1
Ch
Ch
−¬
−¬
ng iii
ng iii
C
C
¸
¸
c k
c k
ü
ü
thu
thu
Ë
Ë
t chÝnh c
t chÝnh c
ñ
ñ
a
a
c
c
«
«
ng ngh
ng ngh

n
n
gi
gi
è
è
ng
ng
v
v
«
«
tÝnh
tÝnh
in vitro
in vitro
(
(
vi
vi
nh
nh
©
©
n
n
gi
gi
è
è

chung
Nhân giống vô tính in vitro:

Là quá trình sản xuất một lợng lớn cây hoàn chỉnh, từ các bộ
phận, cơ quan nh chồi, mắt ngủ, vảycủ, đoạn thân, lá, của
cây mẹ ban đầu thông qua kỹ thuật nuôi cấy in vitro.
Nhân nhanh in vitro đợc ứng dụng vào:

Duy trì và nhân nhanh các kiểu gen quí làm vật liệu cho công
tác giống.

Nhân nhanh các loài hoa, cây cảnh khó trồng bằng hạt.

Duy trì nhân nhanh các dòng bố mẹ và các dòng lai để tạo hạt
giống cây rau, cây hoa và cây trồng khác.

Nhân nhanh kết hợp với làm sạch virus.

Bảo quản nguồn gen in vitro
u điểm của kỹ thuật nhân nhanh
in vitro:

Phơng pháp có hệ số nhân rất cao và cho ra các
cá thể tơng đối đồng nhất về mặt di truyền

Có thể nhân giống cây trồng ở qui mô công nghiệp
(kể cả trên các đối tợng khó nhân bằng phơng
pháp thông thờng)

Dễ dàng tạo đợc cây sạch virus

chính
trong
trong
nh
nh
â
â
n
n
v
v
ô
ô
tính
tính
in vitro
in vitro
Bớc 0
lựa chọn cây mẹ
Ra rễ
Giai đoạn
vờn ơm
Bớc 4
Chuyển ra môi trờng tự nhiên
Bớc 2
Nhân nhanh
Lấy mẫu
Bớc I
Nuôi cấy khởi động
Thích nghi

chu
ẩ
ẩ
n
n
bị
bị
c
c
â
â
y
y
m
m
ẹ
ẹ

Trớc khi tiến hành nhân giống in vitro cần chọn
lọc cẩn thận các cây mẹ (cây cho nguồn mẫu nuôi
cấy).

Các cây này cần phải sạch bênh, đặc biệt là bệnh
virus và ở giai đoạn sinh trởng mạnh.

Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trờng
thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu
bệnh hiệu quả trớc khi lấy mẫu cấy sẽ làm giảm
tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống và sinh
trởng của mẫu cấy in vitro.

2
0,1% xử lý trong 5-10 phút, NaOCl,
Ca(OCl)
2
5-7% xử lý trong 15-20 phút, hoặc H
2
O
2
, dung
dịch Br
5
B
B
ớ
ớ
c 2: Nh
c 2: Nh
â
â
n nhanh
n nhanh

Là giai đoạn kích thích mô nuôi cấy phát sinh hình
thái vă tăng nhanh số lợng thông qua các con
đờng: hoạt hoá chồi nách, tạo chồi bất định và tạo
phôi vô tính.

Vấn đề là phải xác định đợc môi trờng và điều
kiện ngoaị cảnh thích hợp để có hiệu quả là
cao nhất.

trờng nhân nhanh sang môi trờng tạo rễ. Môi
trờng tạo rễ thờng đợc bổ sung một lợng nhỏ
auxin. Một số chồi có thể phát sinh rễ ngay sau khi
chuyển từ môi trờng nhân nhanh giàu xytokinin sang
môi trờng không chứa chất điều tiết sinh trởng.

Đối với các phôi vô tính thờng chỉ cần gieo chúng
trên môi trờng không có chất điều tiết sinh trởng
hoặc môi trờng có chứa nồng độ thấp của xytokinin
để phôi phát triển thành cây hoàn chỉnh
6
B
B
ớ
ớ
c
c
4:
4:
thích
thích
ứ
ứ
ng
ng
c
c
â
â
y in vitro

Để đa cây từ ống nghiệm ra vờn ơm với tỷ lệ sống cao, cây
sinh trởng tốt cần đảm bảo một số yêu cầu:

Cây trong ống nghiệm đ đạt những tiêu chuẩn hình thái nhất
định (số lá, số rễ, chiều cao cây).

Có giá thể tiếp nhận cây invitro thích hợp: giá thể sạch, tơi
xốp, thoát nớc.

Phải chủ động điều chỉnh đợc ẩm độ, sự chiếu sáng của vờn
ơm cũng nh có chế độ dinh dỡng phù hợp.
C
C
á
á
c
c
ph
ph
ơ
ơ
ng
ng
th
th
ứ
ứ
c
c
nh

giống
Cây con
Nuôi cấy chồi đỉnh
Nuôi cấy đoạn thân
Tạo chồi
trực tiếp
Tạo phôi
trực tiếp
Cây từ phôi
Tạo chồi
gián tiếp
Tạo phôi
gián tiếp
Cây con
Phát sinh hình
thái trực tiếp
Phát sinh hình
thái gián tiếp
Mẫu cấy
Mẫu cấy
Callus
Phôi vô tính
Chồi bất định
Huyền phù
tế bào
Callus
7
Ho
Ho
ạ

o ch
o ch
ồ
ồ
i bất
i bất
đ
đ
ịnh
ịnh

Trong trờng hợp này cần phải thực hiện quá trình
phản phân hoá và tái phân hoá tế bào để bắt các tế bào
soma hình thành chồi trực tiếp hoặc gián tiếp thông qua
giai đoạn phát triển mô seo.

ở các đối tợng một lá mầm nh lan, dứa, chuối, hoa
loa kèn thờng gặp sự phát triển cây qua giai đoạn
dẻ hành (protocorm): cùng một lúc mẫu cấy tạo thành
hàng loạt protocorm, các thể này hoặc tiếp tục sản sinh
protocorm mới hoặc phát triển thành cây.
9
T
T
ạ
ạ
o ph
o ph
ô
ô

tính
Sự hình thành phôi có 2 bớc:

Sự phân hoá các tế bào có khả năng phát sinh phôi:
cần môi trờng giàu auxin. Các tế bào có khả năng
phát sinh phôi là các tế bào nhỏ, nhân lớn, nhiều
hạch nhân, không có không bào, tế bào chất đậm
đặc, giàu protein và ARN thông tin.

Sự phát triển của những tế bào phôi mới hình
thành: cần môi trờng nghèo hoặc không có auxin.
Nồng độ cao của auxin kích thích sự hình thành
phôi vô tính nhng ức chế quá trình phân hoá và
phát triển tiếp theo của các phôi này.
10
C
B
A
H×nh 28. Sù h×nh thµnh ph«i v« tÝnh cña c©y c¶i dÇu.
A: giai ®o¹n sím (7-10 ngµy); B: giai ®o¹n gi÷a (10-14 ngµy); C: giai ®o¹n cuèi
11
Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính
Khái niệm

Có thể sử dụng các polyme sinh
học để bao gói 1 phôi vô tính với
một thể tích nhất định môi
trờng dinh dỡng để tạo hạt
nhân tạo


và nhất là thỏa mn yêu cầu vô trùng.
Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

Các bớc tạo hạt nhân tạo

Tạo huyền phù phôi vô tính trong môi trờng dinh dỡng
với mật độ phù hợp và bổ sung Na-alginate đợc làm tan
trong nớc với nồng độ 2-4%

Dùng pipet (máy nhỏ giọt) nhỏ 100-150àl huyền phù
nêu trên có chứa 1 phôi soma vào dung dịch CaCl2 (2-
2,5%). Khi đó sẽ sinh ra phản ứng trao đổi ion Na-Ca và
hạt nhân tạo đợchình thành, có đủ độ cứng thích hợp.
Sau đó chuyển qua ngâm trong nớc làm cứng hạt
13
Sản xuất hạt nhân tạo từ phôi vô tính

Dùng Ca-alginate thờng hạt luôn luôn ẩm ớt bề
mặt, hiện nay ngời ta dùng một loại polymer
Elvax 4260 để bao lớp alginate.

Giai đoạn kế tiếp là làm khô hạt để giúp hạt nhân
tạo dễ dàng bảo quản và nẩy mầm khi cần thiết.
Kitto & Janick, đặt hạt cây cà rốt trên khay có
chứa 25% polyoxyethylene để làm mất nớc, và
khi làm ớt lại thì hạt đợc tái sinh và phát triển
thành cây hoàn chỉnh.
Hạt nảy mầm in vitro Hạt tạo từ phôi vô tính Hạt tạo từ protocorm Hạt nảy mầm in vitro
Callus phôi
hoá

ủ
ủ
a nh
a nh
â
â
n gi
n gi
ố
ố
ng c
ng c
â
â
y tr
y tr
ồ
ồ
ng
ng
b
b
ằ
ằ
ng nu
ng nu
ô
ô
i cấy m
i cấy m

ồ
ồ
n t
n t
ạ
ạ
i c
i c
ủ
ủ
a nh
a nh
â
â
n gi
n gi
ố
ố
ng c
ng c
â
â
y tr
y tr
ồ
ồ
ng
ng
b
b

á
c t
c t
ồ
ồ
n t
n t
ạ
ạ
i c
i c
ủ
ủ
a nh
a nh
â
â
n gi
n gi
ố
ố
ng c
ng c
â
â
y tr
y tr
ồ
ồ
ng


Ngâm mẫu vào dung dịch ascorbic và xytric vài giờ trớc khi cấy.

Nuôi cấy mẫu trong môi trờng lỏng, O2 thấp, không có ánh sáng (1 - 2 tuần).

Cấy chuyển mẫu liên tục(1-2ngày/lần) sang môi trờng tơi trong 1 - 2 tuần
Sự tiết độc tố từ mẫu cấy
18
C
C
á
á
c t
c t
ồ
ồ
n t
n t
ạ
ạ
i c
i c
ủ
ủ
a nh
a nh
â
â
n gi
n gi

trao đổi khí thấp. Đặc biệt thờng xảy ra khi nuôi cấy táo, mận, hoa cẩm
chớng, hoa đồng tiền và hoa cúc.

Cây bị thuỷ tinh hoá thờng có hàm lợng lớp sáp bảo vệ thấp, cấu tạo có nhiều
phân tử phân cực nên dễ hấp thụ nớc. Cây in vitro thờng có mật độ khí khổng
cao, khí khổng có dạng tròn chứ không elip, khí khổng mở liên tục trong quá
trình nuôi cấy.
Để tránh hiện tợng thuỷ tinh hoá có thể tiến hành một số giải
pháp:

Giảm sự hút nớc của cây bằng cách tăng nồng độ đờng hoặc các chất gây áp
suất thẩm thấu cao.

Giảm nồng độ các chất chứa nitơ trong môi trờng.

Giảm sự sản sinh ethylen trong bình nuôi cấy.

Sử lý axit absixic hoặc một số chất ức chế sinh trởng.
Những công nghệ mới trong vi
nhân giống cây trồng
1.Công nghệ vi nhân giống quang tự dỡng

Là bớc phát triển của công nghệ nuôi cấy mô tế bào do giáo s
T. Koyoki Kozai đề xuất và nghiên cứu từ hơn 2 thập kỷ qua.

Công trình nghiên cứu tập trung vào vấn đề nhân giống cây nuôi
cấy mô trên môi trờng không có đờng nhng đợc điền khiển
chủ động chế độ ánh sáng và cung cấp CO2.

Công nghệ này đ đợc thử nghiệm thành công trên nhiều đối


Chi phí cao cho việc điều khiển môi trờng ( ánh sáng, nhiệt độ,
CO2, O2)

Cây vẫn sinh trởng trong điều kiện vô trùng vì vậy vẫn dẫn đến
chi phí cao cho hệ thống bình nuôi chuyên dụng và chuẩn bị giá
thể.
Hộp nuôi cây sử dụng trong hệ
thống quang tự dỡng.
Dài x Rộng x Cao = 610 x 31 x
105 mm, thể tích 20 lít
( Zobayed et al., 2000).
20
21
Những công nghệ mới trong vi
nhân giống cây trồng
(tiếp)
2.Bioreactor

Sự phát triển công nghệ Bioreactor trong vi nhân giống cây
trồng

Takayama và Miasawa là những ngời đầu tiên nghiên cứu sử dụng biorector
vào nhân giống cây trồng: nhân củ siêu nhỏ khoai tây, củ giống hoa ly
(Takayama và Akita, 1988), hoa lan hồ điệp (Yong et, al, 2000; Datta et al,
1999), cỏ ngọt với công suất 20000 chồi/ bình biorector 500lít (Takayama và
Akita, 1994),

Công nghệ này cho phép nhân nhanh vô hạn các giống cây trồng nhờ thiết bị
bioreactor hoàn toàn tự động hóa. Ví dụ: một bioreactor vibro - mixer ( rung

(tiếp)
Cách nhân giống bằng bioreactor

Bioreactor có thể đợc ứng dụng để vi nhân
giống thực vật trên quy mô thơng mại theo 3
hớng :

(1) Tạo chồi (chuối, dứa, hoa lan)

(2) Tạo củ in vitro (Khoai tây, lily)

(3) Tạo phôi soma(cà phê, cao su,
24
25