinh sạch
629 bp
63
4.5 KẾT QUẢ PHẢN ỨNG LAI
Mẫu DNA tổng số cắt bằng enzyme giới hạn được dùng làm mẫu lai. Sản phẩm
PCR được bố trí là mẫu đối chứng dương cho phản ứng lai. Chúng tôi đã thiết lập phản
ứng lai ở nhiệt độ, thời gian lai và thời gian ủ phát hiện khác nhau. Probe đánh dấu sử
dụng cho phản ứng lai có chiều dài 629 bp.
Thí nghiệm 1: Lai ở 55
o
C, thời gian lai là 12 giờ, thời gian ủ phát hiện là 30 phút.
Hai mẫu 4 và 154 được cắt bằng hai enzyme BamH I và Eco RV dùng làm mẫu lai.
Sản phẩm PCR làm mẫu đối chứng dương. Kết quả lần phát hiện đầu tiên ở thí nghiệm
này không có sản phẩm lai, nền phim bị đen hoàn toàn. Chúng tôi thực hiện lại bước ủ
phim (dùng tấm phim mới) với màng lai 1 giờ, sau đó rửa phim và phát hiện. Kết quả
vẫn không phát hiện sản phẩm lai, nền phim vẫn bị đen hoàn toàn. Nguyên nhân nền