Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
1

Đặt vấn đề
“Sự sống quá phức tạp không cho phép chỉ qua một vài nghiên cứu mà
hiểu được toàn bộ cơ thể con người” – Linus Pauling. Hiện nay trên thế giới các
ứng dụng kỹ thuật của hàng loạt công trình nghiên cứu nuôi cấy các tế bào
ung thư đã và đang giúp các nhà khoa học từng bước giải đáp những vấn đề cơ
bản trong sinh học phân tử và cả những điều bí ẩn trong cơ thể con người. Các
nhà khoa học vẫn đang tiếp tục tìm kiếm và khám phá ra những dòng tế bào
đồng nhất về mặt di truyền. Các tế bào được chọn lọc này là mục tiêu cho việc
tiến hành các liệu pháp sinh học nhằm góp phần ngăn chận căn bệnh hiểm
nghèo.
Khoa học về nuôi cấy tế bào ung thư có phạm vi ứng dụng rất rộng và
phong phú cả trong nghiên cứu khoa học và trong thương mại. Dòng tế bào ung
thư được sử dụng như một vật liệu để sản xuất ra các cơ chất. Các protein người
có thể được phân lập trực tiếp từ việc nuôi cấy tế bào. Các dòng tế bào đóng
vai trò quan trọng trong các kỹ thuật tái tổ hợp DNA trong sinh học phân tử.
Người ta còn sử dụng dòng tế bào để thử nghiệm các loại thuốc có độc tính để
điều trò các bệnh di truyền, ung thư. Việc nuôi cấy tế bào còn góp phần mở ra
kỹ thuật dung hợp tế bào. Kỹ thuật này giúp chúng ta hiểu biết những điều bí
ẩn xãy ra bên trong cơ thể con người như các cấu tạo và chức năng của gen
người, các biểu hiện và các cơ chế di truyền, các phản ứng sinh học bình
thường và quá trình phát triển của những gen bệnh.
Mục tiêu chính của luận văn này là giới thiệu nền tảng cơ bản và
phương pháp luận cần thiết để tiến hành nuôi cấy tế bào ung thư nói chung và
đặc biệt là thử nghiệm phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào ung thư cổ tử cung
từ các mẫu mô sinh thiết của các bệnh nhân được chẩn đoán bò tổn thương
loạn sản ở giai đoạn I
B

Tuy nhiên mãi đến thế kỷ 15, Giovanni Morgagni mới là người đầu tiên thực
hiện giải phẫu tử thi một bệnh nhân u xương với mục đích tìm hiểu bản chất và
nguyên nhân bệnh. Đây là nền tảng để phát triển khoa học về u bướu (oncology).
Năm 1846, nhà nghiên cứu bệnh học người Đức Rudolph Virchow mô tả tế bào ung
thư máu và đưa ra giả thuyết về nguồn gốc ung thư tế bào. Ôâng cho rằng tất cả các
tế bào, bao gồm cả tế bào ung thư đều có nguồn gốc từ một tế bào khác. Giả thuyết
của ông vào thời đó đã rất tiến bộ và vài thập kỹ sau giả thuyết này được chứng
minh là đúng.
Đầu thế kỷ 19, các nhà khoa học mới hé mở phần nào sự bí ẩn của ung thư.
Năm 1911, Peyton Rous đã khám phá được một trong những virút gây ung thư đầu
tiên đặt tên là RSV. Đó là một retrovirus (virút phiên mã ngược) mà vốn di truyền
được cấu tạo bằng RNA. Thời điểm này một vấn đề đặt ra cho các nhà khoa học là
làm thế nào RSV có thể nhập vào vốn di truyền của tế bào cấu tạo bằng DNA. Năm
1960, Temin nghó ra rằng RNA có thể tạo ra DNA nhờ một chất men. Mười năm
sau, Temin và Baltimore đã chứng minh được sự hiện hữu của enzym này, đó là
enzym sao chép ngược và các virút gây ung thư loại RNA được gọi là virút phiên
mã ngược. Khám phá này nhận được giải thưởng Nobel Sinh lý và Y học năm 1975.
Năm 1976, nhà nghiên cứu người Pháp Dominique Stehelin cùng với các đồng
nghiệp người Mỹ Michel Bishop và Harold Varmus khám phá một điều gây sửng sốt
là nhiễm sắc thể của nhiều động vật, kể cả người chứa các gen có thể chuyển đổi
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
3

thành các gen gây u, nhờ vậy xác đònh trên 60 loại gen của tế bào có thể chuyển
thành gen gây ung thư.
Kiến thức của nhân loại về di truyền học, về cơ chế sinh học phân tử đã tiến
triển nhanh trong những năm gần đây.Vào giữa thế kỷ 20 các nhà khoa học mới bắt
đầu giải quyết những vấn đề phức tạp của di truyền học. James Watson và Franci
Crick với hai trang thông báo ngắn gọn về mô hình phân tử của DNA trên tạp chí


quá có thể dẫn đến hậu quả tạo ra khối u, tức là một khối tế bào bất thường so với
những mô chuẩn mực bình thường.
Có phải tất cả khối u đều là ung thư không? câu trả lời là không. Có hai loại u. U
lành tính thường gọi là u lành. Đó là một khối tế bào bất thường vẫn giữ lại ở vò trí
gốc nơi chúng đã phát sinh trong cơ thể. Các u lành cũng có thể gây sự cố nếu
chúng sinh trưởng lớn chèn ép ở một số cơ quan bò khung xương bọc kín như não hay
phổi. Nhưng thông thường ở các vò trí không chèn ép các mô khác người ta có thể
dùng phẫu thuật tại chỗ cắt bỏ hoàn toàn khối u ra khỏi cơ thể.
Trái hẳn với u lành là các u ác tính là một khối mô bất thường có thể phát triển
lan vào trong các mô lân cận và thường di căn vào những bộ phận ở xa khác của cơ
thể. Một u ác phát sinh từ một tế bào ung thư duy nhất và dời chỗ ra khỏi mô bình
thường nó đã phát sinh. Nếu không tiêu diệt hay cắt bỏ, một vài tế bào ung thư đó
sẽ xâm nhiễm vào trong các mô bao quanh và khối u gốc sẽ bành trướng. Các tế
bào cũng có thể tách khỏi khối u, xâm nhập vào hệ tuần hoàn (vào các mạch bạch
huyết và mạch máu) và có thể lan đến các vò trí mới, tạo ra những khối u mới tại
những chỗ đó. Sự dời chỗ của các tế bào ung thư ra khỏi vò trí nguyên thủy của
chúng được gọi là sự di căn (malignant progression).


1.2.2. Sinh sản của tế bào ung thư

1.2.2.1. Sự bất thøng của nhân và các nhiễm sắc thể

Trong các tế bào ung thư có thể biểu hiện các dạng bất thường của phân chia
như không có thoi vô sắc có thể dẫn đến chết tế bào hoặc nhiều nhân chia nhỏ.
Nhân chia với nhiễm sắc thể cực có đặc điểm là còn tồn tại trong gian kỳ, một vài
nhiễm sắc thể không được huy động đến gần một hoặc hai trung thể có thể dẫn đến
chết tế bào hoặc tạo thành hai nhân có số nhiễm sắc thể không đều. Tuy nhiên
những dấu ấn đặc hiệu của tế bào ung thư thường biểu hiện ở sự bất thường nhiễm
sắc thể.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
6

Các phương pháp xét nghiệm gần đây còn cho phép nhận biết những bất thường
nhiễm sắc thể của các dạng u khác nhau. Ví dụ như nhiễm sắc thể Ph1 quan sát thấy
trong bệnh bạch cầu loại tủy mãn tính. Các u nguyên bào võng mạc là do sự thiếu
hụt một phần nhiễm sắc thể 13. Phần lớn các trường hợp u màng não thiếu hoàn
toàn hay một phần nhiễm sắc thể 22.

1.2.2.2. Quan niệm đơn dòng

Ngày nay người ta cho rằng một ung thư phát triển từ một tế bào chuyển dạng.
Thực ra người ta không thể xác đònh một ung thư trên vi thể trước khi nó đã tạo
thành nhiều tế bào, nhưng có nhiều bằng chứng chứng minh rằøng ung thư là một
quần thể tế bào đồng nhất, một dòng tế bào. Ví dụ như sự chế tiết globulin miễn
dòch đơn dòng trong các u tương bào và trong các u lympho tế bào B, tất cả các tế
bào u chỉ chế tiết một dạng duy nhất của globulin miễn dòch.

ba ngày, pha S có thời gian khá hằng đònh (trung bình 16 giờ) nhưng pha G1 hay
thay đổi nhiều hơn. Chu kỳ của tế bào ung thư không ngắn hơn chu kỳ của các tế
bào bình thường, thậm chí chậm hơn do sự kéo dài của phân bào nguyên nhiễm. Ví
dụ chu kỳ của các nguyên bạch cầu của bệnh bạch cầu cấp là 50-60 giờ, trong khi
chu kỳ của các nguyên bào tủy bình thường là 24 giờ.

1.2.3. Nguyên nhân gây ra ung thư

Ngày nay cuộc chiến chống ung thư trên thế giới được tiến hành toàn diện trên
nhiều mặt. Những nghiên cứu thực nghiệm và dòch tễ đã đóng góp lớn lao trong việc
xác đònh một số nguyên nhân chủ yếu của ung thư ở người. Các nhà khoa học đã
chứng minh rõ ràng rằng sự phát triển ung thư thường là kết quả từ sự tiếp cận với
nhiều yếu tố rủi ro trong môi trường sống.
Hiện nay, theo đánh giá của IARC (International Agency for Resarch on Cancer-
1998) có 75 tác nhân được kết luận gây ung thư cho con người. Nhóm tác nhân gây
hư hại về di truyền và gây chuyển dạng u của tế bào thuộc các loại sau đây: (1) chất
gây ung thư hoá học, (2) năng lượng tia, (3) vi khuẩn sinh ung thư, chủ yếu là các
virút. Mỗi nhóm tác nhân có đặc điểm riêng, nhưng nhiều tác nhân có thể cùng tác
động và làm tăng hiệu quả các tác nhân khác.
Các tác nhân gây ung thư làm thế nào để gây được ung thư. Như chúng ta đã biết
hầu hết ung thư là kết quả từ nhiều dạng thay đổi di truyền. Các thay đổi này là kết
quả từ hàng chục năm tiếp xúc với các tác nhân ung thư có ảnh hưởng gây đột biến.
Nói chung khi tỷ lệ phân bào càng cao thì xác suất sinh đột biến càng cao do hệ quả
từ dễ sinh nhầm lẫn trong tự nhân đôi và tổ hợp lại DNA. Một vài tác nhân gây ung
thư dường như có cả hai tác dụng đó. Chẳng hạn các hocmon gây ra ung thư vú và
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
8

ung thư tử cung vừa gây ra tăng phân bào vừa có thể gây ra các thay đổi di truyền sẽ


1.3.1. Các gen gây ung thư (oncogen)

Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
9 Theo quan điểm hiện nay ung thư được xem là bệnh của gen bởi vì người ta phát
hiện ra hàng loạt các gen gây ung thư (oncogen) và gen ức chế ung thư
(antioncogen) có trong tế bào. Khi các gen này bò biến dò thì dễ dẫn đến ung thư.
Gần 50% các ung thư đã được nghiên cứu, chẩn đoán bằng sự biến dò của một gen là
gen p.53. P.53 là một antioncogen hay còn gọi là gen ức chế ung thư.
Các nhà khoa học đã chứng minh rằng trong cơ thể lành mạnh của con người có
chứa tiền gen kích thích sự phát triển (growth promoting protoocogen) hay còn gọi
là tiền gen gây u. Đó là gen cần thiết cho việc hài hoà sự sống.
Vai trò chuẩn mực của các tiền gen gây u trong tế bào là gì? Nhiều tiền gen gây
u mã hóa cho các nhân tố loạn sinh trưởng – các protein kích thích phân bào hoặc
mã hóa cho các protein khác ảnh hưởng đến tổng hợp hay chức năng của các nhân
tố sinh trưởng. Khi chúng thể hiện chức năng bình thường, đúng lượng phù hợp, vào
đúng lúc cần thiết thì các protein này kiểm soát phân bào và kiểm soát sự phân hóa
đúng chuẩn mực.
Để một tiền gen gây u chuyển thành gen gây u phải có một thay đổi hoặc một
đột biến xảy ra trong DNA của tế bào. Có thể là do một nhiễm sắc thể bò chuyển
đổi vò trí. Sự chuyển vò xảy ra khi các nhiễm sắc thể trao đổi lẫn nhau các mảng nhỏ
của chúng. Thí dụ sự biến hình ác tính trong bệnh bạch cầu tủy thì liên quan đến sự
chuyển vò trí protooncogen từ vò trí bình thường ở thể nhiễm sắc 9 lên thể nhiễm sắc
22. Đó thực ra là một nhiễm sắc thể phối hợp gồm thân là nhiễm sắc thể số 9, trên
đó một mảnh cuối của nhiễm sắc thể 22 gắn vào. Protooncogen myc trong ung thư
lymphoma Burkitt là do chuyển vò trí thể nhiễm sắc 8 lên 14.

bào. Sự đột biến hay mất gen ức chế khối u có thể gây ra ung thư. Trong bệnh bướu
nguyên bào võng mạc, một loại ung thư của trẻ em mang tính di truyền, gần đây các
nhà khoa học đã khám phá ra được nguyên nhân là do mất một đoạn của nhiễm sắc
thể 13. Đoạn bò mất đó mang các gen kiềm chế không cho các oncogen của ung thư
này phát triển.
Thêm nhiều bằng chứng xác nhận rằng bất kỳ đột biến nào ngăn chặn gen triệt
khối u đều góp phần gây loạn phát phân bào, tức không kiểm soát nổi mức phân
bào chuẩn mực và có thể sinh ra một tế bào ung thư.
Ở ung thư đại tràng như ở nhiều dạng ung thư khác ở người, người ta nhận thấy
quá trình di căn của một ung thư đại tràng phát triển từ từ qua ba chặng. Dấu hiệu
đầu tiên là trong các tế bào bình thường của biểu mô lót đại tràng xuất hiện tần số
phân bào bất thường. Sau đó xuất hiện một u lành (chồi polip) trong vách đại tràng.
Và cuối cùng xuất hiện một khối u ác tính. Những thay đổi ở mức tế bào này diễn ra
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
11

song song với ba thay đổi ở mức độ DNA bao gồm sự hoạt hóa của một gen gây u
trong tế bào và sự vô hiệu hóa của hai gen ức chế khối u.

1.3.2.1. Gen RbGen làm phát triển bướu nguyên bào võng mạc (retinoblastoma) ở người được
gọi tên là gen Rb (retinoblastoma supectability gene). Đột biến ở gen Rb làm phát
triển dạng ung thư khác ở người như sacôm xương (osteosarrcom). Khác với bệnh
retioblastoma do di truyền, những đột biến của Rb thøng xuất hiện ở tế bào sinh
dưỡng hơn là do di truyền từ bố mẹ. Retinoblastoma tạo ra do đột biến hai lần ở
phạm vi gen Rb của thể nhiễm sắc 13.
Thông qua các nghiên cứu người ta biết sản phẩm protein của gen Rb tham gia

p73 phổ biến trong nhiều loại u như u nguyên bào thần kinh, ung thư đại tràng.
1.3.3. Gen điều hoà chết tế bào theo chương trình Sơ đồ 1: Hiện tượng chương trình hóa sự chết tế bào

Apoptosis – là hiện tượng chương trình hóa sự chết của tế bào (programmed
cell death – PCD) – hiện tượng này trở nên cần thiết trong giai đoạn phát triển nào
đó của tế bào. Người ta cũng quan sát thấy hiện tượng này trong ung thư như giết tế
bào ung thư bằng tế bào NK (natural killers) hay bằng tế bào độc cũng như tế bào
lymphocyt độc phủ kháng thể. Nhưng tế bào ung thư dễ đi vào apoptosis là khi gây
ra DNA hư hại được quyết đònh sự có mặt trong chuyển dạng biến dò của gen p53
hoặc sử dụng các thuốc ở pha G
1
hoặc các tia ở pha G
2
.
Cơ chế điều hòa vòng tế bào pha p53 chưa được biết chính xác nhưng có lẽ nó là
chất điều hòa sao mã của các gen tham gia photphoryl hóa nhiều chỗ qua nhiều
enzym kinaza, ví dụ kinaza cdk1 (cell division kinase) làm photphoryl hóa protein
p53, p73 vò trí Ser-315. Khi được photphoryl hóa, p53 cũng có ảnh hưởng đến các
protein biến dạng của các virút gây ung thư loại DNA. Chính chỗ này p53 có thể

Chiếu xạ Bax Apoptosis

Chemo’s p53 Bcl-2

Oncogens p21 Chu trình tế bào
E1A, tTAg, Gadd45
c-myc

Kích thích gen ức chế tăng trưởng dương tính
tăng trưởng tế bào

Làm ngừng sinh sản tế bào ở giai đoạn G
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
14 Ngày nay đã xác đònh được rằng các gen đề phòng hay gây chết tế bào theo
chương trình cũng tham gia tạo những biến đổi quan trọng trong sự cân bằng ung
thư. Một nhóm lớn các gen điều hòa chết tế bào theo chương trình đã được xác đònh,
các gen này được ghi nhớ bằng các nhóm ba chữ bắt đầu bằng chữ b.
Gen chống chết tế bào theo chương trình lần đầu tiên đã xác đònh, bcl-2 là một
thành phần của một nhóm lớn protein homodime và heterodime hóa, một số protein
này ức chế tế bào chết theo chương trình (như chính bcl-2 và bcl-xL) trong khi các
gen khác (như bax, bad, và bcl-xS) tạo điều kiện cho tế bào chết theo chương trình.
Việc phát hiện ra gen bcl-2, một gen prototyp trong loại này bắt đầu với nhận
xét là khoảng 85% các u lympho tế bào B của loại nang có mang một chuyển đoạn
điển hình t(14:18)(q22:q21). Cần nhắc lại rằng 14q32 là vò trí các gen chuỗi nặng
của globulin miễn dòch cũng liên quan đến u lympho Burkitt. Việc xếp cạnh vò trí
hoạt động phiên mã với bcl-2 (khu trú ở 18q21) gây bộc lộ quá mức bcl-2.
Theo những cơ chế chưa biết rõ, việc bộc lộ quá mức bcl-2 bảo vệ các lympho
bào khỏi bò chết theo chương trình và cho phép chúng sống lâu dài, vì vậy gây nên
sự tích lũy quá mức của lympho bào B, gây bệnh hạch và xâm nhập tủy xương. Vì
các u lympho bộc lộ quá mức bcl-2 phần lớn phát sinh là do giảm chết tế bào theo
chương trình hơn là do bùng nổ tăng sinh tế bào, nó có xu hướng lành tính (phát
triển chậm) so với phần lớn các u lympho khác.
Chứng minh cho vai trò của bcl-2 trong tạo u lympho là nhận xét rằng chuột
chuyển gen với bcl-2 phát sinh u lympho tế bào B. Không chỉ chức năng của bcl-2 là

vậy trong khi các homodime của bcl-2 tạo điều kiện cho sự sống sót của tế bào (có
lẽ do sự thay thế bax tạo kênh từ màng ty thể), các homodime bax tạo thuận lợi cho
chết tế bào theo chương trình.
Cuối cùng mặc dù họ bcl-2 của các gen bcl-2 đóng vai trò quan trọng trong điều
hoà chết tế bào theo chương trình, ít nhất có hai gen kết hợp với ung thư khác cũng
liên quan đến chết tế bào theo chương trình là gen p53 và protooncogen c-myc. Cơ
chế phân tử của chết tế bào theo chương trình gây nên do hai bước cắt ngang của
đường bcl-2. Gen c-myc gây chết tế bào theo chương trình khi các tế bào bò điều
khiển bởi hoạt hóa c-myc, nhưng sự phát triển được giới hạn bởi khả năng giới hạn
của các yếu tố môi trường.
Khi đối mặt với các tín hiệu như vậy, tế bào được lập chương trình chết bởi điều
hoà tăng p53 và các tín hiệu chưa được xác đònh khác. Biểu lộ quá mức của bcl-2 có
thể giải thoát cho tế bào không bò chết theo chương trình gây nên do c-myc. Vì vậy
hình như myc và bcl-2 có thể hợp tác trong tạo u - c-myc kích thích sinh sản và bcl-2
ngăn cản chết tế bào ngay cả khi các yếu tố phát triển trở nên bò hạn chế. Đây là
một trong nhiều ví dụ trong đó hai hay nhiều gen ung thư hợp tác để gây phát sinh
ung thư.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
16 1.4. MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP TÁCH VÀ NUÔI CẤY TẾ BÀO UNG
THƯ

1.4.1. Lòch sử phát triển nuôi cấy của tế bào ung thư

Khoa học về nuôi cấy mô và tế bào đã phát triển một cách vững chắc trong suốt
thế kỷ 20. Từ những năm 1885, Wilhelm Roux ghi nhận rằng phôi gà có thể phát
triển ở dung dòch muối sinh lý trong vài ngày. Nhiều thử nghiệm trước đó cũng

Quá trình thu mẫu và xử lý mẫu phải được tiến hành nhanh chóng. Mẫu sau khi
thu sẽ được tiến hành xử lý tại phòng thí nghiệm. Quá trình xử lý mẫu phải được
thao tác trong điều kiện vô trùng. Sau khi lựa chọn phần mô còn sống và loại bỏ
phần mô hư hoặc chết, phần mô sống còn lại sẽ được rửa qua nhiều lần bằng dung
dòch muối sinh lý có chứa kháng sinh hoặc dung dòch HBSS – Hank’s balanced salt
solution để loại bỏ bớt máu. Sau đó cắt khối mô ra thành từng mảnh nhỏ (1-2 mm
3
),
thường được tiến hành trên đóa petri. Sau khi thêm vào đóa petri một ít dung dòch
nuôi cấy (1 – 2ml), dùng pipet hoặc pastette để chuyển các mảnh mô từ đóa petri
vào bình nuôi cấy, để trong tủ nuôi khoảng từ 2 – 3 giờ, điều này sẽ giúp cho sự
bám của tế bào vào bình nuôi cấy tốt hơn. Thêm vào 5 – 10ml, để yên bình nuôi
cấy cho đến từ 72 – 96 giờ. Sau nhiều ngày nuôi cấy, tế bào phát triển bám dính vào
thành bình và khi đến mật độ cần thiết sẽ được tiến hành cấy chuyền.
Đây là một trong những phương pháp ít làm tổn thương đến tế bào nhất, thời
gian thao tác ngắn, đồng thời dễ dàng thao tác. Nhưng điều cần lưu ý là thao tác
phải chuẩn, những mẫu mô phải được cắt nhỏ, quá trình thí nghiệm phải được tiến
hành trong điều kiện vô trùng tuyệt đối để tránh sự nhiễm. 1.4.2.2. Phương pháp tách tế bào ung thư từ mẫu dòch của cơ thể

Phương pháp này thường được sử dụng để tách tế bào từ những mẫu dòch của cơ
thể như: dòch màng bụng, dòch màng phổi…
Các mẫu dòch được thu tại bệnh viện và đem về xử lý tại phòng thí nghiệm vô
trùng, tùy theo mẫu dòch lấy với thể tích khác nhau. Đem mẫu dòch đi ly tâm,
khoảng 3000g/ 20 phút. Loại bỏ dung dòch nổi, huyền phù phần cặn với dung dòch
muối sinh lý PBS. Nếu mẫu chứa số lượng tế bào máu nhiều ta có thể loại bỏ bằng
phương pháp ly tâm với dung dòch Ficoll. Khoảng 10ml dung dòch tế bào huyền phù
với PBS hoặc HBSS cho vào dung dòch Ficoll, ly tâm khoảng 1000g/ 20 – 30 phút.

- Quá trình này lập lại cho đến khi thu được hết phần tế bào còn lại.
(2) Quy trình trypsin lạnh
Có thể ủ các mảnh mô nhỏ trong dung dòch trypsin ở nồng độ thích hợp, tại nhiệt
độ khoảng 4
o
C, điều này sẽ giúp cho việc tách tế bào dễ dàng và ít ảnh hưởng đến
tế bào. Sau 6 – 8 giờ, giải đông khoảng 30 phút ở nhiệt 37
o
C. Sau khi ly tâm loại bỏ
phần nổi, thêm vào môi trường nuôi cấy.

1.4.3. Những kỹ thuật cần thiết cho việc nuôi cấy tế bào

Ngày nay việc nuôi cấy tế bào đã được thực hiện rộng khắp trên thế giới. Hơn
50 năm kể từ lần đầu tiên công bố sự xuất hiện dòng tế bào ung thư cổ tử cung ở
người (Hela), đến nay các nhà nghiên cứu đã thiết lập khoảng 3.000 dòng tế bào
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
19

ung thư và có 1000 dòng được sử dụng thường xuyên, phần lớn có nguồn gốc từ ung
thư ở người.
Đây là nguồn mẫu cần thiết cho các phân tích sinh hóa của tế bào ung thư. Điều
này mở ra cơ hội cho các nhà khoa học có điều kiện nghiên cứu, tìm hiểu sâu hơn
về các đặc tính sinh học đồng thời xác đònh và mô tả đặc điểm của tế bào ung thư.
Với mục đích sử dụng các dòng tế bào này để nghiên cứu hoạt tính của các hoạt
chất kháng ung thư trong điều kiện in vitro, sản xuất vaccin điều trò.
Mặc dù những dữ liệu có được từ các phòng thí nghiệm vẫn cần phải được xem
xét một cách thận trọng, nhưng vai trò thực tiễn của việc nuôi cấy của các dòng tế
bào ung thư trong nghiên cứu và điều trò bệnh ung thư đã được thừa nhận.

Medical Research Institue, đây là môi trường đầu tiên không sử dụng huyết thanh
nhưng có bổ sung thêm một vài chất hỗ trợ gần giống huyết thanh. Một môi trường
khác không huyết thanh được gọi là môi trường Waymouth dùng để nuôi cấy tế bào
L929 ở chuột, nhưng môi trường này cũng được chứng minh là có thể sử dụng trong
nuôi cấy các dòng tế bào khác.
Năm 1959, McCoy mô tả công thức cơ bản để tạo ra môi trường hỗ trợ cho mục
tiêu nuôi cấy sơ cấp. Môi trường RPMI 1640 do Moore và đồng sự thiết lập tại Park
Memorial Institue, được sử dụng phổ biến cho nhiều dòng tế bào khác nhau và cũng
được các phòng thí nghiệm chọn lựa để nuôi cấy tế bào và mô bạch huyết.
Môi trường có thể được cung cấp từ các nguồn thương mại với các công thức
khác nhau, như môi trường có nồng độ bình thường (có thể sử dụng từ 9 – 12
tháng), hoặc môi trường có nồng độ 10X (có thể sử dụng trong vòng 12 – 24 tháng),
hoặc môi trường có nồng độ đậm đặc (có thể sử dụng từ 2 – 3 năm).

1.4.3.2. Huyết thanh

Mặc dù môi trường có chứa nhiều chất bổ dưỡng cần thiết cho sự phát triển,
nhưng huyết thanh là yếu tố hỗ trợ cho khả năng sống và phát triển của tế bào trong
nuôi cấy. Huyết thanh kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy
chuyền và các protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzym gây
tổn thương tế bào. Huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh, đồng thời chúng còn có
tác dụng cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi.
Huyết thanh bao gồm hocmon, các nhân tố tăng trưởng, lipid, các protein vận
chuyển và các chất kết dính. Trong các nghiên cứu nuôi cấy tế bào ung thư, huyết
thanh bê và huyết thanh thai bò được sử dụng rộng rãi, ngoài ra cũng thể sử dụng
huyết thanh người và ngựa.
Hiện nay, trừ những dòng tế bào được thuần hóa với môi trường tổng hợp hoàn
toàn, đa số được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung từ 5 – 20% huyết thanh là tốt
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh

tuy thế ở nhiệt độ thấp hơn tế bào vẫn phát triển, nhưng chúng sẽ chết một cách
nhanh chóng khi nhiệt độ ở khoảng 40
o
C. Đặc biệt khi nuôi cấy tế bào động vật
điều kiện về độ ẩm và nồng độ CO
2
trong không khí rất quan trọng. Nồng độ CO
2

thường là 5% thích hợp nhất.
Phần lớn các tế bào ung thư cần thiết phải ổn đònh độ pH từ 7,2 – 7,4 và môi
trường phải được thay đổi thường xuyên. Vì khi tế bào phát triển sẽ tạo nên sự hô
hấp gây ra acid hóa môi trường. Có thể kiểm tra độ pH khi thêm phenol đỏ vào môi
trường. Nếu môi trường màu vàng pH 6,5; màu cam pH 7; màu đỏ pH 7,4; màu đỏ
tía pH 7,8. Độ ẩm khi nuôi cấy cũng rất quan trọng, sự bốc hơi từ môi trường có
muối sẽ làm cho tế bào bò phân giải gây tổn hại đến màng tế bào.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
22

Hầu hết các tế bào ung thư phát triển cần thiết phải có giá đỡ và hầu như các tế
bào ung thư phát triển từ lớp đơn trên đóa thủy tinh hay đóa nhựa. Một số trường hợp
ngoại lệ là ở dòng tế bào tạo máu và tế bào ung thư phổi nhỏ thích hợp phân chia ở
thể huyền phù. Tế bào bám dính có thể tăng số lượng lớn bằng cách bám vào các
giá đỡ nhờ vào các thành phần chất nền (ECM – Extracellular matrix). Hiện nay các
protein ECM được sử dụng phổ biến bao gồm collagen, fibronectin, laminin.

1.4.4. Nuôi cấy sơ cấp

Nuôi cấy sơ cấp là lần nuôi cấy đầu tiên ở các mô được lấy trực tiếp từ cơ thể.

để nhằm duy trì khả năng phát triển của tế bào. Tuy nhiên khi thực hiện cấy chuyền
thì mật độ tế bào sẽ giảm xuống nhưng ở mức độ tế bào có thể phát triển trở lại một
cách tối ưu nhất và đảm bảo lượng môi trường đầy đủ cho tế bào phát triển tiếp tục.
Người ta sử dụng enzym như trypsin để tách tế bào và phương pháp tách này
cũng tác động đến kết quả thu hoạch tế bào trong những lần nuôi cấy. Sau khi nuôi
cấy sơ cấp, tế bào qua một vài lần cấy chuyền sẽ được tiến hành nuôi cấy thứ cấp
để tạo ra dòng tế bào.
Cấy chuyền được thực hiện tốt nhất khi tế bào phát triển ở log phase, lúc đó tế
bào được xem là khỏe mạnh nhất. Sau đó dòng tế bào cần phải được xác đònh và
nhận dạng nguồn gốc. 1.4.6. Tạo dòng

Dòng là một quần thể tế bào có nguồn gốc từ một tế bào riêng biệt và tạo dòng
là quá trình tách tế bào riêng biệt và phát triển các tế bào ở thế hệ sau. Vì vậy tạo
dòng có khả năng duy trì phân bào trong một thời gian dài mà không thay đổi đặc
tính ban đầu của mô gốc.
Hiệu quả tạo dòng được đánh giá trên tiêu chuẩn như khả năng nuôi cấy, các
dòng được sản xuất, số lượng tế bào được nuôi cấy. Thường hiệu quả tạo dòng trong
nuôi cấy sơ cấp rất thấp khoảng dưới 1%, trong khi đó vẫn có những dòng tế bào có
hiệu quả tạo dòng cao hơn trong nuôi cấy sơ cấp, tùy thuộc vào từng dòng tế bào mà
hiệu quả nuôi cấy sẽ thay đổi từ 10 – 100%. Người ta có thể tạo dòng tế bào trên
đóa hoặc trong agar.

1.4.7. Kỹ thuật đông lạnh tế bào

Bảo quản nguồn tế bào dưới nhiệt độ – 130
o
C cho phép dự trữ tế bào trong một

ung thư. Điều trước tiên đó là mối liên quan giữa dòng tế bào ung thư và mô gốc,
cần thiết phải xác nhận rằng dòng tế bào ung thư này có nguồn gốc từ mô gốc, điều
này có giá trò đặc biệt trong việc xác đònh các liệu pháp trò bệnh. Điều quan trọng
thứ hai là nhằm kiểm soát tính đồng nhất và khả năng lây nhiễm giữa các dòng tế
bào với nhau.
Lòch sử của quá trình nuôi cấy tế bào cho thấy rằng sự lây nhiễm giữa các dòng
tế bào vẫn thường xãy ra. Trong suốt những năm 70-80 nhiều công trình nghiên cứu
của Stanley chứng minh rằng sự lây nhiễm đã xảy ra ở dòng tế bào Hela. Hệ quả là
dẫn đến sự lây nhiễm lan tràn ở các phòng thí nghiệm và sự pha trộn giữa các dòng
tế bào đã xuất hiện.
Vấn đề lây nhiễm hiện nay vẫn còn là một vấn đề nan giải. Các nhà nghiên cứu
không chỉ quan tâm đến sự lây nhiễm giữa các dòng tế bào cùng loài mà còn là sự
lây nhiễm giữa các dòng tế bào khác loài. Vì vậy cần thiết phải có phương pháp
không chỉ xác đònh rõ nguồn gốc duy nhất của dòng tế bào mà còn phải xác nhận
nguồn gốc của loài.
Thử nghiệm phân lập và nuôi cấy tế bào ung thư cổ tử cung
Tạ Ngọc Tuyết Minh
25

Người ta đã dùng các phương pháp như các marker DNA, phân tích cytogenic,
PCR… để xác nhận nguồn gốc của dòng tế bào và kiểm tra sự lây nhiễm với các
dòng tế bào khác. Mặt khác sự xác nhận đặc điểm còn bao gồm sự kiểm tra, theo
dõi các điểm đặc trưng của dòng tế bào, sự quan sát hình thái, tỷ lệ phát triển, hiệu
quả tạo dòng, các biểu hiện kháng nguyên, đặc điểm chu trình tế bào.

1.5.2. Đặc điểm phát triển của dòng tế bào ung thư

Điều quan trọng của dòng tế bào ung thư là khả năng cung cấp nguồn tế bào mới
để tiến hành các nghiên cứu về bệnh ung thư. Dòng tế bào phải phản ảnh tính chất
của mô gốc.