1
Phần 1. MỞ ĐẦU
1.1ĐẶT VẤN ĐỀ
Với những thành công lớn trong công nghệ sinh học trong những năm gần đây, trên
thế giới phương hướng nghiên cứu ứng dụng trong công tác bảo vệ thực vật đã có sự
chuyển hướng rõ rệt cho thế kỷ 21. Trước hết là những đầu tư rất lớn để khai thác và
ứng dụng công nghệ sinh học trong việc phòng trừ nấm bệnh, sâu hại, cỏ dại và các
loại côn trùng gây hại trong sản xuất nông nghiệp. Đây là một hướng nghiên cứu mới
có thể trở thành một công nghệ sạch trong phòng trừ sâu bệnh hại ở nước ta nếu được
đầu tư phát triển sản xuất.
Cùng với những thành công lớn trong công nghệ sinh học, theo đó các kĩ thuật về
sinh học phân tử đã ra đời như phương pháp Southern blot, RFLP (Restriction
Fragment Length Polymorphism), STS (Sequence Tagged Site), PCR (Polymerase
Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism), RADP
(Randomly Amplified Polymorphic DNA), SSR (Simple Sequence Repeats), SNP
(Single Nucleotide Polymorphism) tạo nên một sự chuyển biến mới trong các hướng
nghiên cứu về acid nucleic. Đặc biệt là các nghiên cứu sâu về gen và cấu trúc gen.
Trong đó, phương pháp Southern blot được xem là một kĩ thuật đem lại kết quả chính
xác cao và có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử. Một trong những ứng dụng quan
trọng của Southern blot là lập bản đồ giới hạn di truyền; phát hiện các khuyết tật về di
truyền do gen; chẩn đoán phân tử; xác định số bản sao của gen.
Ở Việt Nam, phương pháp Southern blot bước đầu được thử nghiệm tại Viện Sinh
Học Nhiệt Đới, trường Đại Học Quốc Gia Hà Nội và trường Đại Học Khoa Học Tự
Nhiên, còn ở trường Đại Học Nông Lâm TP. HCM, kĩ thuật này vẫn chưa được phát
triển và hoàn thiện phương pháp. Với những trang thiết bị hiện có của Trung Tâm
Phân Tích Hóa Sinh, Đại Học Nông Lâm TP. HCM, chúng tôi đã thực hiện đề tài
“Thiết lập qui trình Southern blot ”.
1.2 MỤC TIÊU VÀ YÊU CẦU
1.2.1 Mục tiêu đề tài
Thiết lập qui trình Southern blot trên đối tượng là vi khuẩn Pseudomonas
3
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 LỊCH SỬ PHÁT TRIỂN CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Southern blot, một kĩ thuật chủ yếu trong việc phân tích cấu trúc của gene, được
phát triển vào giữa thập niên 1970 do Ed Southern ở MRC một bộ phận của genome
động vật hữu nhũ ở Edinburgh (Southern, 1975). Đã gần 30 năm trôi qua, kĩ thuật lai
Southern đã được cải tiến đi rất mhiều, chủ yếu bao gồm:
- Tăng độ nhạy
- Giảm một số bước trong quá trình lai
- Giảm thời gian thực hiện
- Về kĩ thuật ngày nay đơn giản hơn trước nhiều.
Theo đó, một số phương pháp chuyển lên màng cũng đã được mô tả bởi các tác giả
sau: Southern (1979); Maniatis và ctv (1982); Meinkoth và Wahl (1984); Vandenplas
và ctv (1984); Jeffreys và ctv (1985) nhưng đều dựa trên một nền tảng chung:
- DNA được giữ trong một hệ thống gel thích hợp
- DNA được vận chuyển lên một giá thể rắn
- Probe đánh dấu được lai với DNA được giữ trên một vật thể và probe có
thể được loại bỏ sau quá trình lai
- Sản phẩm lai được phát hiện dựa trên một hệ thống phát hiện thích hợp.
Song song đó, nhiều phương pháp chuyển DNA từ gel lên màng cũng được thực
hiện như: blot mao dẫn hướng xuống (Lichtenstein và ctv, 1990; Chomozynki, 1992),
blot chân không (Medveczky và ctv,1987; Olszewska và Jone, 1988; Trnovsky, 1992),
blot hai chiều (Sambrook và Russell, 1999), và blot với đệm alkaline (Reed và Mann,
1985).
Bên cạnh đó, vật liệu làm màng cũng đã được cải tiến đi rất nhiều. Phương pháp
Southern blot đầu tiên được mô tả bởi Southern sử dụng màng nitrocellulose để
o
C hai đến ba lần, thấm khô bằng giấy lọc
hoặc sấy khô ở 65
o
C.
Thực hiện phóng xạ tự ghi bằng phim X quang nhạy ở nhiệt độ - 20
o
C, xử lý dưới
ánh sáng tử ngoại trong 4 giây để kiểm tra kết quả lai.
2.3 MỘT SỐ ỨNG DỤNG CỦA PHƢƠNG PHÁP SOUTHERN BLOT
Việc khám phá ra sự tương đồng của các chuỗi DNA thông qua phương pháp
Southern blot đã góp một vai trò quan trọng trong lĩnh vực công nghệ sinh học phân tử
và tái tổ hợp DNA. Southern blot là một phương pháp quan trọng để nghiên cứu những
vấn đề cơ bản như sự hiểu biết về cấu trúc gen, biểu hiện của gen và các genome.
Lai Southern blot được áp dụng để phát hiện số lượng bản sao của một gen trong
genome, sự thay đổi trật tự sắp xếp của các đoạn DNA, sự có mặt của các đoạn DNA
5
lạ, sự thay đổi vị trí của các transposon, phân biệt một gen trong họ gen, xác định các
intron, exon của một gen …. Khi áp dụng các chỉ thị phân tử (marker DNA) khác nhau
làm mồi, chúng ta có thể phân biệt được các loài, cá thể dưới loài. Phương pháp
Southern blot càng có vai trò trong chẩn đoán các bệnh do di truyền và những khám
phá về vi khuẩn cũng như các chủng vi rút gây bệnh (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị
Lang, 2001).
2.4 SỰ KHÁC NHAU GIỮA SOUTHERN BLOT, NORTHERN BLOT VÀ
WESTERN BLOT
Bảng 2.1 Những điểm khác nhau cơ bản giữa Southern blot,
Northern blot và Western blot
Southern blot Northern blot Western blot
3) Chạy điện di trên gel
polyacryamide - SDSPAGE
4) Thường chuyển lên màng
bằng phương pháp điện di
5) Lượng sản phẩm thừa là
protein
6) Lai với probe kháng thể
7) Rửa bỏ probe thừa 8) Phóng xạ tự ghi
(autoradiograph) hoặc phát
triển với cơ chất chromogenic
2.5 MỘT SỐ PHƢƠNG PHÁP TÁCH CHIẾT DNA VI KHUẨN
Mọi nghiên cứu và ứng dụng sinh học phân tử đều bắt đầu bằng việc thu nhận một
lượng nucleic acid đủ lớn và đủ sạch để tiến hành các thí nghiệm kế tiếp. Mối quan
tâm hàng đầu của các kĩ thuật tách chiết nucleic acid là thu nhận các phân tử này
6
ở trạng thái nguyên vẹn không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học.
Thông thường các phương pháp tách chiết đều phải qua các bước sau.
- Bước 1: Phá vỡ tế bào và màng nhân, giải phóng DNA.
- Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu, chủ yếu là các
protein mà chúng thường được làm biến tính trong phenol và chloroform.
- Bước 3: Tủa nucleic acid nhằm thu nhận chúng ở dạng cô đặc, một mặt nhằm bảo
vệ chúng khỏi sự phân hủy của các enzyme, mặt khác để có thể hòa tan chúng lại trong
dung dịch theo nồng độ mong muốn.
Mục đích của các phương pháp tách chiết nucleic acid là có thể thu được phần lớn
các nucleic acid có trong mẫu ở dạng nguyên vẹn và đủ sạch để tiến hành các phân
tích phân tử kế tiếp. Trong nghiên cứu này, việc chuẩn bị genomic DNA có vai trò rất
8. Tủa DNA và cho vào 5 ml Tris 50mM (pH 7,5), EDTA 1mM, RNAse
200 mg / ml, để qua đêm ở 4
o
C.
9. Ly trích cùng với thể tích chloroform, lắc đều và ly tâm 10000 vòng/5phút.
Chuyển phần dịch bên trên vào một tube mới.
10. Thêm vào 0,1 thể tích natri acetate 3 M, trộn nhẹ; cho vào 2 thể tích ethanol
95 %, lắc đều.
11. Làm tủa và hòa tan DNA trong 2 ml Tris 50 mM (pH 7,5), EDTA 1 mM.
12. Kiểm tra sản phẩm ly trích bằng điện di và phân tích.
2.5.2 Phƣơng pháp sử dụng CTAB (Sambrook và ctv, 2001)
1. Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng LB, thu sinh khối vi
khuẩn bằng cách ly tâm 10000 vòng/5phút/4
o
C.
2. Rửa sinh khối thu được với 1ml nước cất hai lần vô trùng và đánh tan bằng
vortex .
3. Hoà tan sinh khối vi khuẩn thu được trong 567 µl dung dịch TE 1X và đánh
tan bằng vortex, thêm 30 µl dung dịch SDS 10% và đánh tan bằng vortex. Sau
đó ủ ở 37
o
C khoảng 1 - 2 giờ.
4. Cho thêm vào 100 µl dung dịch NaCl 5 M, hòa tan thật kỹ bằng voltex.
5. Thêm vào 80 µl dung dịch CTAB / NaCl (khoảng 1/10 thể tích). Pha trộn
(đánh tan bằng vortex), ủ ở 65
o
C trong 10 phút.
6. Thêm 780 µl dung dịch hổn hợp chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1), hòa
lẫn đều, ly tâm 12000 vòng/10phút, ở 4
C.
13. Thu phần dung dịch bên trên và chiết xuất với chloroform / isoamyl alcohol
(24:1). Hòa lẫn đều, ly tâm 12000 vòng / 5 - 10 phút / 4
o
C.
14.Thu phần dung dịch DNA bên trên. Thêm 2 µl dung dịch natri acetate 3 M
(pH 5,0), isopropanol. Rửa kết tủa với 70% ethanol. Thu kết tủa làm khô.
15. Hòa tan kết tủa trong 100 µl dung dịch TE 1X, đem mẫu giữ ở tủ 4
o
C.
2.5.3 Phƣơng pháp sử dụng Phase Lock Gel
TM
(Jones và Bartlet, 1990)
1. Tăng sinh vi khuẩn trong môi trường giàu dinh dưỡng, thu sinh khối vào
eppendorf 1,5 ml bằng cách ly tâm.
2. Làm tan sinh khối trong 467 µl TE 1X. Thêm vào 30 µl SDS 10% và 3 µl
Proteinase K (20 mg / ml), trộn đều và ủ 1 giờ ở nhiệt độ 37
o
C.
3. Thêm vào phenol / chloroform, lắc đều cho đến khi có sự hòa lẫn hoàn toàn.
Cẩn thận chuyển hỗn dịch DNA phenol vào một tube Phase Lock Gel
TM
và ly
tâm 2 phút.
4. Lấy phần dịch bên trên cho vào một eppendorf mới và thêm vào đó một lượng
ngang bằng phenol / chloroform. Trộn đều và chuyển cẩn thận phần hỗn hợp đó
vào một tube Phase Lock Gel
TM
mới, ly tâm 5 phút. Chuyển phần bên trên vào
- Optical Density 260 nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ
nucleic acid trong mẫu dựa vào tương quan sau đây.
- Một đơn vị OD
260nm
tương ứng với một nồng độ là:
+ 50 µg / ml cho một dung dịch DNA sợi đôi
+ 40 µg / ml cho một dung dịch RNA hay DNA sợi đơn.
- Ví dụ: một giá trị OD
260nm
= 0,9 sẽ tương đương với:
+ Dung dịch có nồng độ DNA sợi đôi = 0,9 x 50 = 4,5 µg / ml
+ Dung dịch có nồng độ DNA sợi đơn hay RNA = 3,6 µg / ml
Tuy nhiên, cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid sạch. Để kiểm tra
độ sạch của dung dịch, người ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm (OD
280nm
). 280 nm là
bước sóng ở đó các protein có mức hấp thụ cao nhất. Nhưng các protein cũng hấp thụ
ánh sáng ở bước sóng 260 nm như các nucleic acid và do đó làm sai lệch giá trị thật
của nồng độ nucleic acid. Một dung dịch nucleic acid được xem là sạch (không tạp
nhiễm protein) khi tỉ số OD
260nm
/ OD
280nm
nằm trong khoảng 1,8 - 2. 10
2.6.2 Điện di (Electrophoresis)
Kỹ thuật điện di trên gel rất quan trọng đối với người làm kỹ thuật di truyền, vì đó
2.6.3 Định lƣợng DNA bằng phân tử Mass
Phương pháp này dựa vào độ sáng của band cần định lượng so với band của phân
tử Mass. Mẫu định lượng cần phải được pha loãng một lần, hai lần, ba lần, …, n lần.
Sau đó, các mẫu pha loãng được kiểm tra bằng điện di và được so sánh với phân tử
Mass, cho đến khi đạt được sự tương đương về kích thước và độ sáng giữa band của
mẫu pha loãng với band của Mass. Từ đó, xác định được nồng độ của mẫu pha loãng,
đồng thời ta có hệ số pha loãng so với mẫu gốc tính được nồng độ của mẫu gốc.
Bảng 2.2 Các thông số về nồng độ gốc và nồng độ sử dụng của phân tử Mass
Nồng độ gốc Nồng độ sử dụng (2,5 µ l/ giếng)
10 µg 1000 bp 100 ng 1000 bp
7 µg 700 bp 70 ng 700 bp
5 µg 500 bp 50 ng 500 bp
2 µg 200 bp 20 ng 200 bp
1 µg 100 bp 10 ng 100 bp
Một số điểm chú ý khi sử dụng phân tử Mass.
Mỗi tube phân tử Mass chuẩn chứa thể tích là 250 µl nên có thể được sử dụng cho
d
đặt tên là Hind II. Enzyme giới
hạn (Restriction Enzyme - RE) thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt các liên kết
trong phân tử DNA.
Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài, nghĩa là RE tách chiết từ vi
khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi khuẩn khác ở cùng vị trí giới
hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số
lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự các vị trí cắt bởi enzyme giới
hạn gọi là bản đồ giới hạn.
Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về
nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp. Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn
cần thực hiện trong một thể tích càng nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất.
2.7.1 Tên gọi các enzyme giới hạn
Qui ước quốc tế các enzyme giới hạn kí hiệu như sau: chữ đầu viết chữ in hoa chỉ
tên chi hoặc loài vi khuẩn mà từ đó các enzyme giới hạn được tách chiết; hai chữ tiếp
theo viết chữ in thường chỉ giống của vi khuẩn; tiếp đến là một chữ viết hoa chỉ chủng
vi khuẩn, cuối cùng là chữ số la mã chỉ số thứ tự dòng vi khuẩn có enzyme giới hạn
được phát hiện.
13
Ví dụ:
Chi, loài Giống Chủng Thứ tự dòng
Escherichia Coli Ry13
Eco RI E co R I
Eco RV E co R V
2.7.2 Các loại enzyme giới hạn
Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa
vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người
5’ … CCCGGG … 3’
3’ … GGGCCC … 5’
5’ … CCC ~ OH + P ~ GGG … 3’
3’ … GGG ~ P OH ~ CCC … 5’ Nhiều enzyme giới hạn nhận biết và cắt phân tử DNA ở các vị trí lệch nhau giữa
hai mạch đơn, tạo nên các đầu so le (hay đầu dính – cohesive ends). Các đầu so le tạo
nên sau khi cắt có thể tự nối lại với nhau không cần sự có mặt của enzyme nối DNA
ligase, nhờ đặc tính này enzyme giới hạn cắt đầu sole được sử dụng nhiều trong công
nghệ DNA tái tổ hợp.
Ví dụ: Vị trí phân cắt phân tử DNA của enzyme Eco RI
5’ … GAATTC … 3’ 5’ … G ~OH + P ~ AATTC … 3’
3’ … CTTAAG … 5’ 3’ … CTTAA ~ P HO ~ G … 5’
2.7.4 Các enzyme giới hạn thông dụng
Thường trong nghiên cứu sinh học phân tử, cũng như trong một phòng thí nghiệm
về sinh học phân tử luôn luôn phải có một bộ enzyme thông dụng. Trong đó, enzyme
giới hạn đặc biệt không thể thiếu trong các phân tích về genome như nghiên cứu sự đa
dạng di truyền của quần thể, tạo dòng. Sau đây, liệt kê một số enzyme thường hay sử
dụng trong các thí nghiệm về phân tử (bảng 2.3).
EcoRI
Sau 3A
Sma I
Taq I
AG CT
G GATCC
G GATCC
G ATTC
(
A
T
) GG CC (
A
T
)
A AGCTT
GTT AAC
CTGCA G
GAGCT C
>50
16
1
1
1
7
1
0
1
0
1
22
0
7
Arthrobacter luteus
Bacillus Amuloliquefaciens H
Karl Mullis và cộng sự phát minh 1985. Phản ứng PCR dựa vào đặc tính của enzyme
DNA polymerase. Một phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ lặp lại liên tiếp nhau.
Mỗi chu kỳ bao gồm ba bước:
- Giai đoạn biến tính: Phân tử DNA mạch đôi được tách thành hai mạch đơn ở
nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử DNA đó. Nhiệt độ để biến tính hoàn
toàn DNA thường sử dụng là 94 – 95
o
C trong 30 – 60 giây.
- Giai đoạn bắt cặp giữa primer và khuôn: Khi nhiệt độ hạ xuống thấp hơn nhiệt độ
nóng chảy của primer, primer sẽ bắt cặp với mạch khuôn tại vị trí có trình tự bổ sung
với primer. Nhiệt độ này tùy thuộc vào mỗi loại primer được sử dụng.
16
- Giai đoạn tổng hợp kéo dài: Nhiệt độ tăng lên 72
o
C, nhiệt độ hoạt động tối ưu
của Taq DNA polymerase, trong khoảng 30 giây đến nhiều phút tùy theo kích thước
cần khuếch đại. Khi đó Taq DNA polymerase tổng hợp mạch DNA mới dựa trên trình
tự của mạch khuôn. Độ dài đoạn khuếch đại là khoảng cách giữa hai primer đơn. Taq
DNA polymerase được sử dụng trong phản ứng PCR là một enzyme chịu nhiệt, không
bị mất hoạt tính trong bước biến tính DNA mạch khuôn (Nguyễn Cát Túc, 2003).
Sản phẩm khuếch đại của phản ứng PCR sẽ được điện di trên gel agarose, nhuộm
trong ethidium bromide và quan sát bằng mắt thường dưới tia UV có bước sóng 312
nm hoặc xem qua máy chụp gel bằng phần mềm Quantity One 2000 (Bio - Rad) .
2.8.1 Cách thiết lập một phản ứng PCR sử dụng Taq DNA polymerase
Bảng 2.4 Thành phần của một phản ứng PCR
Thành phần phản ứng Nồng độ cuối Thể tích hút / 50 µl phản ứng
DNA khuôn 10 pg - 1µg tùy phản ứng
10X PCR buffer 1X 5 µl
dNTP mix 2mM 0,2 mM/mỗi loại 5 µl
2.9.1 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng phenol (Sambrook, 1999)
1. Cho mẫu DNA cần tinh sạch vào eppendorf 1,5ml.
2. Dùng pipet hút dung dịch phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25:24:1) cho
vào eppendorf chứa mẫu DNA.
3. Lắc nhẹ bằng tay 10 giây. Ly tâm 12000 vòng /1phút trong 20 phút ở nhiệt độ
phòng.
4. Cẩn thận thu lấy dịch DNA nổi bên trên bằng pipet cho vào eppendorf sạch.
5. Cho isopropanol vào eppendorf chứa DNA, ủ ở nhiệt độ - 20
o
C trong 20 phút.
6. Ly tâm tốc độ 12000 vòng / 1 phút, loại bỏ isopropanol, thu DNA kết tủa.
7. Rửa DNA bằng 500 μl ethanol 70 %, ly tâm 12000 vòng / 1phút trong 20 phút,
loại bỏ ethanol, thu lấy DNA kết tủa.
8. Làm khô và hòa tan DNA trong dung dịch TE.
Phenol hay phenol / chloroform có thể làm kết tủa protein trong dung dịch. Lượng
kết tủa này có thể loại bỏ bằng cách ly tâm, thu nhận dung dịch không có protein. Tuy
nhiên có thể thực hiện phản ứng tủa nhiều lần nếu lượng protein quá lớn. Khuyết điểm
của phương pháp này là có thể làm đứt gãy DNA, lượng DNA thu lại sau khi tinh sạch
khoảng 60% so với lượng DNA ban đầu.
2.9.2 Phƣơng pháp tinh sạch DNA bằng cột GFX (Amersham)
Phương pháp này cho phép tinh sạch trực tiếp từ dung dịch DNA hay tinh sạch
DNA từ gel. Lượng DNA thu lại khi tinh sạch từ dung dịch khoảng 80% và từ gel là
Copyright: Tài liệu đại học ©