1
PHẦN I. MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Xác định giới tính phôi động vật có thể mang lại hiệu quả trong chăn nuôi, nhất là
đối với động vật cao sản như bò sữa. Nhờ xác định giới tính, ta có thể quyết định nuôi
động vật có giới tính mong muốn để giảm chi phí chăn nuôi, và góp phần phục hồi một
số loài động vật quí hiếm nhưng gặp khó khăn trong vấn đề sinh sản và đang có nguy cơ
tiệt chủng. Chính vì thế, các nhà khoa học luôn tìm cách xác định giới tính.
Cho đến ngày nay, rất nhiều phương pháp xác định giới tính đã được thực hiện.
Những phương pháp bao gồm lai tại chỗ và phát huỳnh quang để xác định nhiễm sắc thể
(NST) Y, phân tích NST hoặc xác định kháng nguyên H - Y có trên bề mặt các tế bào
phôi đực đã được tiến hành rất nhiều. Tuy vậy, các phương pháp này hoặc có độ tin cậy
không cao hoặc bị hạn chế về lượng mẫu dùng (đòi hỏi dùng lượng mẫu DNA quá lớn
mà phôi khó cung cấp được). Ngoài các phương pháp trên, người ta còn phát hiện ra
phương pháp PCR (polymerase chain reaction). Đây là phương pháp xác định giới tính
bằng cách khuếch đại đoạn DNA (deoxyribonucleic acid) đặc trưng cho giới tính đực
hiện diện trên NST Y. Phương pháp này có độ tin cậy cao và khá nhạy vì có thể tiến
hành với lượng mẫu DNA ban đầu tương đối nhỏ.
Ở Việt Nam, tiềm năng phát triển chăn nuôi động vật rất lớn, nhất là gia súc, gia
cầm. Để phát triển chăn nuôi, định hướng nuôi con gì, giới tính nào, số lượng bao nhiêu
là rất quan trọng. Việc tiền chọn lọc giới tính giúp cho ta hoạch định sẽ nuôi bao nhiêu
thú cung cấp sữa, bao nhiêu thú cung cấp thịt và vẫn giữ đúng định hướng ấy mà lại
giảm thiểu đáng kể tổn thất về kinh tế.
Hiện tại, Việt Nam đang cố gắng tạo được đàn bò có số lượng và chất lượng đủ đáp
ứng về thịt và sữa cho người tiêu dùng trong nước, một phần có thể xuất khẩu. Khi đó,
việc nhập phôi đông lạnh hoặc tạo hàng loạt phôi được phân biệt giới tính rõ ràng bằng
các kỹ thuật chẩn đoán giới tính hiện đại sẽ là hai trong số những giải pháp cho vấn đề
này. Vì phôi đông lạnh được phân biệt giới tính trước thì quá đắt, cho nên việc tạo phôi
động vật nhân tạo là hướng giải quyết mang tầm chiến lược về kinh tế và khoa học. Mặc
khác, việc tạo ra được phôi của động vật cao sản không phải là vấn đề đơn giản ở Việt
Nam trong thời điểm hiện tại, nhất là ở những cơ sở nhỏ. Do đó, để thiết lập các qui
- Bò sữa Hà Lan: thường là dạng bò lai từ bò Holstein Friesian có nguồn gốc Hà
Lan với bò trong nước (lai Sind). Bò có màu đen lẫn đốm trắng, trọng lượng trung bình
200 - 500 kg, khả năng cho sữa 15 - 20 lít / ngày.
Ở Việt Nam, bò nuôi có tỷ lệ đậu thai thấp (60%). Hơn nữa, bò cái ở Việt Nam
có vóc nhỏ nên khó phối với bò đực ngoại vóc lớn. Vì vậy, để có bò cái nền cần làm cho
chúng lớn vóc lên. Đây là vấn đề rất lâu dài và khó khăn trong công tác giống.
2.1.2 Đặc điểm về nguồn mô chiết xuất DNA
2.1.2.1 Một vài đặc điểm về cơ bò
Cơ được sử dụng trong quá trình ly trích DNA là cơ vân. Tế bào cơ vân là
dạng tế bào đa nhân nên lượng DNA ly trích được từ cơ rất nhiều. Protein trong cơ vân
chủ yếu là actin, myosin và myoglobin. Trong đó, myoglobin là loại protein thuộc nhóm
chromoprotein giúp tạo màu đỏ trong bắp thịt (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003).
Myoglobin được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị globin gắn với 1 nhóm heme. Dù là một loại
protein phức tạp nhưng nó dễ bị phân cắt bởi các proteinase vì trong cấu trúc của nó
không có liên kết disulfide.
2.1.2.2 Một vài đặc điểm về lông bò
Ở thú hữu nhũ, lông là một dạng cấu trúc phối hợp với da để tạo bề mặt phủ
bên ngoài cơ thể. Lông xuất phát từ nang lông, có nguồn gốc từ lớp bì. Xét về cấu trúc
cắt ngang, lông gồm có 3 lớp: lớp ngoài gọi là lớp sừng, được cấu tạo từ những tế bào
4
chết; kế đến là lớp vỏ tạo màu sắc cho lông nhờ sắc tố melanin; trong cùng là lớp tuỷ.
Xét theo chiều dài, lông là một cấu trúc bị keratin hoá từ gốc dần lên ngọn. Càng đi xa
khỏi gốc thì mức độ keratin hoá càng mạnh, các tế bào mất dần DNA của mình và trở
thành một chuỗi protein ở phần ngọn. Phần gốc lông có chứa rất nhiều tế bào còn sống
(Frandson và ctv, 1969).
Theo Nguyễn Phước Nhuận và ctv (2003), keratin là một loại protein cứng
thuộc nhóm albuminoid (scleroprotein) có đặc tính không tan trong các dung dịch trung
tính, chỉ hoà tan trong các dung dịch acid loãng hay kiềm tính. Theo Lê Thị Mỹ Phước
và ctv (2002), keratin có trọng lượng phân tử khoảng 600.000 đơn vị carbon. Thường có
2 dạng keratin là α-keratin và β-keratin. α-keratin có cấu trúc vòng với nhiều liên kết
của NST Y trong sự quyết định giới tính của phôi động vật hữu nhủ. Sau đó, Jacobs
phát hiện phôi động vật hữu nhũ sẽ phát triển thành con đực nếu mang NST Y, còn Ford
và Welshons cho rằng nếu phôi đó thiếu NST Y thì sẽ phát triển thành con cái. Đến
1983, Whashburn và Eichcher chứng minh được quá trình biệt hoá giới tính cần có sự
tham gia của cả các gen trên NST X, Y và nhiều gen khác trên NST sinh dưỡng.
Ngày nay, người ta đang tìm những gen nằm trên NST Y mà sản phẩm của chúng
điều khiển trực tiếp hoặc gián tiếp toàn bộ bản chất giới tính ở động vật. Những gen đó
được gọi chung là TDF - testis determining factor (yếu tố xác định tinh hoàn).
2.2.2 Sơ lược về NST giới tính
Ở động vật hữu nhủ, giới tính được xác định theo cơ chế di truyền. Trong phần lớn
các loài, cá thể cái có bộ NST đồng hợp (2n, XX), cá thể đực có bộ NST dị hợp (2n,
XY). Theo Chiarelli và ctv (1960), Sasaki và Makino (1962), ở loài bò, mỗi cá thể có số
NST đơn bội là 60 (trích dẫn bởi Eldridge, 1985).
Trong bộ NST của động vật hữu nhủ, NST X thường có kích thước lớn hơn các
NST sinh dưỡng (có kích thước trung bình). Chúng chứa khoảng 5% số gen của bộ gen.
Trong khi đó, NST Y thường nhỏ hơn các NST sinh dưỡng và có kích thước nhỏ nhất.
Người ta ước chừng trên NST X có khoảng 1000 gen, còn trên NST Y có khoảng 330
gen. Cả hai loại NST này đều rất cần cho sự phát triển và hoạt động bình thường của cơ
quan tạo giao tử (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Thu Lan, 2002).
Theo Burgoyne (1998), NST X và Y có một vùng trình tự tương đồng với kích
thước khoảng 2600 kb tại đầu cuối vai ngắn của NST, được gọi là vùng giả NST -
Pseudo autosomal region (PAR). Trong xác định giới tính, các gen nằm trên vùng PAR
của 2 NST X và Y cùng với các gen đặc biệt của NST Y nhưng nằm ở vùng trình tự
không bắt cặp với NST X đóng vai trò rất quan trọng.
Sau đây là một số gen quan trọng trong việc xác định giới tính.
6
2.2.2.1 Các gen trên NST Y
- Gen zfy (zinc finger, Y)
Năm 1987, Page và ctv đã khám phá ra gen zfy trên người. Bằng phân tích sự
chuyển vị NST ở nam XX và nữ XY, các nhà khoa học này đã tìm thấy một đoạn xác
7
Cho đến nay, sry được xem như là yếu tố đóng vai trò chủ đạo trong việc xác
định giới tính ở động vật hữu nhũ và người.
Ở động vật hữu nhũ, sự phát triển tinh hoàn của phôi phụ thuộc vào sự biểu
hiện của gen xác định giới tính sry. Xét về mức độ hình thái học, sự hình thành các ống
dẫn tinh và sự biệt hoá các tế bào Sertoli cũng như tế bào Leydig là những đặc điểm đặc
trưng cho thấy sự biểu hiện gen sry trong tuyến sinh dục bình thường của một cá thể có
bộ NST dị hợp XY (Parma và ctv, 1999; trích dẫn bởi Huỳnh Thị Lệ Duyên, 2003). Xét
về mức độ phân tử, sry là một gen thuộc họ HMG box (high mobility group) mã hoá cho
họ protein có khả năng gắn kết mạnh với DNA. Chính vì vậy, sry được xem như là công
tắc đóng mở di truyền cho các chương trình biệt hoá giới tính liên quan đến một số gen
khác (Haqq và Donahoe, 1998). Do đó, sry hoạt động trong những dòng tế bào hỗ trợ
cho sự biệt hoá giới tính để hướng sự biệt hoá của chúng thành tế bào Sertoli hơn là
thành những tế bào hạt đặc thù của buồng trứng.
Ở người khi cắt bỏ một đoạn giữa sry ORF (open reading frame) và trung thể
thì thấy có sự giảm sút biểu hiện gen sry (ở mào niệu sinh dục) và dẫn đến sự đảo giới
(Mc Elreavey và ctv, 1992; Capel và ctv, 1993; Ma và ctv, 1993; Laval và ctv, 1995;
trích dẫn bởi Haqq và Donahoe, 1998).
Hình 2.1: Sự phân bố các gen trên NST X và Y
(Nguồn: Josso và ctv, 2003)
8
Ngoài những chứng cứ trên, người ta còn xét thấy rất nhiều đặc điểm về mô
học, sinh hoá và sinh học phân tử chứng minh sry là một TDF chủ yếu (Haqq và
Donahoe, 1998; Delbridge và Marshall Graves, 1999; Josso và ctv, 2003). Ngoài ra, trên
NST Y còn có chứa một số gen như amh (anti-mullerian hormone), wt1 (Wilm’s Tumor
supressor gene), azf (Azoospermia factor),…là những gen có vai trò hỗ trợ cho quá trình
biệt hoá giới tính đực của cá thể. Ngày nay, các nhà khoa học đang quan tâm nghiên cứu
các gen đó để làm rõ hơn cơ chế xác định giới tính.
2.2.2.2 Các gen trên NST X
- Nhóm gen sox (SRY - liked HMG box)
nữ, dax - 1 hoạt động như là một yếu tố kháng tinh hoàn (Jimenez và Burgos, 1998;
trích dẫn bởi Delbridge và Marshall Graves, 1999).
2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH GIỚI TÍNH
Cho đến nay, đã có rất nhiều phương pháp xác định giới tính động vật. Mỗi phương
pháp đều có ưu và khuyết điểm riêng. Tùy vào mục đích mà ta tận dụng ưu điểm của
phương pháp đó để đạt được thành công cao nhất. Sau đây là một số phương pháp xác
định giới tính phôi (trích dẫn bởi Van Vliet và ctv, 1989).
2.3.1 Kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST
Cơ sở của phương pháp này là sự biểu hiện hoạt động của các gen trên NST X
trong việc mã hoá các enzyme, làm cho nồng độ enzyme con cái (XX) cao hơn nồng độ
enzyme con đực (XY). Tuy rằng để cân bằng hoạt động các gen, NST X có những sự ức
chế để chỉ còn một NST X biểu hiện gen ở con cái, nhưng sự ức chế chỉ thể hiện ở một
giai đoạn nhất định nào đó. Trước khi đến giai đoạn đó, nồng độ enzyme của 2 loại phôi
sẽ khác nhau. Dựa trên cơ sở này, Williams và ctv (1986), Monk và ctv (1988) đã phân
biệt những phôi trước khi chuyển cấy từ những con chuột siêu bài noãn.
Ở phương pháp của Williams và ctv, phôi dâu (morula) đến phôi nang (blastocyst)
được kiểm tra hoạt tính của enzyme liên kết NST X (glucose 6 phosphate
dehydrogenase - G6PD) một cách trực tiếp. Còn với phương pháp của Monk và ctv, các
tế bào đơn của phôi được phân tách từ phôi 8 tế bào và được kiểm tra hoạt tính enzyme
hypoxanthine phosphoribosyl transferase (HPRT) liên kết NST X. Cả hai phương pháp
đều kiểm tra hoạt động enzyme liên kết NST sinh dưỡng như mẫu đối chứng để hạn chế
sự thay đổi do biến dưỡng phôi. Kết quả được đọc dựa theo màu đậm nhạt (đậm là con
đực, nhạt là con cái).
Phương pháp này có một số hạn chế. Phương pháp của Williams và ctv có tính độc
đối với phôi vì nhuộm màu trực tiếp lên phôi. Phương pháp của Monk và ctv cải thiện
được khuyết điểm trên nhưng lại dùng hạn chế đối với phôi dâu nén hoặc phôi nang
(không tách được tế bào phôi đơn). Hạn chế khác là giai đoạn bất hoạt một NST X để
10
tạo sự cân bằng trong biểu hiện gen chưa được biết chính xác nên có thể dẫn đến chẩn
đoán sai lầm. Cuối cùng, đôi khi mRNA được tạo ra và tích trữ ở đó mà chưa biểu hiện
11
2.3.3 Phân tích di truyền tế bào để xác định giới tính
Phương pháp phân tích di truyền tế bào còn được gọi là karyotyping (in nhân)
được tiến hành bằng cách tạo sinh thiết phôi để lấy một số ít tế bào, nuôi chúng trong
môi trường có colcemid giúp các tế bào tiến tới nguyên phân. Sau đó, làm phồng tế bào
để phân tán NST. Các NST sẽ được cố định và nhuộm bằng phẩm nhuộm vĩnh cửu rồi
đem quan sát dưới kính hiển vi. NST Y được tìm thấy nhờ kích thước nhỏ bé của nó và
là dị NST (King, 1984; Daiger và ctv, 1985; Picard và ctv, 1985).
Phương pháp này gặp phải hai khó khăn. Một, phải có kỹ thuật cao và làm sao tạo
được nhiều tế bào ở metaphase để NST dàn trãi rõ ràng. Hai, đòi hỏi quá nhiều thời gian
phân tích. Để giải quyết những khó khăn này, người ta có nhiều cách nhưng tất cả các
cách hoặc chỉ giảm áp lực thời gian hoặc chỉ tăng số tế bào ở metaphase nhưng lại
vướng phải khó khăn còn lại.
Dù có rất nhiều cản trở cho khả năng áp dụng thương mại đối với phương pháp
này, nhưng do độ chính xác cao của nó nên phương pháp phân tích di truyền tế bào
thường được sử dụng để khẳng định kết quả của những kỹ thuật phân biệt giới tính
khác.
2.3.4 Sử dụng đoạn dò DNA chuyên biệt NST Y để phân biệt giới tính phôi
Nguyên tắc cơ bản của kỹ thuật này là việc lai DNA tổng số lấy từ những tế bào
sinh thiết phôi cần xác định giới tính với trình tự DNA chuyên biệt cho NST Y đã đánh
dấu. Kết quả lai dương tính xác định sự hiện diện của NST Y. Vì thế, phôi là phôi đực.
Phương pháp này nhanh về thời gian và có thể tiến hành với một số ít tế bào cho
nên không tồn tại các khó khăn như phương pháp di truyền tế bào.
Đoạn dò có thể được sử dụng từ các loại bán trên thị trường hoặc chuẩn bị theo các
bước sau: phân lập NST Y, phân lập trình tự chuyên biệt Y, xác định số bản sao trình tự
và định vị trình tự đoạn dò trên NST Y.
Khó khăn cần phải cải tiến của phương pháp này là các đoạn dò chuyên biệt Y
thường là một phần chứ không toàn phần. Nghĩa là có thể lai với một số NST khác.
Chính vì vậy, làm giảm độ chính xác của phương pháp này. Những sự khám phá về các
gen xác định giới tính trên NST Y sẽ giúp ngày càng hiểu rõ hơn về NST này và sẽ tạo
xác định giới tính của các phôi cần phải có:
- Trình tự DNA phải lặp lại, mục đích là làm tăng tối đa lượng nguyên liệu
dùng cho phản ứng nhân bản.
- Trình tự lặp lại phải là trình tự đặc hiệu cho con đực.
2.3.5.2 Một số công trình xác định giới tính bằng PCR
13
Sau hơn một thập niên phát triển, kỹ thuật xác định giới tính bằng PCR đã ngày
càng chứng tỏ ưu thế nhanh, nhạy và phù hợp với thương mại. Những đặc điểm ấy được
thể hiện qua nhiều công trình được cải tiến của nhiều tác giả khác nhau.
Vào 1990, Schorder và ctv công bố công trình xác định giới tính phôi bò giai
đoạn 6 - 7 ngày tuổi dựa trên phản ứng PCR. Đầu tiên, tác giả thiết lập phản ứng bằng
cách sử dụng các tế bào bạch cầu. Sau đó, qui trình được áp dụng trên các mẫu sinh thiết
có từ 1 - 3 tế bào thu nhận từ phôi. Kết quả xác định giới tính bằng PCR được so sánh
với phương pháp nhuộm NST và phương pháp lai tại chỗ. Kết quả cho thấy phương
pháp PCR cho hiệu quả phân tích cao hơn so với 2 phương pháp còn lại.
Vào 1994, Bredbacka và ctv nghiên cứu qui trình xác định giới tính bằng kỹ
thuật PCR. Trong công trình này, các tác giả thực hiện sinh thiết phôi ở giai đoạn phôi
dâu và lấy đi 2 - 8 tế bào từ phôi để thực hiện việc xác định giới tính. Trong nghiên cứu,
các tác giả chỉ sử dụng đoạn mồi đặc hiệu cho giới tính đực mà không sử dụng đoạn
mồi cho các trình tự chung của 2 giới để kiểm tra hiệu quả nhân bản của phản ứng. Các
tác giả cho rằng việc sử dụng đoạn mồi cho các trình tự chung này là không cần thiết
nếu như đã thực hiện việc kiểm tra sự hiện diện của mẫu sinh thiết trước khi thực hiện
phản ứng PCR. Tuy nhiên, một số phản ứng cho kết quả không rõ ràng.
Với mục tiêu chính là phát triển một phương pháp xác định giới tính nhanh cho
một vài loài thú hữu nhũ, Pomp và ctv (1995) đã xác định chính xác 209 phôi heo con
được thu thập từ 21 con nái tơ sau 10 - 11 ngày giao phối bằng kỹ thuật PCR. Toàn bộ
qui trình từ lúc nhập phôi đến lúc cho kết quả chỉ mất 6 giờ, cải thiện hơn rất nhiều so
với các phương pháp khác. Gen được khuếch đại là sry và cặp gen được dùng làm đối
chứng cho phản ứng là zfy / zfx. Sau đó, ông đã áp dụng phương pháp xác định giới tính
này trên các loài hữu nhũ khác như: ngựa, mèo, chó, bò, dê,… và người nhưng kết quả
PCR của Nguyễn Thị Thu Lan (2002) để xác định giới tính phôi. Kết quả là đã xác định
giới tính của một phôi heo, nhưng một phôi khác thì không cho tín hiệu.
Ngoài ra, trung tâm Công Nghệ Sinh Học Phôi Việt Nam cũng đang thực hiện
nhiều công trình xác định giới tính phôi bằng kỹ thuật PCR trên bò, dê, cừu, sao la,…
Các dẫn liệu ở Việt Nam cho thấy chưa có nghiên cứu về phân biệt giới tính ở
các giống khác nhau trên bò.
Copyright: Tài liệu đại học ©