Công nghệ sinh học thực vật Chương 4. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn 35
CHƢƠNG IV. CƠNG NGHỆ NI CẤY TẾ BÀO ĐƠN
– THU NHẬN SẢN PHẨM THỨ CẤP

Đã từ lâu, các nhà khoa học đã cho rằng tế bào thực vật là một đơn vị độc
lập trong cơ thể thực vật. Đã là đơn vị độc lập thì chúng hồn tồn có khả năng tự
trao đổi chất, sinh sản và phát triển. Ni cấy mơ thực vật có giá trị đối với nghiên
cứu sinh tổng hợp các chất chuyển hóa thứ cấp và cũng có thể cung cấp các
phương thức sản xuất các sản phẩm chuyển hóa quan trọng của thực vật.
1. Khái niệm tế bào đơn và sản phẩm thứ cấp
Năm 1838, Schleiden – giáo sư thực vật học ở Jena – đã cho rằng: “Tế bào
là đơn vị sống căn bản của mọi cấu trúc thực vật”. Theo ơng, q trình căn bản
trong sự phát triển thực vật là sự thành lập các tế bào sống độc lập trong một kiểu
cấu trúc nào đó của cá thể thực vật ngun vẹn.
Mãi đến năm 1954, Muir và các cộng sự mới bắt đầu những nghiên cứu về
sự phát triển của tế bào đơn thực vật trong mơi trường nhân tạo. Tuy nhiên, những
nghiên cứu của họ chưa hồn chỉnh và các nghiên cứu này chỉ mang tính chất
thăm dò. Đến năm 1960, Melcher và Bergman là những tác giả đầu tiên tách và
ni cấy thành cơng tế bào đơn của thực vật trong các bình lên men với mơi
trường nhân tạo.
Từ những năm đầu thập niên 70 của thế kỉ XX đến nay, các nhà khoa học
đã cơng bố hàng loạt các cơng trình nghiên cứu về ni cấy tế bào đơn của các lồi
thực vật khác nhau để thu nhận những sản phẩm thứ cấp. Trong đó, đáng lưu ý
nhất là những kết quả của Street. Ơng đã hồn chỉnh tồn bộ cơng nghệ ni cấy
từ giai đoạn đầu đến giai đoạn tinh sạch các sản phẩm bậc 2.
Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm được tạo ra trong tế bào
nhờ các q trình trao đổi chất xảy ra trong tế bào, sau đó chúng thốt ra khỏi tế
bào đi ra mơi trường ngồi.

S
Ubiquinone-10
Nicotiana tabacum
S
Diosgenin
Dioscorea deltoides
S
Benzylisoquinoline alkaloid
Coptis japonica
S
Berberine
Thalictrum minor
S
Nicotin
Nicotiana tabacum
C
Bisoclaurine
Stephania cepharantha
S
Tripdiolide
Tripteryqium wilfordii
S
Ghi chú: C – Callus (mơ sẹo); S – Cell suspension (huyền phù tế bào)

Điểm khác biệt giữa ni cấy tế bào đơn thực vật và ni cấy tế bào vi sinh
vật:
- Ni cấy tế bào đơn thực vật đòi hỏi mức độ vơ trùng cao hơn rất nhiều so
với mức độ vơ trùng trong ni cấy vi sinh vật.
- Trong q trình phát triển ở mơi trường ni cấy nhân tạo, các tế bào vi
sinh vật thường tồn tại độc lập trong khi tế bào đơn của thực vật tạo ra

phương pháp chu kỳ, tế bào thực vật thường tạo ra một quần thể dị biệt. Phổ biến
dị của tế bào thực vật lớn và rất dễ nhận thấy trong khi ni cấy. Do đó, việc kiểm
sốt q trình ni cấy phải được thực hiện nghiêm ngặt.
Trong phương pháp ni cấy từng mẻ sẽ xảy ra hệ thống phân chia đồng
bộ, hệ thống này tạo ra những thế hệ tế bào có cùng tuổi sinh lý, phát triển, có
cùng thời điểm trao đổi chất mạnh hoặc trao đổi chất yếu. Do đó trong q trình
ni cần chú ý thay đổi chất dinh dưỡng, chất điều hòa sinh trưởng và thay đổi
điều kiện chiếu sang cho phù hợp với từng thời kỳ phát triển.
Ngun liệu để ni cấy tế bào đơn trong mơi trường lỏng là những tế bào
mơ sẹo hoặc những tế bào lai hữu tính. Trong q trình ni cấy có thể xảy ra
những thay đổi về mặt di truyền do tác động của các yếu tố bên ngồi. Chính vì
thế, việc kiểm sốt thường xun phải được thực hiện để loại những tính trạng xấu
làm thối hóa tế bào và giữ lại những tính trạng tốt để duy trì và làm tăng giá trị
của tế bào.
2.2. Những yếu tố ảnh hưởng đến q trình ni cấy tế bào đơn trong mơi
trường lỏng
2.2.1. Ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng thực vật
Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng rất lớn đến sinh lý tế
bào trong q trình ni cấy
- Phần lớn các chất điều hòa sinh trưởng thực vật làm tăng q trình phân
bào.
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật đặc biệt làm tăng q trình biệt hóa
tế bào để tạo ra những cơ quan riêng biệt của cây như rễ, than, lá,…
Công nghệ sinh học thực vật Chương 4. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn 38
- Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật có ảnh hưởng đến việc tạo ra những
sản phẩm thứ cấp.
2.2.2. Ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng

thu nhận các sản phẩm bậc 2. Để giải quyết 2 khó khăn trên, các nhà khoa học đã
đưa ra những hướng giải quyết sau:
Công nghệ sinh học thực vật Chương 4. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn 39
- Khơng nên ni cấy tế bào đơn một cách đại trà mà khơng tính tốn đến
khả năng tạo ra những sản phẩm đặc biệt của lồi thực vật đó. Vấn đề đầu
tiên là phải chọn ra được một lồi thực vật nào đó có khả năng sinh tổng
hợp ra những chất mà ta quan tâm. Đặc tính tổng hợp chất chun biệt này
do một gene trong cấu trúc DNA quyết định và chúng có đặc tính lồi rất
cao. Việc chọn sai đối tượng sẽ đồng nghĩa với sự thất bại trong ni cấy về
sau.
- Thực vật là cơ thể đa bào, do đó khơng phải tất cả các cơ quan đều có khả
năng tạo ra chất mà ta quan tâm. Ở đó, chỉ có những cơ quan đặc biệt mới
tạo ra những chất đặc biệt. Do đó, việc xác định cơ quan nào có khả năng
sinh tổng hợp chất mà ta quan tâm để tiến hành ni cấy là điều rất quan
trọng.
- Trong q trình ni cấy, ln ln phải tiến hành tuyển chọn, lai tạo và
chuyển gene để nâng cao năng suất tạo ra các sản phẩm bậc 2 mà ta quan
tâm.
- Cũng như q trình sinh tổng hợp enzyme cảm ứng ở vi sinh vật, q trình
tổng hợp hay chuyển hóa ở tế bào thực vật cũng rất cần đến những cơ chất
tương ứng. Do đó, việc cung cấp những cơ chất tương ứng cho q trình
ni cấy là điều bắt buộc.
- Cuối cùng là phải tìm cho được mơi trường đặc hiệu riêng cho từng loại tế
bào.
3.1. Kỹ thuật ni cấy
Mẫu tế bào dùng để ni cấy phải được lấy từ cây đã biết chắc chắn có khả
năng sinh tổng hợp chất cần quan tâm; mẫu tế bào phải được lấy từ cơ quan hay bộ

cấp oxygen mà chỉ có cánh khuấy. Thứ hai, thiết bị ni cấy phải có hệ thống
chiếu sáng đảm bảo cho q trình tự dưỡng của tế bào xảy ra.
Trong khi tiến hành ni cấy, người ta có thể tiến hành ni cấy theo chu
kỳ (theo từng mẻ), cũng có thể ni cấy liên tục như trong kỹ thuật ni cấy và lên
men vi sinh vật.
Huyền phù tế bào sau khi kết thúc q trình ni cấy được đem đi ly tâm.
Sản phẩm bậc 2 ở trong dung dịch ly tâm. Áp dụng những phương pháp hóa, lý
tương ứng để tách các sản phẩm này ra khỏi dung dịch và đem tinh chế thì sẽ thu
được sản phẩm bậc 2.
Trong nhiều trường hợp khơng cần thiết phải qua giai đoạn tạo mơ sẹo để
ni cấy tế bào đơn mà trực tiếp sử dụng tế bào ngun thủy của mẫu cấy để ni
cấy tế bào đơn. Phương pháp này tiết kiệm được thời gian, cơng sức và chi phí rất
nhiều.
Trong một số trường hợp khác, người ta áp dụng phương pháp này để ni
cấy tế bào trần và thu được những kết quả rất khả quan.
Phương pháp ni cấy tế bào đơn đang được ứng dụng rộng rãi ở Nhật Bản,
Pháp, Canada, Mỹ và Hà Lan.
3.2. Phương pháp làm tăng sản lượng các hợp chất thứ cấp trong ni cấy tế
bào
Trong q trình ni cấy tế bào, người ta nhận thấy có một số sản phẩm
được tích lũy trong tế bào với một lượng cao hơn ở trong cây khi điều kiện ni
cấy hồn tồn thích hợp. Ví dụ như ginsenoside từ Panax ginseng, acid rosmarinic
từ Colleus blumei, shikonin từ Lithospermum erythrorhizon, diosgenin từ
Công nghệ sinh học thực vật Chương 4. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn 41
Dioscorea, ubiquinone-10 từ Nicotiana tabacum được tích lũy trong tế bào cao
hơn rất nhiều so với cây ngun vẹn.
Tuy nhiên, cũng có những sản phẩm tích lũy trong tế bào với một lượng rất

trình ni cấy.
Công nghệ sinh học thực vật Chương 4. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn 42
Mỗi lồi thực vật có những điều kiện tối thích cho sự tăng trưởng của tế
bào và sự sản xuất ra các hợp chất thứ cấp, vì vậy cần phải xác định rõ điều kiện
ni cấy thích hợp cho mỗi trường hợp.
3.2.2. Chọn lựa các chủng có khả năng sản xuất cao
Các đặc tính sinh lý của mỗi tế bào riêng lẻ khơng ln thống nhất với
nhau. Ví dụ, các cụm tế bào sản xuất sắc tố thường bao gồm những tế bào có khả
năng sản xuất và những tế bào khơng có khả năng sản xuất. Vào năm 1976, Zenk
và cộng sự đã thu được những dòng tế bào Catharanthus roseus có thể tích lũy
được một lượng lớn ajmalicine và serpentine. Sau đó, các nhà khoa học khác đã sử
dụng phương pháp chọn dòng tế bào với mục đích làm tăng khả năng sản xuất ra
các hợp chất cần thiết.
Việc chọn dòng tế bào là một kỹ thuật hữu hiệu để tăng lượng sản phẩm thứ
cấp và nên áp dụng phương pháp này rộng rãi. Tuy nhiên, vẫn chưa rõ là tại sao
trong cùng một hệ thống ni cấy lại có cả những tế bào có khả năng sản xuất cao
và có cả những tế bào có khả năng sản xuất thấp. Điều này có thể là do thiếu một
hoặc vài loại enzyme chun biệt cần cho phản ứng quan trọng nhất để sản xuất
các hợp chất thứ cấp ở trong các tế bào khơng có khả năng sản xuất.
3.2.3. Biến đổi tiền chất và các biến đổi sinh học
Việc bổ sung vào mơi trường ni cấy các tiền chất thích hợp hoặc các hợp
chất có liên quan đơi khi kích thích sự sản xuất các hợp chất thứ cấp. Phương pháp
này rất thuận lợi nếu như giá thành của các chất này khơng q cao. Ví dụ, các
amino acid được bổ sung vào mơi trường ni cấy huyền phù tế bào để sản xuất
tropan alkaloid, indole alkaloid và ephedorin. Ngồi ra, amino acid cũng còn có
những tác động kích thích khác. Thật sự, amino acid là tiền chất của một số loại
alkaloid nhưng nhìn chung, các bước sinh tổng hợp alkaloid từ amino acid rất

khơng phải lúc nào cũng thấp. Vì vậy, nên sử dụng những hợp chất có giá thành
thấp hơn cho mục đích này.
3.2.5. Phương pháp cố định tế bào
Các tế bào thực vật bất định được xem như là một nghiên cứu quan trọng
và là một sự phát triển trong lĩnh vực ni cấy tế bào thực vật bởi vì chúng có
những thuận lợi sau đây:
- Sức sống của chúng kéo dài trong pha ổn định và trong giai đoạn sản xuất,
có thể duy trì sinh khối qua một giai đoạn dài.
- Đơn giản hóa q trình xi dòng.
- Thúc đẩy (giả định) sự phản phân hóa, nối liền với sự gia tăng các hoạt
động biến dưỡng thứ cấp.
- Mật độ tế bào cao cho phép giảm kích thước của bình phản ứng, vì vậy làm
giảm giá thành và giảm khả năng bị nhiễm khuẩn.
- Giảm nhạy cảm với sự tổn thương tế bào.
- Trong vài trường hợp, có thể kích thích sự tiết ra các sản phẩm thứ cấp.
- Các bình phản ứng có dòng mơi trường di chuyển có thể được sử dụng để
làm tăng tốc độ trơi.
- Giảm độ nhớt của lưu chất đến mức tối thiểu vì trong huyền phù tế bào, độ
nhớt gây ra sự pha trộn và thu khí.
Công nghệ sinh học thực vật Chương 4. Công nghệ nuôi cấy tế bào đơn 44
Một hệ thống cố định có thể duy trì sự sống của tế bào qua một khoảng thời
gian dài và phóng thích phần lớn sản phẩm ra mơi trường ngoại bào ở dạng ổn
định, có thể giúp giảm giá thành sản phẩm. Tuy nhiên, trong một hệ thống cố định
cũng tồn tại một số vấn đề sau:
- Sự cố định thường bị hạn chế khi khả năng sản xuất ra sản phẩm khơng
kèm với sự tăng trưởng của tế bào.
- Sinh khối khởi đầu của hệ thống ni cấy phải được tăng trưởng trong
45
kháng sinh,… Tuy nhiên, trong ni cấy tế bào thực vật, việc gây đột biến còn hạn
chế bởi vì tế bào có bộ nhiễm sắc thể nhị bội do đó cơ hội thu được đột biến đồng
thời trên cặp nhiễm sắc thể tương đồng có xác suất rất thấp (<10
-6
). Ở thực vật, về
mặt cơ bản thì thể đơn bội có thể tạo ra được bằng cách ni cấy túi phấn, và một
tế bào đơn bội vẫn có khả năng trở lại trạng thái nhị bội. Điều này khiến cho cơ
hội thu được những tế bào có khả năng sản xuất vượt trội bằng cách gây đột biến
trên các thể nhị bội rất thấp. Hơn nữa, con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ
cấp và cơ chế điều hòa sự sinh tổng hợp này ở thực vật bậc cao còn chưa được
hiểu rõ, vì vậy khó biết được rằng loại đột biến nào có thể làm tăng khả năng sản
xuất các chất nói trên.
Sự gia tăng hoạt động biến dưỡng bằng cách sử dụng các đột biến điều hòa
có thể thực hiện được về mặt lý thuyết và việc chọn lọc các kiểu tế bào đồng dạng
cho mục đích này là một yếu tố quan trọng để sản xuất ra các loại sản phẩm khác
nhau. Một vài nhóm các nhà nghiên cứu đã sử dụng những tác nhân gây đột biến
như N-methyl-N’-nitro-N-nitrosoguanidine, ethylmethane sulfonate, N-ethyl-N-
nitrosourea hoặc tia X để tạo ra những chủng tế bào có năng suất cao.
3.2.8. Sự phát sinh hình thái và sự ni cấy lơng rễ
Ni cấy cơ quan:
Người ta mong muốn có thể sử dụng những tế bào chưa phát sinh hình thái
để sản xuất ra những chất biến dưỡng hữu dụng theo cách giống như vi sinh vật và
đã có những nghiên cứu sản xuất được những hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật
với sản lượng cao hơn cây ngun vẹn. Người ta cũng giả định rằng có một mối
quan hệ giữa sự phản phân hóa của tế bào với khả năng sản xuất ra các hợp chất
thứ cấp nhưng vẫn chưa rõ rằng sự sản xuất các hợp chất thứ cấp có phụ thuộc vào
sự phát triển của các cấu trúc chun biệt hay khơng hay những q trình này có