BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y DƯỢC CẦN THƠ
TRẦN NGỌC TRINH
KHẢO SÁT TÁC DỤNG CỦA CAO LÁ CHANH DÂY TRÊN NHỮNG
THAY ĐỔI VỀ VẬN ĐỘNG CÓ LIÊN QUAN ĐẾN HỆ
DOPAMINERGIC TRÊN CHUỘT NHẮT TRẮNG ĐƯỢC GÂY ĐỘC
BẰNG THUỐC DIỆT CỎ PARAQUAT
LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ ĐẠI HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC
TS. DƯƠNG XUÂN CHỮ
Cần Thơ - 2011
i
LỜI CAM ĐOAN
  
Tôi xin cam đoan đây là công trình khảo sát và nghiên cứu của riêng tôi. Các kết
quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công
trình nào khác.
Tác giả
Trần Ngọc Trinh
ii
LỜI CẢM ƠN
  
Trước hết, em xin kính gửi lòng kính trọng và lời cảm ơn chân thành nhất đến
thầy TS. Dương Xuân Chữ, người thầy đã hết lòng hướng dẫn em trong suốt thời
gian thực hiện luận văn. Thầy đã dành nhiều thời gian và tâm huyết để truyền đạt
cho em những kiến thức quý báu, người đã tận tình chỉ dẫn và cho em những lời
khuyên hữu ích.
Em xin kính gửi lời cảm ơn đến thầy ThS. Phạm Thành Suôl và các cô ThS.BS.
Cao Thị Kim Hoàng, ThS.BS. Lê Kim Khánh, ThS. Nguyễn Thị Hạnh và quý thầy cô
trong bộ môn Dược lý – Dược lâm sàng, các thầy cô đã giúp đỡ và tạo điều kiện
thuận lợi cho em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.

Trang
Bảng 1.1. Vị trí phân loại của cây chanh dây Passiflora edulis Sim., 13
Bảng 2.1. Dịch chiết dùng để định tính các nhóm hợp chất 19
Bảng 3.1. Số lượng chuột chết từng ngày tương ứng với 3 liều paraquat 33
Bảng 3.2. Phần trăm chuột chết từng ngày tương ứng với 3 liều paraquat 33
Bảng 3.3. Số ô vuông chuột di chuyển trong open field test 35
Bảng 3.4. Thời gian chuột rơi xuống trong rope climming test 36
Bảng 3.5. Tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming test 37
Bảng 3.6. Tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test 38
Bảng 3.7. Số ô vuông chuột di chuyển trong open field test 40
Bảng 3.8. Thời gian chuột rơi xuống trong rope climming test 41
Bảng 3.9. Thời gian chuột bơi trong nghiệm pháp chuột bơi gắng sức 42
Bảng 3.10. Tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming test 43
Bảng 3.11. Tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test 44
Bảng 3.12. Tổng thời gian chuột bất động trong tail suspension test 45
DANH MỤC CÁC HÌNH
vi
Tra
ng
Hình 1.1. Hệ dopaminergic 3
Hình 1.2. Hệ serotonergic 4
Hình 1.3. Cấu tạo hóa học của paraquat 4
Hình 1.4. Cơ chế gây tổn thương thần kinh của paraquat qua trung gian gốc tự do
6
Hình 1.5. Sự hình thành gốc tự do 8
Hình 1.6. Nguyên nhân tạo nên stress oxy hóa 9
Hình 1.7. Quá trình peroxid hóa lipid 10
Hình 1.8. Quá trình oxy hóa protein 11
Hình 1.9. Sự tấn công DNA của gốc hydroxyl 12
Hình 1.10. Chanh dây 14

Hình 3.16. Biểu đồ biểu diễn thời gian chuột rơi xuống trong rope climbing test
41
Hình 3.17. Biểu đồ biểu diễn thời gian chuột bơi trong nghiệm pháp chuột bơi gắng
sức 42
Hình 3.18. Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong forced swimming
test 43
Hình 3.19. Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong beam walking test
44
Hình 3.20. Biểu đồ biểu diễn tổng thời gian chuột bất động trong tail suspension test
45
viii
ĐẶT VẤN ĐỀ
  
Nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam là một trong những nước có nền
nông nghiệp phát triển. Cùng với sự phát triển của khoa học trong lĩnh vực thuốc
bảo vệ thực vật, người dân quen dần với phương thức sử dụng thuốc diệt cỏ trong
sản xuất. Như hai mặt của một vấn đề, sử dụng thuốc diệt cỏ cũng có những mặt
hạn chế của nó. Ngộ độc thuốc diệt cỏ, cũng như thuốc trừ sâu đang là vấn đề đáng
được quan tâm hiện nay. Do có nhiều ưu điểm nổi bật nên paraquat thường được ưu
tiên lựa chọn, và nhiều trường hợp ngộ độc do paraquat đã được báo cáo. Ở nồng độ
cao, paraquat xâm nhập vào cơ thể thường gây độc tính cấp trên các cơ quan với các
triệu chứng xảy ra nhanh chóng gây tổn thương phổi, gan, thận và dẫn đến tử vong
trong thời gian ngắn. Bên cạnh đó, sự tiếp xúc lâu ngày với paraquat thường gây tổn
thương trên hệ thần kinh trung ương. Có nhiều nghiên cứu cho thấy, khi tiếp xúc
với paraquat có thể gây mất mát chọn lọc các tế bào thần kinh dopaminergic giữa
vùng chất đen (substantial nigra) và vùng thể vân (striatum), sự tổn thương này dẫn
đến các biểu hiện bất thường về vận động tương tự như trong bệnh Parkinson [20].
Đã có nhiều giả thuyết được đề nghị để giải thích cho độc tính thần kinh của
paraquat. Một trong những nguyên nhân là do sự bùng nổ của các gốc tự do, dẫn
đến tình trạng stress oxy hóa (oxidative stress), sau hàng loạt các phản ứng đưa đến

- Đánh giá khả năng chống oxy hóa của cao toàn phần từ lá chanh dây trên mô hình
đã xây dựng
2
Chương 1 - TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về hệ dopaminergic và hệ serotonergic
1.1.1. Hệ dopaminergic
Có 3 hệ thống dopaminergic chính:
- Hệ thống nhân đen thể vân (nigrostriatal
trart): chạy từ các tế bào ở nhân đen
(substantial nigra) để tới thể vân (striatum)
kiểm soát về hành động, khi các receptor
dopamin của hệ thống này bị khoá sẽ gây
ra các tổn thương về vận động. Trong
bệnh parkinson hệ nhân đen thể vân bị
thoái hoá gây ra các triệu chứng bất
thường về vận động.
- Hệ thống trung não hồi viền (mesolimbic), trung não vỏ não (mesocortical): chạy
từ các thân tế bào ở vùng trần trung não (ventoal tegmentalarca - VTA) nằm sát
ngay gần nhân đen, để tới gần hết các vùng vỏ não thuỳ trái và hệ viền.
- Hệ thống u - phễu (tuberoin fundibular trart): thân tế bào nằm ở vùng các hạt nhân
(arcuate nucleus) và khu vực xung quanh não thất ở dưới đồi, chạy đến vùng phễu
và thuỳ trước tuyến yên. Các chất bài tiết ở đây điều hòa bài tiết nhiều hormon của
tuyến yên [2].
1.1.2. Hệ serotonergic
Hệ thống serotonergic trung ương có vị trí chủ yếu của các tế bào serotonergic là ở
phía trên cầu não và não giữa, đặc biệt tập trung ở nhân Raphe. Các neuron này
chạy đến vỏ não, tiểu não, hệ viền, vùng dưới đồi, vùng hải mã và tủy sống.
Chức năng của hệ serotonergic là kiểm soát tính khí, tâm trạng và xúc cảm, có vai
trò trong khả năng ghi nhớ, liên quan đến trạng thái thức ngủ, kiểm soát đường cảm
giác kể cả nhận cảm đau, kiểm soát thân nhiệt [2].

nuốt phải, độc tính phụ thuộc vào nồng độ của paraquat trong máu biểu hiện như
đau bụng, viêm thực quản, nuốt khó, nôn, tiêu chảy. Sau một thời gian gây hoại tử
tế bào gan, làm tăng men gan, gây tổn thương đến hệ thống ống lượn và cầu thận
dẫn đến thiểu niệu, vô niệu. Sau cùng dẫn đến suy đa cơ quan, suy tuần hoàn cấp và
tử vong nếu không chữa trị kịp thời.
Tiếp xúc qua da gây kích ứng, viêm, phồng rộp da, tiếp xúc ở móng có thể gây đốm
trắng, nứt, hoặc mất móng, gây viêm loét biểu mô giác mạc và kết mạc khi tiếp xúc
ở mắt. Da là một lớp bảo vệ cơ thể tránh sự xâm nhập của PQ, khi da bị tổn thương
biểu hiện ngộ độc giống trường hợp nuốt phải qua đường tiêu hóa.
Độc tính cao khi hít phải gây chảy máu mũi, kích thích hô hấp, đau họng, phù phổi
cấp và có thể gây tử vong.
1.2.3.2. Độc tính trên thần kinh
Những nghiên cứu về độc tính của PQ cho thấy khi tiếp xúc với liều cao PQ gây
độc tính chủ yếu trên phổi, thường dẫn đến tử vong sớm. Với liều độc mãn ảnh
hưởng chủ yếu trên thần kinh, gây thoái hóa hệ dopaminergic giữa vùng chất đen
(substantial nigra) và thể vân (striatum), hai vùng não quan trọng trong việc duy trì
bình thường chức năng vận động [23]. Nhiều nghiên cứu cho thấy mối quan hệ giữa
bệnh Parkinson và sự thoái hóa hệ dopaminergic [30]. Bệnh Parkinson thường được
5
biểu hiện thông qua các triệu chứng như run khi nghỉ ở 1 hoặc 2 bên cơ thể, cứng
cơ, vận động chậm, giảm chức năng vận động và suy giảm phản xạ tư thế. Do khả
năng gây độc tế bào thần kinh của PQ nên có nhiều nghiên cứu cho rằng PQ có thể
là một trong những yếu tố liên quan đến quá trình phát sinh bệnh Parkinson [34].
Khả năng gây độc tế bào của PQ được giải thích là do sự bùng nổ của các GTD đưa
đến quá trình stress oxy hóa. PQ tham gia vào chu trình oxy hóa khử tạo ra các gốc
tự do (GTD) làm tổn hại đến protein, lipid, DNA (deoxyribonucleic acid). Cơ chế
được đề nghị là PQ ở dạng oxy hóa (PQ
++
) sẽ bị khử bởi các enzym reductase của tế
bào, chủ yếu là bởi NADPHcytochrome P-450 reductase, NADPH-cytochrome c

chuột thử nghiệm sự tích tụ và tổn hại của PQ trên hệ thần kinh trung ương (central
nervous system (CNS)) có thể ngăn chặn được khi sử dụng các amino acid như: L-
valin, L-phenylalanin, hoặc levodopa trước khi cho chuột tiếp xúc với PQ. Điều này
được lý giải là do các amino acid cạnh tranh với PQ trên hệ thống vận chuyển để
vào trong CNS. Một chế độ ăn hợp lý được bổ sung đầy đủ các amino acid hoặc trị
liệu bằng levodopa có thể điều chỉnh tổn hại của PQ thông qua cơ chế cạnh tranh
vận chuyển vào trong CNS. Khi vào trong CNS, PQ được chuyển hóa qua chu trình
oxy hóa khử hình thành các GTD, gây tổn hại và làm chết tế bào.
Một vài nghiên cứu được tiến hành nhằm giải thích cho sự vào được các tế bào thể
vân của PQ. Nhiều giả thuyết cho rằng, tương tự như hệ thống vận chuyển ở phổi,
PQ có thể được vận chuyển vào các tế bào thể vân là nhờ chất vận chuyển dopamin
(dopamin transporter), vì nhận thấy sự phá hủy các tế bào dopamin thần kinh cũng
như sự tổn hại vùng thể vân có thể được ngăn chặn bởi GBR-12909, là một chất ức
chế chọn lọc chất vận chuyển dopamin. Tuy nhiên vấn đề này vẫn còn gây nhiều
tranh cải [34].
1.3. Gốc tự do và stress oxy hóa
1.3.1. Gốc tự do
Gốc tự do (GTD) có thể được định nghĩa là những phân tử hay những mảnh phân tử
chứa một hoặc nhiều electron độc thân trong các orbital nguyên tử hoặc phân tử.
Các electron độc thân này thường làm cho các GTD có một mức độ phản ứng đáng
kể [1]. Thường được chia thành 2 nhóm:
7
• GTD vô cơ: gốc hydroxyl (
•
OH), gốc hydroperoxyl (HO
2
•
), gốc superoxid
(O
2

của sắc tố tế bào
gan. Nguồn ngoại sinh bao gồm tiếp xúc với khói thuốc lá, chất ô nhiễm môi trường
chẳng hạn như khí thải từ xe máy và các nhà máy công nghiệp, uống rượu, amiăng,
tiếp xúc với phóng xạ ion hóa, nhiễm vi khuẩn, nấm, hoặc virus.
8
Hình 1.5. Sự hình thành gốc tự do
Hình 1.6. Nguyên nhân tạo nên stress oxy hóa
1.3.2. Stress oxy hóa
Stress oxy hóa là trạng thái bùng nổ của các GTD, xảy ra khi có sự sản sinh quá
mức các GTD hoặc do sự suy giảm của các chất chống oxy hóa trong hệ thống sinh
học. Nói cách khác, stress oxy hóa là kết quả của các phản ứng chuyển hóa sử dụng
oxy, nó mô tả trạng thái xáo trộn cân bằng oxy hóa trong cơ thể sống. Sự dư thừa
các GTD có thể dẫn đến sự phá hủy các lipid, protein, hoặc DNA của tế bào, ức chế
chức năng bình thường của chúng. Do đó, stress oxy hóa liên quan đến một số bệnh
ở người cũng như quá trình lão hóa. Sự cân bằng giữa tác dụng có lợi và có hại của
các GTD ảnh hưởng quan trọng đến cơ thể sống, sự cân bằng này có được thông
qua cơ chế điều hòa oxy hóa khử “redox regulation”. Cơ chế này bảo vệ cơ thể khỏi
các stress oxy hóa và duy trì sự ổn định nội mô oxy hóa khử “redox homeostasis”
thông qua sự kiểm soát trạng thái oxy hóa khử “redox status” trong cơ thể [27].
9
Hình 1.7. Quá trình peroxid hóa lipid
1.3.3. Tổn thương do gốc tự do
1.3.3.1. Tổn thương trên lipid
Quá trình oxy hóa các phân tử lipid hay còn được gọi là “sự peroxid hóa lipid” là
quá trình xảy ra dưới tác dụng gây hại của các GTD trên phân tử lipid, được xem
như một sự chỉ điểm cho stress oxy hóa trong tế bào và mô. Các lipid peroxid
thường không bền, bị phân hủy cho ra một loạt các hợp chất phức tạp, các peroxid
của acid béo không no sẽ tạo ra các phân tử malondialdehyd (MDA) và 4-
hydroxyalkenal (4-HDA).
Sự có mặt của các phân tử này được xem như sự biểu thị cho quá trình peroxid hóa

Sự tổn hại DNA gây ra bởi các GTD dẫn đến sự xuất hiện của nhiều mô ung thư
khác nhau. Cho đến nay đã có hơn 100 sản phẩm từ quá trình oxy hóa DNA đã
được xác định, đặc trưng là 8-OH-G. Sự phá hủy bao gồm sự sửa đổi các base
purin, pyrimidin, hoặc đường deoxyribose, tạo liên kết chéo DNA, phá vỡ cấu trúc
DNA. Kết quả gây ra sự ức chế hoặc cảm ứng sao mã, truyền đạt tín hiệu di truyền,
lỗi trong sao mã, bất ổn cấu trúc gen, tất cả điều có liên quan đến căn bệnh ung thư
[27].
1.4. Chất chống oxy hóa
1.4.1. Đại cương về chất chống oxy hóa [1]
Chất chống oxy hóa là những chất khi hiện diện với một lượng nhỏ có thể ngăn
chặn hoặc làm giảm đi quá trình oxy hóa các phân tử sinh học, là nhóm của các
vitamin, chất vô cơ, enzym, và những chất có nguồn gốc tự nhiên giúp bảo vệ tế bào
khỏi sự tổn hại do GTD gây ra. Các chất chống oxy hóa có thể bao gồm:
- Các enzym chống oxy hóa: superoxid dismutase (SOD), catalase (CAT),
glutathion peroxidase (GPx), thioredoxin reductase, glutathion reductase,
peroxiredoxin.
- Các chất chống oxy hóa có nhóm thiol như glutathion, thioredoxin, lipoic acid.
12
- Các vitamin chống oxy hóa như vitamin C, vitamin E
- Các nguyên tố vi lượng như selenium, đồng, kẽm, mangan.
- Carotenoid như beta caroten, lycopen, lutein, isozeaxanthin, canthaxanthin,
astaxanthin.
- Các phenol và polyphenol như các phenol đơn giản, các flavonoid, tanin, và các
polyphenol khác.
- Các chất tạo phức với ion kim loại như acid citric, EDTA (ethylen diamin tetra
acetat) protein, amino acid, peptid.
Các chất chống oxy hóa có tác dụng ngăn chặn các phản ứng gây độc cho cơ thể,
làm mất tác dụng của các GTD, tạo thành các sản phẩm bất hoạt, quá trình thường
diễn ra qua một loạt các phản ứng. Các chất chống oxy hóa cộng tác với nhau để
loại trừ GTD. Mỗi chất chống oxy hóa có tác dụng riêng với từng loại gốc tự do ở

[36].
• Flavonoid: là nhóm hợp chất đã được tìm thấy trong lá và thân chanh dây, có
nhiều flavonoid đã được xác định bằng phương pháp phân tích HPLC-PDA như
vitexin, isovitexin, orientin và isoorientin.
14
vitexin
orientin
Hình 1.11. Cấu trúc các flavonoid trong chanh dây
Hình 1.10. Chanh dây
• Alkaloid: cũng là nhóm hợp chất được tìm thấy trong lá chanh dây, các alkaloid
đã được xác định như: harman, harmin, harmalol, và harmalin.
Ngoài ra có có các thành phần khác như: các polyphenol, saponin, cycloartan
triterpen, carbohydrat, amino acid, chất khoáng, các acid hữu cơ.
1.4.2.5. Tác dụng và công dụng
Trong lá chanh dây giàu các polyphenol, chủ yếu là flavonoid được xem là nhóm
chất có tác dụng như một chất chống oxy hóa tự nhiên. Khả năng chống oxy hóa
của cao chiết alcol từ lá được thử nghiệm in-vitro và ex-vivo. Trong thử nghiệm ex-
vivo, cao chiết từ lá của cây chanh dây có khả năng làm giảm số lượng tế bào chết
đi do sắt. Ngoài ra cao chiết còn cho hiệu quả chống lại sự phá hủy protein do sắt và
glucose. Đặc tính chống oxy hóa của cao chiết từ lá của cây chanh dây được giải
thích là khả năng bất hoạt các gốc tự do như 2,2-Diphenyl-1-Picrylhydrazyl
(DPPH), superoxid, hydroxyl, hypochlorous acid (HOCl). Hoạt tính chống oxy hóa
15
Hình 1.12. Cấu trúc các alkaloid trong chanh dây
R = H = Harman
R = OCH
3
= Harmin
R = OH = Harmalol
R = OCH

trưởng thành (4-5 tuần tuổi), do viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh cung cấp.
Trước khi tiến hành thí nghiệm chuột được ổn định ở điều kiện tiến hành thí nghiệm
trong thời gian khoảng 1 tuần. Chuột được cung cấp đủ nước và thức ăn theo tiêu
chuẩn của viện Pasteur cung cấp.
2.1.2. Dược liệu thí nghiệm
Lá từ cây chanh dây (Passiflora edulis Sims.) được thu hái ở thôn 3, xã Đắk Nia, thị
xã Gia Nghĩa, tỉnh Đắk Nông, vào tháng 1 năm 2010.
Cây được định danh bởi bộ môn Dược liệu, trường Đại Học Y Dược Cần Thơ.
2.1.3. Hóa chất thí nghiệm
Dung môi: cồn 96
o
, chloroform, ether ethylic, methanol, anhydrid acetic, …đều
dùng loại do Trung Quốc sản xuất do cửa hàng hóa chất Thành Mỹ, số 2D, Mậu
Thân, Ninh Kiều, Thành Phố Cần Thơ cung cấp.
Các hóa chất khác: acid hydrochloric, acid sulfuric, NaOH 5%, NaOH 10%, các
thuốc thử (Valse - Mayer, Bertrand, Bouchardat, Dragendroff, KOH 5%/cồn, FeCl
3

gelatin muối, m-dinitrobenzen 1%/cồn, xanthydrol…), magnesi kim loại do bộ môn
Dược liệu, khoa Dược, trường Đại Học Y Dược Cần Thơ pha chế và cung cấp.
Natri chloride 0,9 %.
Paraquat (Syngenta).
2.1.4. Dụng cụ thí nghiệm
Tủ sấy (Memmert), nồi cách thủy (Memmert).
Tủ Hot ESCO, Singapore.
Máy cô quay Buchi.
Cân kỹ thuật tự động ADAM d=0,1g, Cân phân tích OHAUS, USA, d=0,0001g.
Đèn UV 254/365 nm SPECTROLINE, USA.
Các mô hình thí nghiệm: open field test, beam walking test, forced swimming test,
tail suspension test, rope climbing test, nghiệm pháp chuột bơi gắng sức.