ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
NGUYỄN THỊ NHẬT UYÊN THU NHẬN VÀ XỬ LÝ NGÀ RĂNG NGƯỜI
LÀM GIÁ THỂ NUÔI CẤY
TẾ BÀO GỐC TỦY RĂNG NGƯỜI
Chuyên ngành: Sinh lý động vật
Mã số: 60 42 30
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:
TS. TRẦN LÊ BẢO HÀ THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH – 2012
LỜI CẢM ƠN
Danh mục hình vii
ĐẶT VẤN ĐỀ 1
Chương 1. TỒNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Kỹ nghệ mô 3
1.1.1. Giá thể ba chiều 3
1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều 4
1.1.1.2. Nguyên liệu thiết kế giá thể 4
1.1.2. Tế bào trong kỹ nghệ mô 4
1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể 5
1.1.3.1. Sự bám dính 5
1.1.3.2. Sự di chuyển 5
1.1.3.3. Sự tăng trưởng và biệt hóa 6
1.1.4. Giá thể dùng trong nha khoa . 8
1.2. Ngà răng 11
1.2.1. Cấu trúc ngà răng 12
1.2.2. Thành phần cấu tạo và các đặc tính của ngà răng 13
1.2.2.1. Thành phần hữu cơ 13
1.2.2.2. Thành phần vô cơ 14
1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng 14
1.2.3. Giá thể ngà răng 15
1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng 15
ii
1.4. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước 16
1.4.1. Tình hình nghiên cứu ngoài nước 16
1.4.2. Tình hình nghiên cứu trong nước 18
Chương 2. VẬT LIỆU – PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu 19
2.1.1. Mẫu vật 19
3.3. Kết quả đánh giá tế bào thu được từ tủy răng. 41
3.3.1. Sự biểu hiện một số marker của tế bào gốc trung mô. 41
3.3.2. Kết quả đánh giá sự tăng sinh của tế bào trên bề mặt nuôi cấy 42
3.4. Kết quả khảo sát sự tăng sinh của tế bào tủy răng trên bề mặt giá thể 44
3.5. Khả năng bám của tế bào gốc tuỷ răng trên giá thể 46
Chương 4. KẾT LUẬN – KIẾN NGHỊ
Kết luận 48
Kiến nghị 48
Danh mục công trình của tác giả viii
Tài liệu tham khảo ix
Phụ lục iv
DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT
BMPs Bone morphogenetic proteins
DFCs Dental follicle cells
DMEM Dullbecco Modification of Eagle’s Medium
DMSO Dimethyl sulfoxide
DPCs Dental Pulp Cells
DPSCs Dental Pulp Stem Cells
ECM Extra Cellular Matrix
EDTA Ethylene Diaminetertraacetid Acid
EGF Epithelial Growth Factor
FBS Fetal Bovine Serum
Bảng 2.1. Danh sách các dụng cụ sử dụng 20
Bảng 2.2. Danh sách các thiết bị sử dụng 21
Đồ thị 3.1. Đường cong tăng trưởng của tế bào tủy răng người nuôi cấy ở lần
cấy chuyền thứ 3 42
Đồ thị 3.2. Biểu diễn sự tương quan giữa mật độ quang (OD) với các mốc thời
gian nuôi cấy 45 vii
DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô 3
Hình 1.2. Ba yếu tố quan trọng cho kỹ nghệ mô trong nha khoa: tín hiệu cho
sự phát triển, tế bào gốc và khung nâng đỡ của chất nền ngoại bào 8
Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các
ứng dụng lâm sang của liệu pháp tái sinh 9
Hình 1.4. Nguyên bào ngà và ống ngà 13
Hình 1.5. Hình dạng ống ngà 13
Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM 15
Hình 2.1. Mẫu răng người sau khi thu nhận 19
Hình 2.2. Cách cắt răng tạo hình mẫu ngà 25
Hình 2.3. Nguyên tắc phương pháp MTT 30
Hình 3.1. Mẫu ngà thu nhận để làm thí nghiệm sau khi xử lý 32
Hình 3.2. Mẫu chứng bề mặt ngà chưa xử lý 33
Hình 3.3. Bề mặt ngà xử lý bằng EDTA / Axit Citric 33
Hình 3.4. Mô tủy răng sau khi nhuộm H&E (100X) 36
Khác với các bệnh khác, người ta có thể mắc bệnh răng miệng ngay từ lúc mới
sinh cho đến khi sắp từ giã cõi đời, bệnh ảnh hưởng lớn đến sức khỏe do không
được chăm sóc và điều trị đúng cách, dẫn đến rụng răng, hạn chế khả năng nói và
nhai của con người và mất răng sớm, từ đó làm giảm chất lượng cuộc sống. Do tính
chất phổ biến với mọi lứa tuổi như vậy mà việc phòng chống và chữa trị các bệnh
về răng miệng là một nhiệm vụ có tính xã hội hoá cao.
Ngày nay, với sự tiến bộ của công nghệ trong thế kỷ 21, người ta mong đợi sẽ
giữ được răng tự nhiên hoặc thay thế răng chức năng trong suốt cuộc đời họ. Các kỹ
thuật nha khoa hiện nay như phương pháp trám ống tủy (loại bỏ tủy hư) và cấy ghép
răng (implant) giúp tăng tỷ lệ thành công trong việc giữ răng, nhưng răng của nhiều
người không phục hồi chức năng hoàn toàn; đồng thời, các phương pháp điều trị
này đòi hỏi phải tuân theo những nguyên tắc nghiêm ngặt, kỹ thuật phức tạp, theo
dõi và chăm sóc răng định kỳ nên các nhà khoa học trên thế giới đã và đang hướng
đến nghiên cứu những phương pháp nhằm tái tạo răng.
Đã có nhiều công trình trên thế giới tiến hành nghiên cứu phân lập và nuôi cấy tế
bào gốc tủy răng cũng như tạo khung nâng đỡ, dùng để phục hồi tủy răng trong
chữa trị mà không cần loại bỏ hoàn toàn tủy răng. Khi đó, tế bào tủy răng đã được
nuôi trên giá thể polymer tổng hợp như giá thể alginate, giá thể polymer poly
(lactic-co-glycolic) acid, giá thể composite và giá thể polymer tự nhiên dùng trong
công nghệ nội nha như collagen. Tuy nhiên, sự phân hủy các polymer tổng hợp, cả
trong điều kiện in vitro và in vivo, giải phóng các sản phẩm phụ khiến cho vi môi
trường giá thể không lý tưởng cho sự tăng trưởng mô, có hại đến chức năng của tế
bào và các polymer tự nhiên có thể gây ra các đáp ứng miễn dịch.
Để khắc phục nhược điểm của các giá thể polymer tự nhiên và polymer tổng
hợp, hiện nay, các nhà khoa học hướng tới việc sử dụng ngà răng. Ưu điểm của giá
2
thể ngà là giá thể tự nhiên, chi phí thấp, nguồn mẫu thu dồi dào và hỗ trợ sự bám
dính, tăng sinh của tế bào gốc tủy răng người. Ngoài ra, giá thể ngà đã được chứng
các tín hiệu cơ học, tín hiệu điện và các thành phần cấu trúc, hóa học từ thành phần
ngoại bào giống như môi trường in vivo (thành phần cấu trúc giống chất nền ngoại
bào của mô hay cơ quan). Do đó, để tạo ra mô hay cơ quan nhân tạo phải thỏa mãn
những yêu cầu sau: giá thể, tế bào, nhân tố tăng trưởng thích hợp và điều kiện nuôi
cấy tối ưu. Trong đó, giá thể là một thành phần rất quan trọng trong kỹ nghệ mô.
Hình 1.1. Các nhân tố trong kĩ nghệ mô
1.1.1. Giá thể ba chiều [4]
Giá thể là khuôn ngoại bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp, giúp điều tiết tế bào,
hướng dẫn tế bào tăng trưởng và tái tạo mô ba chiều. Sau khi được cấy vào giá thể,
các tế bào sẽ bám dính, tăng sinh, biệt hóa và tổ chức tạo mô song song với quá
trình tiết ra các chất nền ngoại bào (ECM). Vì thế để tạo ra các mô và cơ quan có
4 hình dạng và kích thước mong muốn, cần chọn lựa giá thể có hình dạng và cấu tạo
phù hợp.
1.1.1.1. Các đặc tính của giá thể ba chiều [4]
Có cấu trúc lỗ xốp bên trong (đường kính lỗ ít nhất 60-100 m) để cung cấp
dưỡng chất, giúp tăng trưởng mô, phân bố các mạch máu….
Có khả năng tự phân hủy sinh học để khi các tế bào tiết các thành phần ngoại bào
bào hữu ích cho việc phát triển liệu pháp tế bào.
1.1.3. Khả năng tương tác của tế bào với giá thể
1.1.3.1. Sự bám dính [9]
Sự bám dính của tế bào thông qua các thành phần của ECM như fibronectin,
vitronectin, collagen hay laminin gắn lên các thụ thể integrin của tế bào. Ở vật liệu
thế hệ mới, các thụ thể và trình tự phụ trợ đều được gắn trực tiếp trên vật liệu.
Các phân tử ECM này có thể được hấp thu trên bề mặt vật liệu từ môi trường
xung quanh. Bề mặt mềm và thấm nước có khả năng hấp thu các protein ngoại bào
tốt. Tuy nhiên, vật liệu sử dụng trong kĩ nghệ mô đa số là polymer tổng hợp như
polyethylene, polyurethane, polypropylene hoặc polystyrene rất kị nước ở trạng thái
chưa biến đổi. Do đó các giá thể ba chiều thường được phủ một lớp dung dịch ECM
tự nhiên như matrigel, gelatin, collagen
1.1.3.2. Sự di chuyển [9]
Sự di chuyển của tế bào trên giá thể rất được quan tâm vì chúng đóng vai trò
quyết định tính đa dạng của các hiện tượng sinh lý và bệnh lý học, cũng như thành
phần giá thể trong kỹ nghệ mô. Hoạt động đó bị chi phối bởi các tác nhân sinh hóa
và tương tác tế bào.
Sự di chuyển của tế bào được chia thành hai giai đoạn là quá trình dàn trải (bám
dính) và chuyển động của tế bào. Dàn trải là một quá trình kết hợp sự bám dính liên
tục và sự co thắt có chọn lọc của tế bào. Đầu tiên, tế bào nhô ra các phiến mỏng
chứa nhiều vi sợi và bám dính chủ yếu ở phiến nhô ra này. Ở giai đoạn sau, tế bào
chất ở chỗ nhô ra cũng được mở rộng, hoàn thiện sự dàn trải tế bào. Nếu tế bào gặp
tế bào khác, quá trình ức chế sẽ xảy ra và ngăn chặn sự di chuyển xa hơn của tế bào
trong giá thể
Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự di chuyển tế bào: bề mặt giá thể, độ gồ ghề,
trạng thái lỗ của giá thề và gradient trong môi trường nuôi cấy…
6 - Chất liệu tạo giá thể: đóng vai trò quyết định khi thiết kế giá thể. Tuy nhiên,
người ta nhận thấy nếu có sự kết hợp nhiều loại chất liệu với nhau khi thiết kế giá
thể ba chiều dùng để nuôi cấy tế bào hoặc đưa vào cơ thể làm vật ghép thì hoạt tính
sinh học sẽ tăng lên và giúp tế bào tăng sinh tốt hơn cũng như vật liệu ghép tốt hơn.
Điều này có thể giải thích do thành phần cấu trúc trong các mô là hỗn hợp
của rất nhiều loại chất liệu. Sự kết hợp nhiều loại vật liệu tạo ra một khung sườn
giống môi trường của tế bào sinh sống, do đó làm tăng quá trình tăng sinh và biệt
hóa của tế bào cũng như tạo ra một cấu trúc phù hợp với chức năng mô thay thế
[16].
- Cấu trúc giá thể
Kích thước các lỗ trên giá thể không chỉ ảnh hưởng đến sự di chuyển của
các tế bào trong giá thể mà cũng ảnh hưởng đến sự biệt hóa và tăng sinh của tế bào.
Đặc biệt kích thước lỗ ảnh hưởng trực tiếp đến việc phân phối chất dinh dưỡng và
các nhân tố biệt hóa đều khắp giá thể.
Tế bào sẽ biệt hóa nhanh hơn trên giá thể có kích thước lỗ tương đối so
với giá thể có kích thước lỗ lớn. Giá thể có kích thước lỗ lớn làm gia tăng tỉ lệ tăng
sinh tế bào do đó tế bào không chuyển sang giai đoạn biệt hóa.
Như vậy, có thể kết luận độ thông thoáng của vật liệu xốp giúp tế bào tăng
sinh mạnh. Tuy vậy, sự thông thoáng quá mức có thể giảm hiệu quả của quá trình
biệt hóa do cung cấp nhiều không gian cho tế bào tăng sinh [53].
- Các nhân tố biệt hóa [48]
Giá thể cần được bổ sung các nhân tố tăng trưởng để có được các tính
chất sinh học chuyên biệt cho từng loại tế bào. Chất tăng trưởng có thể tồn tại tự do
trong dung dịch hoặc cố định lên bề mặt giá thể.
Sự hỗ trợ bề mặt vật liệu sinh học với những phân tử có hoạt tính sinh
học là con đường đơn giản để tạo ra vật liệu có tính sinh học cao hay còn gọi là vật
liệu có khả năng phỏng sinh học. Giá thể có thể được gắn trình tự peptide đơn giản
của protein ngoại bào hoặc các nhân tố tăng trưởng. Khi đó, các tế bào bám dính tốt
học và sinh lý tương thích khi đưa trở lại cho bệnh nhân. Một số polymer tổng
hợp và tự nhiên, như calcium/phosphate, đã được thử nghiệm trong kỹ nghệ mô tái
tạo ngà răng. Tuy nhiên, rất ít vật liệu có thể tái tạo hoàn chỉnh mô ngà răng, chúng
có thể hỗ trợ tế bào tăng trưởng nhưng không có khả năng gây ra sự khác
biệt hướng tới chuyên hóa tạo răng [17] [29].
9
Hình 1.3. Ngà răng – tủy hình thành phức hợp với định hướng tối ưu cho các ứng
dụng lâm sàng của liệu pháp tái sinh [35]
Một tập hợp các vật liệu sinh học đã được sử dụng trong các nghiên cứu gần đây
cho quy trình tái tạo mô răng. Ứng dụng vật liệu hoạt tính sinh học có sẵn như
khung nâng đỡ tiềm năng bao gồm vật liệu hữu cơ tự nhiên như collagen,
fibronectin, polymer hữu cơ như alginate (PLA), polyglycolic acid (PGA) và chất
đồng trùng hợp (copolymer) của chúng.
Các vật liệu hứa hẹn nhất trong việc tái tạo mô răng sẽ được mô tả tóm tắt sau
đây:
- Collagen [1], [25], [57]
Collagen thuộc về các polymer tự nhiên, là một protein quan trọng trong cơ
khả năng tái sinh tự nhiên tủy răng nha khoa.
- Gốm (ceramic)
Ceramic phosphate calcium cũng là một loại vật liệu thường được sử dụng để
tái tạo mô cứng bởi vì có tính chất tương hợp sinh học cao và khả năng hỗ trợ sự
khác biệt của các tế bào.
Vật liệu này là một ứng dụng khá thích hợp cho răng nhân tạo và tái sinh
răng. Mặc dù vậy, nó được giới hạn để cấy ghép hoặc vật liệu phủ hay dạng bột vì
độ dai chỗ xương gãy kém, cũng phụ thuộc vào các kỹ thuật chuẩn bị (chế biến,
hình thành, mật độ) và độ xốp [51].
Gronthos và cộng sự (2000, 2002) đã chứng minh hoạt động của DPSCs liên
kết với bột hạt gốm (TCP / HA) do việc cấy ghép vào chuột suy giảm miễn dịch.
11 Kết quả cho thấy phát sinh thế hệ của một lớp giá thể như ngà răng trên bề mặt
khung nâng đỡ của các hạt TCP / HA cho thấy tiềm năng của nó như là vật liệu hoạt
tính sinh học cho việc sửa chữa phức hợp ngà – tủy. [10]
- Nhựa tổng hợp (composites) [10]
Một lựa chọn khác cho việc sử dụng khung nâng đỡ tổng hợp là sử dụng nuôi
cấy ba chiều với một chuỗi khung nâng đỡ ngoại bào nội sinh. Sản xuất và ứng
dụng vật liệu tổng hợp từ các polymer tái hấp thụ tổng hợp và có hoạt tính sinh học
calcium/phosphate như HA, TCP hoặc kích hoạt tính sinh học trở nên ngày càng
quan trọng, lợi dụng tính chất hoạt tính sinh học và tái hấp thụ dẫn tới các quá trình
hình thành mô. Qua đó, thiết kế tập trung vào việc giảm thiểu những bất lợi và sử
dụng các thuộc tính có lợi của các thành phần đơn để phát triển giá thể kỹ nghệ mô
tối ưu hóa với những đặc tính bao gồm cả tỷ lệ thoái hóa trong cơ thể cân bằng để
hình thành mô mới
Gần đây, hệ thống nuôi cấy khung nâng đỡ tự do có tên là "kỹ thuật tế bào viên"
đã được phát triển. Hệ thống này bao gồm việc hình thành dạng viên hay tập hợp tế
nguyên bào xương và nguyên bào sợi, là những tế bào chuyên biệt của mô liên kết.
Nguyên bào ngà cũng như toàn bộ tập đoàn tế bào của nhú răng có nguồn
gốc ngoại trung mô, bắt nguồn từ mào thần kinh. Khi đã được biệt hóa, nguyên bào
ngà bước vào một vòng đời liên quan đến việc tạo thành, duy trì và sửa chữa ngà
răng.
- Ống ngà: Trong quá trình tạo ngà, các đuôi nguyên bào ngà bị kéo dài dần,
chúng nằm trong những ống dài chạy xuyên qua lớp ngà đã khoáng hóa. Đó là ống
ngà, ống ngà được lấp đầy bởi các đuôi bào tương của nguyên bào ngà, dịch mô và
các thành phần cấu trúc hữu cơ như sợi collagen và chất khuôn của ngà quanh ống,
có vai trò nâng đỡ sinh lý cho ngà răng.
Các ống ngà có đường đi hình chữ S ở ngà thân răng, khá thẳng ở ngà chân
răng.
13
Ống ngà
14 1.2.2.2. Thành phần vô cơ
Tất cả các dạng ngà răng như ngà vỏ, ngà quanh tủy, ngà gian ống và ngà quanh
ống đều có thành phần tinh thể phosphate calcium dạng apatide. Các tinh thể của
ngà răng nhỏ hơn các tinh thể ở men răng, chúng có hình dạng và kích thước tương
tự như tinh thể ở xê-măng và xương.
Thành phần khoáng của ngà răng (các tinh thể hydroxyapatide) chứa calcium,
phosphate. Trong thành phần của ngà răng có một lượng nhỏ carbon, magnesium và
fluor với nồng độ thay đổi. Thành phần khoáng của ngà quanh tủy tương đối đồng
nhất và có tỉ lệ cao hơn so với thành phần hóa học trung bình của ngà răng.
1.2.2.3. Đặc tính của ngà răng
- Độ cứng: Ngà răng không cứng so với men răng nhưng cứng hơn xương và
xê măng. Độ cứng của ngà răng ở thân răng, cổ răng và chân răng tương tự nhau.
Ngà răng cứng nhất được thấy là ở khoảng cách 0,4 đến 0,6 mm cho tới khoảng
giữa lớp ngà. Ở gần tủy, ngà răng mềm hơn khoảng 30% và vùng ngà răng ở ngoại
vi tương đối mềm. Ngà xơ hóa cứng hơn hẳn so với ngà bình thường.
- Các đặc tính khác của ngà răng
Ngà răng tự nhiên có màu vàng nhạt.
Trong ngà có nhiều ống nhỏ chứa các đuôi nguyên sinh chất của các tạo ngà
bào, ống ngà có đường kính khoảng 5-10 m ( 1m = 10
–6
m, 1nm = 10
–9
m)
Trên 1mm
2
Hình 1.6. Bề mặt ngà chưa xử lý dưới SEM [52]
1.3. Tế bào gốc trong mô tủy răng
Những nghiên cứu đã chỉ ra rằng mô tủy của người trưởng thành chứa một quần
thể đa tiềm năng tế bào gốc tủy răng trung mô, tăng sinh cao cho sự tự đổi mới và
khả năng biệt hóa dạng tế bào khoáng hóa thành nguyên bào ngà, đã làm nổi lên
cuộc cách mạng nghiên cứu nha khoa và mở con đường mới đặc biệt cho điều trị và
tái tạo nha khoa nói riêng và kỹ nghệ mô nói chung.
Điều trị nha khoa bằng liệu pháp tế bào gốc cho phép sử dụng nguồn tế bào tự
thân, có nghĩa là tế bào gốc đã biệt hóa có thể được thu nhận và sử dụng điều trị trên
cùng một bệnh nhân, do vậy loại trừ khả năng không tương thích miễn dịch.
Đã có rất nhiều nghiên cứu về việc phân lập tế bào tủy răng của nhiều loài khác
nhau và chứng minh rằng chúng có tỉ lệ tăng sinh cao; đồng thời có khả năng biệt
hóa thành dạng tế bào khoáng hóa trong môi trường thích hợp (Nakashima, 1991;
Lớp mùn
Nguyên
bào ngà
Ống ngà
Copyright: Tài liệu đại học ©