ĐẠI HỌC THÁI
NGUY
Ê
N
TRƢỜNG
ĐẠI HỌC
SƢ
P
HẠM
TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE
SINH TỔNG HỢP
EN
DO-
β
-1,4-
G
LU
C
A
N
A
SE
VÀ XÁC
Đ
Ị
N
H
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA
N
Ó
L
β
-1,4-
G
LU
C
A
N
A
SE
VÀ XÁC
Đ
Ị
N
H
TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA
N
Ó
Chuyên ngành:
Sinh
học thực nghiệ
m
L
UẬ
N
VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH
HỌ
C
Thực
hiện
tại: Viện
1.2. NGUỒN GỐC VÀ PHÂN
L
O
Ạ
I2
1.2.1.
Nguồn
g
ốc
2
1.2.2. Phân
loại enzyme
3
1.3. CẤU
TRÚC 5
1.3.1.
Cấu trúc bậc
nhất
5
1.3.2.
Cấu trúc không gian
6
1.4. CƠ CHẾ XÚC TÁC
8
1.5. Khái
quát
13
1.6.4.
Trong
công nghiệp sản xuất dung
m
ô
i
hữu cơ
14
1.6.5.
Trong
công nghệ
sử lý
rác
t
h
ả
i
và
sản xuất phân bón
vi
sinh
14
1.7. ẢNH
HƢỞNG
CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ
N
hƣởng của
pH
m
ô
i
t
r
ƣ
ờ
ng
18
1.8. TÍNH CHẤT
LÝ
HÓA CỦA
ENZYME
19
1.8.1. Ảnh
hƣởng của nhiệt độ
19
1.8.2. Ảnh
hƣởng của pH
20
1.8.3. Ảnh
hƣởng của các
i
o
n
kim
Chủng
gi
ố
ng22
2.1.2.
Thiết
bị
22
2.1.3.
Hóa
c
h
ấ
t22
2.1.4.
Dung
d
ị
c
h
và
đệm phá tế bào
23
m
ô
i
t
r
ƣ
ờ
ng
l
ê
n
khả năng
sinh
tổng hợp
endo-β-1,4-glucanase
27
2.2.5.
Tinh sạch sơ
bộ
endo-β-1,4-glucanase
29
2.2.6.
Điện
di
S
LUẬN
36
3.1. Sàng lọc chủng nấm mốc có khả năng sinh
tổng
hợp
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase cao
36
3.2.
Phân
loại
chủng nấm
sợi A. oryzae
VTCC-F-045
dựa vào đoạn gene
28S
rRNA
37
3.3. Tối
ƣu các
đ
i
ề
bo
n43
3.3.5. Ảnh
hƣởng của nguồn nitrogen
44
3.3.6. Ảnh
hƣởng của nồng độ nitrogen
45
3.3.7.
Nh
i
ệ
t
độ
nu
ô
i
cấy
46
3.3.8. Ảnh
hƣởng của
pH
-1,4-glucanase50
3.5.1.
Nh
i
ệ
t
độ phản ứng
tố
i
ƣ
u50
3.5.2.
pH phản ứng
t
ố
i
ƣ
u
51
3.5.3. Độ
57
KẾT
LUẬN
VÀ KIẾN NGHỊ
59
KẾT
L
U
Ậ
N
59
KIẾN NGHỊ
59
TÀI
LIỆU
THAM KHẢO
61
TIẾNG
VIỆT
61
TIẾNG
A
N
H
A.
oryzae
37
Bảng 3.3.
Ảnh
hƣởng của nguồn carbon đến
khả
năng sinh tổng hợp
e
n
do
-
β
-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 42
Bảng
3.2. Tóm
tắt
quá trình
tinh
sạch
endo-β-1,4-glucanase
từ
chủng A.
oryzae
VTCC-F-045 49
Bảng 3.4.
đoạn gene
28S rRNA từ
chủng
A.
oryzae
VTCC-F-045
69
Bảng 4.3.
Khả
năng sinh endo-β-1,4-glucanase theo
t
h
ờ
i
gi
a
n
70
Bảng
4.4. Ảnh
hƣởng
của
nồng
độ CMC tới khả năng sinh
e
n
do
năng
sinh
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 71
Bảng
4.7. Ảnh
hƣởng
của
nguồn nitrogen
tới khả năng sinh
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045 72
Bảng 4.8.
Ảnh
hƣởng
của
Bảng
4.10. Ảnh
hƣởng
của pH nuôi cấy tới khả năng sinh endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
73
Bảng
4.11. Ảnh
hƣởng
của
nhiệt
độ phản ứng tới
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
73
Bảng 4.12.
Ảnh
hƣởng
của pH
phản ứng
tới
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase
của chủng
4.16. Ảnh
hƣởng
của dung môi hữu cơ tới
hoạt tính
e
n
do
-
β
-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
77
Bảng 4.17.
Ảnh
hƣởng
của ion kim loại
t
ớ
i
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase
của chủng
A. oryzae VTCC-F-045
78
DANH MỤC CÁC
cellulase
9
Hình 1.4. Sự
thủy phân của
3
loại enzyme
trong phức hệ
c
e
ll
ul
a
s
e10
Hình 1.5.
Cấu trúc bộ gene của
A. oryzae
11
Hình 2.1.
Đƣờng chuẩn
glu
c
os
e
tổ hợp bằng
XhoI và
XbaI (C).
38
Hình 3.3. Cây
phân
loại
chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
39
Hình 3.4. Khả
năng
sinh
endo-β-1,4-glucanase theo
t
h
ờ
i
gian
của
chủng
A.
oryzae
VTCC-F-045
40
Hình 3.5. Ảnh
hƣởng của nồng độ
β-1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-04544
Hình 3.7. Ảnh
hƣởng của nguồn nitrogen đến khả năng sinh tổng hợp
e
n
do
-
β
-
1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
45
Hình 3.8. Ảnh
hƣởng của nồng độ bột đậu tƣơng đến
khả
năng sinh tổng
hợp
endo-β-1,4-glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-04546
Hình 3.9. Ảnh
VTCC-F-045
48
Hình 3.11. Sắc kí
đồ trên cột Sephadex
G100 (A)
Điện
di
đồ
SDS-PAGE
của
chủng
A. oryzae VTCC-F-045
(B)
49
Hình 3.12. Ảnh
hƣởng
của
nhiệt
độ phản ứng lên
hoạt tính
endo-β-1,4-
glucanase của chủng
A. oryzae
VTCC-F-045
51
Hình 3.13. Ảnh
hƣởng của
pH
phản ứng
l
n
độ bền endo-β-1,4-glucanase của chủng
A.
oryzae
VTCC-F-045
54
Hình 3.16. Ảnh
hƣởng của dung
m
ô
i
hữu
cơ
l
ê
n
độ bền
endo-β-1,4-
glucanase
của chủng
A. oryzae VTCC-F-045
55
Hình 3.17. Ảnh
hƣởng của chất
tẩy rửa lên
độ bền endo-β-1,4-glucanase
MW Molecular Weight
OD Optical density
PCR Polymerase chain reaction
SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
TEMED N,
N’
,
N,
N
’
-
Tetramethyl ethylene diamine
Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane
U Unit
v/v Volume/volume
w/v Weight/volume
MỞ
ĐẦU
Endo-β-1,4-glucanase là
một
trong ba
dạng
của cellulase. Chúng thuộc
nhóm enzyme thủy phân, có khả năng phân cắt liên
kết
β-1,4-glucosidie
m
ột
cách
ngẫu
lúa mì,
mạch
đen) và vi sinh
vật.
Tuy
nhiên,
nguồn
thu enzyme chủ
yếu vẫn
từ vi sinh
vật.
Vi sinh
vật
sinh enzyme
hết
sức đa
dạng nhƣ nấm
sợi (Aspergillus niger, A. oryzae, A. aculeatus,
Trichoderma viride) và vi
khuẩn (thuộc họ
Bacillus).
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc
ứng
dụng
rộng rãi vào nhiều
ngành
khác
nhau
nhƣ công nghiệp sản xuất
ô
i
hữu
c
ơ
;
hay công nghiệp
xử lý
rác
t
h
ả
i
và
sản xuất phân bón
vi
sinh.
Với tiềm năng ứng dụng to lớn của endo-β-1,4-glucanase và nguồn vi
sinh
vật tổng hợp enzyme rất đa
dạ
ng
,
đồng
thời
nhằm tận dụng
các phế phụ
hóa lý của endo-β-1,4-
glucanase.
Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái
t
nu . e
du . v
n
1
CHƢƠNG
I. TỔNG QUAN TÀI
L
I
Ệ
U
1.1. ĐỊNH
NGHĨA
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase là
một
trong ba dạng cellulase.
Chúng
thuộc
nhóm enzyme thủy phân liên
kết
β-1,4-glucoside bên trong phân
tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide và
một
số cơ
sợi, nấm men, xạ
khuẩn
và vi
khuẩn).
Tuy nhiên, vi sinh
vật
là
nguồn
thu enzyme chủ
yếu
vì thời gian
sống ngắn
nên thu
đ
ƣ
ợ
c
nhiều lần
trong năm
và chủ động sử
dụng
nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi
cũng
nh
ƣ
dễ dàng
điều
khiển có
định
mới mang
những đặc điểm
nổi
bật
mà các
đối
t
ƣ
ợ
ng
động vật,
thực
vật
ít áp
dụng
nh
ƣ
gây
đột biến
nhân tạo.
Trong vi sinh vật, rất
nhiều chủng
vi khuẩn, xạ khuẩn,
nấm
mốc và
m
ột
số
loài
khuẩn
thuộc chi Actinomyces griseus
(Nguyễn
Đức
L
ƣ
ợ
ng
and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999,
L
ê
Thị Thanh Xuân et al., 2005) và
Streptomyces reticuli
cũng
có khả năng
tổng hợp mạnh
enzyme.
Các loại
nấm mốc thuộc
chi Aspergillus
nhƣ
A.niger (Coral et al., 2002,
Hoàng
Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A. candidus
(Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A. flavus (Ojumu et al., 2003),
A. fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A. oryzae và các chủng
Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al.,
1992, Cao
C
ƣ
cao.
1.2.2.
Phân loại
e
n
z
ym
e
1.2.2.1.
Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc
t
ế
Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) là
một trong
ba
dạng enzyme
của hệ cellulase,
thuộc nhóm
enzyme
thủy phân
liên
kết
β-1,4-
glucoside bên trong phân
tử cellulose,
o
li
go
s
a
cellulosedextrin,
c
e
ll
o
bi
o
s
e
và
g
l
u
c
o
s
e
(Chellapandi et al., 2008).
Dựa trên đặc
tính
cấu
trúc,
endo-β-1,4-glucanase
đƣợc
gọi là
endoglucanase
hoặc 1,4-β-D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC
3.2.1.4).
Endo-β-1,4-glucanase thuộc
vào
nhƣ
khối
lƣợng phân
tử, điểm
đẳng
đ
i
ệ
n
và
cấu trúc tinh
t
h
ể
.
Dựa
theo
đặc
tính
và
trình tự amino
acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm
enzyme thủy phân cellulose
đƣợc
chia làm 3
nhóm
là Cel-1, Cel-2 và Cel-3.
Trong đó
Cel-1 và Cel-3 là endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối
lƣ
cứu trên A. niger về hai gene mã hóa cellobiohydrolase
(CbhA và CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho
thấy,
cả hai
enzyme
này
đều
thuộc nhóm
7 của glycosyl
hy
dr
o
l
a
s
e
(GH7);
trong
đó CbhB
bao gồm
cấu trúc
cellulose-bindingomin
(CBD) với sự xúc tác riêng bởi các
amino
acid
giàu
liên
kết peptide;
còn CbhA chỉ
s
e
nhóm
5
(
G
H
5)
,
cel5B có
cấu trúc rất giống
cel5A,
nhƣng thiếu
CBD1 và sự liên
kết.
C
e
l
5
A
gồm
4
đoạn
int
r
o
n
,
cel5B
xúc tác
phức
cellulase
đƣợc
chia ra làm 9 họ A, B, C, D, E, F, G, H và I (Gilkes
et al.,
1991). Hiện nay,
cellulase
đƣợc
xếp
thành
12 họ khác
nhau
là 5, 6, 7, 8, 9,
(10), 12, 44, 45, 48, 61 và 74.
Trong
đó, họ 9
chứa cellulases
của vi
khuẩn
(hiếu
khí và kỵ khí),
n
ấ
m
,
thực vật
và
động vật (protozoa
RÚ
C
Endo-β-1,4-glucanase
đƣợc tạo
ra
từ
các loài khác
nhau
có
thành
phần cấu tạo và cấu
trúc
khác
nh
a
u
.
E
ndo
-
β
-1,4-
glu
c
a
n
a
s
e
họ 5 (GH 5) chứa CBM ở
đầu
nitơ, có
trọng lƣợng phân
tử
khoảng
44 kDa và
đƣợc
gọ
i
là ThEG. ThEG
từ chủng
Trametes hirsuta là
một
chuỗi
polypeptide có chứa 384
amino
acid và có độ
tƣơng đồng
cao với En-1
từ
chủng
Irpex lacteus
(
73
%
)
;
EG từ
chủng
.
Protein
do
CelA mã
hóa gồm
239
amino
acid và
đƣợc
xếp vào họ
cellulase
H.
Gene
CelB chứa
1248 bp
không chứa đoạn
in
t
r
o
n
.
Protein
do CelB mã hóa
gồm
416
amino
acid và
này
thuộc
họ 12
(GH 12)
endoglucanase
là
một
c
huỗ
i
polypeptide gồm 224 amino
a
c
i
d
cấu
tạo
nên các
c
hu
ỗ
i
α, β và
các vùng
nối.
1.3.2.
Cấu
trúc không
mặt
lõm
của phiến
B
tạo nên khe
dà
i
35 Å
để
liên
kết
với cơ
c
h
ấ
t
,
khe này chạy
dọc
bề
mặt của
enzyme.
Trung
tâm hoạt động của enzyme
là
h
a
i
bởi các vùng nối, có 4 vùng nối với
các gốc
t
ừ
29-32, 40-47, 92-96 và
165-
169
;
các vùng này
n
ố
i
t
i
ếp
tƣơng ứng
với
c
hu
ỗ
i
β:
B2
đến
A2, A2
đến
A3, A5
Gốc
cysteine 175 nằm
ở
c
hu
ỗ
i
β A6
trên phiến nhỏ
A và
tạo
ra
mấu
lồi
ở
bề mặt của enzyme gần cấu trúc xoắn
α.
Chuỗi
bên
ở
trong
lõi
giữa
h
a
i
phiến β, liên
kết
với 6
amino
tác chặt chẽ
với
các
c
hu
ỗ
i
bên của
8
gốc
Q34, W52, W54, S63, P65, Y91,
A98 và
T
204
;
cùng với
sự tách
rời
giữa các nguyên tử trong chiều
dà
i
từ
3,3-
4,9 Å (Hình 1.2B).
Gốc
cysteine
216
nằm trên
ớ
i
đ
i
ể
m
hoạt
độ
ng
,
nơi
tƣơng tác
với
c
hu
ỗ
i
bên của
5
gốc
W48, V87,
W89, F214 và F219 có kích
t
h
ƣ
ớ
Cel12A
từ
H. Grisea
1.4.
CƠ CHẾ XÚC
T
ÁC
Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose
tạo ra các loại oligosaccharide có chiều dài khác
nh
a
u
.
Tuy nhiên, để
thủy phân cellulose thành glucose thì cần có sự hiệp đồng của các dạng
enzyme trong phức hệ cellulase. Mỗi dạng enzyme trong phức hệ cellulase
sẽ thủy phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo những cách khác nhau.
Ban
đ
ầ
u
,
endo-β-1,4-glucanase thủy phân
sơ
bộ
các liên
kết
1,4-β-
glucan
exo-β-1,4-
glu
c
oz
i
da
s
e
(cellobiase)
sẽ
tham
gia
thủy phân
cellulose
theo
cơ
chế ban
đầu
endo-β-1,4-glucanase
tác
động
vào
vùng
vô
định hình trên phân tử
cellulose và
tạo
ra các
đầu mạch tự do. Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase
n
,
c
e
ll
ob
i
os
e
và glucose. Các cellobiase
sẽ thủy phân
t
i
ếp
tạo thành glucose
(Hình 1.4).
Hình 1.4. Sự
thủy phân của
3
loại enzyme
trong phức hệ
cellulase
1.5. Khái
quát về
Aspergillus oryzae
A. oryzae
thuộc
chi Aspergillus, họ Trichocomaceae,
bộ
cti
na
s
e
,
xylanase
và
h
e
m
ice
ll
ulas
e
khi
sống trên
môi
t
r
ƣ
ờ
ng
có
nguồn
cơ
chất
t
ƣ
ơ
ng
r
ƣ
ợ
u
sakê và
trong công
nghiệp
sản xuất enzyme
nhƣ
amylase, protease, hemicellulose, cellulase,
oxidoreductase,
Copyright: Tài liệu đại học ©